一种应用膜过滤降低金枪鱼鹅肌肽原料中嘌呤含量的方法及其应用与流程

本发明属于蛋白肽提取纯化技术领域，具体涉及一种应用膜过滤降低金枪鱼鹅肌肽原料中嘌呤含量的方法及其应用。

背景技术：

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

金枪鱼是一种生活在海洋中上层里的温血、高度跨洋性的洄游鱼类，常见的金枪鱼类包括长鳍金枪鱼、黄鳍金枪鱼、大眼金枪鱼、蓝鳍金枪鱼、青干金枪鱼和鲣等。主要分布在太平洋、大西洋和印度洋的热带、亚热带和温带水域。

鹅肌肽(β-丙氨酰-1-甲基-l-组氨酸，anserine)是一种存在于水产动物组织中的组氨酸游离二肽，分子式是c10h16n4o3，分子量是240.26，具有抗疲劳、降尿酸，抗衰老的功能，由于金枪鱼是一种高度洄游鱼类，鱼体肌肉发达，研究发现，金枪鱼鱼肉中高含量的鹅肌肽是金枪鱼在海中不知疲倦的高速游动的主要原因，为了取得身体所需的养分和生殖需要，大部分金枪鱼在辽阔的海域中游动，每年要徊游数千海里。因此被称为“高度徊游鱼类”。

高量的尿酸可引起人类痛风疾病的发生，导致关节疼痛，肌肉疲倦，局部肿胀，发炎等，病人苦不堪言，由于人体内嘌呤过高是导致人体尿酸过高，也是诱发痛风的主要原因，因此金枪鱼作为海洋里的大型鱼类，其自身存在的嘌呤含量也是研究关注的重点，有文献报道海水鱼类嘌呤含量很高，其中沙丁鱼和金枪鱼的嘌呤含量高达2401.5mg/kg和2262.4mg/kg。但是，金枪鱼肉中含有鹅肌肽，相关研究发现鹅肌肽因为是高度稳定的组氨酸和丙氨酸两种氨基酸组成的二肽成分，由于二肽能够显著治疗人体痛风，降尿酸等功能，因此，鹅肌肽对于改善人体痛风和治疗尿酸具有显著疗效，而且深海金枪鱼中鹅肌肽的含量高达1300mg/100g，其活性价值也远高于其他畜禽肉来源的鹅肌肽。在现代食品工业中，已将其用作天然的抗氧化剂和降尿酸食疗产品。尤其是对于长期服药肾脏已经受损的患者来说，鹅肌肽的明确靶向性也保证了降酸的高效。由于嘌呤和鹅肌肽同时存在金枪鱼鱼肉中，二者具有拮抗作用，因此，工业生产中去除金枪鱼中的嘌呤是保证获得金枪鱼肉鹅肌肽原料发挥作用的关键。

技术实现要素：

针对上述现有技术，经长期的技术与实践探索，本发明提供一种应用膜过滤降低金枪鱼鹅肌肽原料中嘌呤含量的方法及其应用。本发明提供方法能够有效降低嘌呤在工业制备的金枪鱼鹅肌肽原料中的含量，减少嘌呤对金枪鱼鹅肌肽产品的功能干扰，简化生产制备工艺，提高嘌呤去除效率，同时减少目标产物的营养损失，保证金枪鱼鹅肌肽的收率，保证痛风患者放心安全食用，因此具有良好的实际应用之价值。

本发明是通过如下技术方案实现的：

本发明的第一个方面，提供一种应用膜过滤降低金枪鱼鹅肌肽原料中嘌呤含量的方法，所述方法包括：将金枪鱼肉搅碎打浆后置于沸水中进行两次过筛过滤，将两次滤液合并进行两次超滤膜过滤，取第二次获得的截留液。

具体的，所述方法包括：

s1、将搅碎打浆后的金枪鱼肉置于沸水中进行第一次过筛过滤，得滤液a，将第一次筛网过滤后的鱼浆继续置于沸水进行第二次提取进行第二次过筛过滤，得滤液b，将两次所得滤液(滤液a和滤液b)合并得最终滤液c；

s2、将步骤s1所得到的滤液c采用1500-5000da陶瓷膜进行第一次超滤膜过滤，得透过液d；

s3、将步骤s2所得的透过液d采用150-200da有机膜进行第二次超滤膜过滤，得截留液e；

s4、将步骤s3所得的截留液浓缩干燥，即得到含低嘌呤的金枪鱼鹅肌肽最终产物。

本发明的第二个方面，提供上述方法在降低金枪鱼鹅肌肽原料中嘌呤含量中的应用。

本发明的第三个方面，提供上述方法在工业化生产制备低含量嘌呤金枪鱼鹅肌肽产品中的应用。

上述一个或多个技术方案的有益技术效果：

(1)上述采用不同截留分子量的陶瓷膜和超滤膜对金枪鱼沸水提取液进行过滤，为防止膜过滤过程中截留液浓度太高导致提取液中的鹅肌肽，嘌呤出现沉淀包裹，过滤不充分，需加水对浓缩液进行反复稀释过滤。

(2)上述技术方案采用不同截留分子量的超滤膜对金枪鱼鹅肌肽提取液中的嘌呤进行分级分离，可根据嘌呤分子量大小控制有机膜设备的实验参数，工艺流程简单，过滤效果好，产品稳定性好，不改变目标产物的营养损失，符合工业绿色环保生产要求。

综上，上述技术方案采用的膜过滤去除金枪鱼鹅肌肽原料中嘌呤含量的生产方法适于工业化生产，具有良好的实际生产应用之价值。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例1中鹅肌肽标准品hplc分析图谱；

图2为本发明实施例1中次黄嘌呤标准品hplc分析图谱；

图3为本发明实施例1中黄嘌呤标准品hplc分析图谱；

图4为本发明实施例1中膜过滤处理后鹅肌肽、次黄嘌呤hplc分析图谱。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。

结合具体实施例对本发明作进一步的说明，以下实施例仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。如果实施例中未注明的实验具体条件，通常按照常规条件，或按照试剂公司所推荐的条件；下述实施例中所用的试剂、耗材等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

本发明的一个典型具体实施方式中，提供一种应用膜过滤降低金枪鱼鹅肌肽原料中嘌呤含量的方法，所述方法包括：将金枪鱼肉搅碎打浆后置于沸水中进行两次过筛过滤，将两次滤液合并进行两次超滤膜过滤，取第二次获得的截留液。

本发明的又一具体实施方式中，所述方法包括：

s1、将搅碎打浆后的金枪鱼肉置于沸水中进行第一次过筛过滤，得滤液a，将第一次筛网过滤后的鱼浆继续置于沸水进行第二次提取进行第二次过筛过滤，得滤液b，将两次所得滤液(滤液a和滤液b)合并得最终滤液c；

s2、将步骤s1所得到的滤液c采用1500-5000da陶瓷膜进行第一次超滤膜过滤，得透过液d；

s3、将步骤s2所得的透过液d采用150-200da有机膜进行第二次超滤膜过滤，得截留液e；

s4、将步骤s3所得的截留液浓缩干燥，即得到含低嘌呤的金枪鱼鹅肌肽最终产物。

本发明的又一具体实施方式中，所述步骤s1中，

金枪鱼肉原料为袋包装的新鲜冷冻金枪鱼鱼肉，便于原料冰水解冻，不含金枪鱼鱼头，鱼尾，内脏等金枪鱼附属物。

本发明的又一具体实施方式中，第一次过筛过滤中，金枪鱼鱼浆与水的质量比为1:10～12，优选为1:10，温度控制在100℃，提取时间为2-2.5h，所述筛网目数控制为150-250目，优选为200目。

本发明的又一具体实施方式中，第二次过筛过滤中，金枪鱼鱼浆与水的质量比为1:8～10，优选为1:10，温度控制在100℃，提取时间为2-2.5h，所述筛网目数控制为150-250目，优选为200目。

本发明的又一具体实施方式中，进行步骤s1前，对金枪鱼肉采用冰水解冻方法进行原料解冻。

本发明的又一具体实施方式中，所述步骤s2中，控制陶瓷膜孔径为3000-5000da。

本发明的又一具体实施方式中，所述步骤s3中，控制有机膜孔径为180-200da。

步骤s2和s3中，通过控制超滤膜孔径大小，同时根据嘌呤的分子式为c5h4n4，分子量为120，从而有效去除金枪鱼鹅肌肽的嘌呤含量。

本发明的又一具体实施方式中，提供上述方法在降低金枪鱼鹅肌肽原料中嘌呤含量中的应用。

本发明的又一具体实施方式中，提供上述方法在工业化生产制备低含量嘌呤金枪鱼鹅肌肽产品中的应用。

以下通过实施例对本发明做进一步解释说明，但不构成对本发明的限制。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

实施例1

一种应用膜过滤降低金枪鱼鹅肌肽原料中嘌呤含量的方法，具体步骤如下：

s1、选择新鲜冷冻的金枪鱼肉2.0kg。

s2、采用冰水解冻方法进行原料解冻。

s3、将金枪鱼冷冻肉迅速搅碎打浆。

s4、将打浆过后的金枪鱼鱼浆放在提前准备好的沸水里(第一次金枪鱼普通肉鱼浆与纯水以质量比1：10混合)，温度控制在100℃，提取时间为2h，采用200目的筛网进行第一次过筛过滤，得滤液a，第一次筛网过滤后的鱼浆继续投入沸水进行第二次提取(第二次金枪鱼普通肉鱼浆与纯水以质量比1：10混合)，温度控制在100℃，提取时间为2h，采用200目的筛网进行第二次过筛过滤，得滤液b，将两次所得滤液(滤液a和滤液b)合并得最终滤液c。

s5、将步骤s4所得到的最终滤液c采用4000da陶瓷膜进行第一次超滤膜过滤，得透过液d，保留截留液待测。

s6、将步骤s5所得的透过液d采用150da有机膜进行第二次超滤膜过滤，得截留液e，保留透过液待测。

s7、将步骤s6所得的截留液浓缩干燥，得到含低嘌呤的金枪鱼鹅肌肽最终产物。

实施例2

一种应用膜过滤降低金枪鱼鹅肌肽原料中嘌呤含量的方法，具体步骤如下：

s1、选择新鲜冷冻的金枪鱼肉2.0kg。

s2、采用冰水解冻方法进行原料解冻。

s3、将金枪鱼冷冻肉迅速搅碎打浆。

s4、将打浆过后的金枪鱼鱼浆放在提前准备好的沸水里(第一次金枪鱼普通肉鱼浆与纯水以质量比1：10混合)，温度控制在100℃，提取时间为2h，采用200目的筛网进行第一次过筛过滤，得滤液a，第一次筛网过滤后的鱼浆继续投入沸水进行第二次提取(第二次金枪鱼普通肉鱼浆与纯水以质量比1：10混合)，温度控制在100℃，提取时间为2h，采用200目的筛网进行第二次过筛过滤，得滤液b，将两次所得滤液(滤液a和滤液b)合并得最终滤液c。

s5、将步骤s4所得到的最终滤液c采用4000da陶瓷膜进行第一次超滤膜过滤，得透过液d，保留截留液待测。

s6、将步骤s5所得的透过液d采用180da有机膜进行第二次超滤膜过滤，得截留液e，保留透过液待测。

s7、将步骤s6所得的截留液浓缩干燥，得到含低嘌呤的金枪鱼鹅肌肽最终产物。

实施例3

一种应用膜过滤降低金枪鱼鹅肌肽原料中嘌呤含量的方法，具体步骤如下：

s1、选择新鲜冷冻的金枪鱼肉2.0kg。

s2、采用冰水解冻方法进行原料解冻。

s3、将金枪鱼冷冻肉迅速搅碎打浆。

s4、将打浆过后的金枪鱼鱼浆放在提前准备好的沸水里(第一次金枪鱼普通肉鱼浆与纯水以质量比1：10混合)，温度控制在100℃，提取时间为2h，采用200目的筛网进行第一次过筛过滤，得滤液a，第一次筛网过滤后的鱼浆继续投入沸水进行第二次提取(第二次金枪鱼普通肉鱼浆与纯水以质量比1：10混合)，温度控制在100℃，提取时间为2h，采用200目的筛网进行第二次过筛过滤，得滤液b，将两次所得滤液(滤液a和滤液b)合并得最终滤液c。

s5、将步骤s4所得到的最终滤液c采用4000da陶瓷膜进行第一次超滤膜过滤，得透过液d，保留截留液待测。

s6、将步骤s5所得的透过液d采用200da有机膜进行第二次超滤膜过滤，得截留液e，保留透过液待测。

s7、将步骤s6所得的截留液浓缩干燥，得到含低嘌呤的金枪鱼鹅肌肽最终产物。

实施例4

一种应用膜过滤降低金枪鱼鹅肌肽原料中嘌呤含量的方法，具体步骤如下：

s1、选择新鲜冷冻的金枪鱼肉2.0kg。

s2、采用冰水解冻方法进行原料解冻。

s3、将金枪鱼冷冻肉迅速搅碎打浆。

s4、将打浆过后的金枪鱼鱼浆放在提前准备好的沸水里(第一次金枪鱼普通肉鱼浆与纯水以质量比1：10混合)，温度控制在100℃，提取时间为2h，采用200目的筛网进行第一次过筛过滤，得滤液a，第一次筛网过滤后的鱼浆继续投入沸水进行第二次提取(第二次金枪鱼普通肉鱼浆与纯水以质量比1：10混合)，温度控制在100℃，提取时间为2h，采用200目的筛网进行第二次过筛过滤，得滤液b，将两次所得滤液(滤液a和滤液b)合并得最终滤液c。

s5、将步骤s4所得到的最终滤液c采用4000da陶瓷膜进行第一次超滤膜过滤，得透过液d，保留截留液待测。

s6、将步骤s5所得的透过液d采用220da有机膜进行第二次超滤膜过滤，得截留液e，保留透过液待测。

s7、将步骤s6所得的截留液浓缩干燥，得到含低嘌呤的金枪鱼鹅肌肽最终产物。

hplc检测试例

1、鹅肌肽含量检测

1.1混合标准使用液的配制

肌肽，鹅肌肽准溶液：称取肌肽，鹅肌肽标准品各25.5mg(纯度≥98.0％)，用超纯水溶解并稀释至25.0ml，摇匀，配置成1.0mg/ml的标准储备液，置于-4℃下密封保存。再分别取标准储备液，用超纯水稀释至50，100，200，400，800μg/ml的标准使用液。

1.2混合标准使用液的配制

肌肽，鹅肌肽混合标准溶液：称取肌肽，鹅肌肽标准品各25.5mg(纯度≥98.0％)，用超纯水溶解并稀释至25.0ml，摇匀，配置成1.0mg/ml的混合标准储备液，置于-4℃下密封保存。再分别取混合标准储备液，用超纯水稀释至50，100，200，400，800μg/ml的混合标准使用液。

1.3嘌呤标准使用液的配制

四种嘌呤标准溶液：称取腺嘌呤、鸟嘌呤、黄嘌呤以及次黄嘌呤标准品各10.0mg(纯度≥98.0％)，用超纯水溶解并稀释至100ml，摇匀，配置成0.1mg/ml的标准储备液，置于-4℃下密封保存。

2、色谱条件

鹅肌肽检测方法为本实验室自己试验考察优化建立，具体检测方法：easysep^tm-1020分析型液相色谱仪(上海通微分析技术有限公司)，4.6x250mmx5μm(agilent，zorbaxsb-c18)，甲醇：磷酸二氢钾溶液(0.05mol/l)＝10:90(ph＝8.21)，流速为0.6ml/min，柱温35℃，紫外检测器波长为210nm。

嘌呤去除率计算

膜过滤处理前后黄嘌呤和次黄嘌呤含量总和的变化称为嘌呤去除率。根据样品中黄嘌呤和次黄嘌呤的峰面积，从标准曲线上查出其浓度c，金枪鱼鹅肌肽中嘌呤物质的去除率可以用以下公式计算：

x(％)＝[(c0-c)/c0]x100

式中：c0为处理前金枪鱼水提物中嘌呤浓度，mg/ml

c为处理后金枪鱼水提物中嘌呤浓度，mg/ml

根据鹅肌肽标准品溶液在高效液相hplc检测值制作标准曲线，测得实施例1-4所制备的金枪鱼鹅肌肽中各组分含量如下表1-1。

表1-1嘌呤去除率

通过采用高效液相hplc检测4种嘌呤标准品，其中鸟嘌呤和腺嘌呤在高效液相峰值显示极低，由此可见在金枪鱼中主要含有黄嘌呤和次黄嘌呤两种嘌呤，因此，本专利应用膜过滤降低金枪鱼鹅肌肽原料中嘌呤含量的方法主要针对黄嘌呤和次黄嘌呤两种嘌呤在金枪鱼终产物中的含量。通过实施例由表1-1可以看出，实施例1与实施例2-4去除的金枪鱼嘌呤含量明显偏低，这是因为实施例1采用的膜孔径大小为150da，由于嘌呤的分子量为120.11，因此可能此处用膜大小与嘌呤的分子量太接近，导致部分嘌呤随着截留液浓度过高没有透过滤膜，因此嘌呤的去除率相对其他3个实施例偏小。分析其他3个实施例发现实施例2-4去除的嘌呤明显增加，均在30％以上，这说明金枪鱼鹅肌肽的制备过程中，膜过滤下限范围应在180-220da，但是由于鹅肌肽的分子量是240da。为了保证鹅肌肽出现不必要的损失，实施例4中220da的膜分子量不符合实际生产要求，结合实验和实际膜过滤的效果，调整膜过滤分子量的大小为180-200da，可以达到降低金枪鱼鹅肌肽原料中嘌呤含量的目的。

最后应该说明的是，以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。上述虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。