一种引起棉花花冠颜色变化的基因及其鉴定方法与流程

本发明涉及生物技术领域，具体地说是一种引起棉花花冠颜色变化的基因及其鉴定方法。

背景技术：

一般的，花冠颜色是棉花的一个重要形态标记，生产上棉花主要栽培品种的花冠为白色，因此花色标记在棉花生产中具有重要的应用价值。比克氏棉是野生的二倍体棉种，具有红色花冠、花瓣底部具有深色基斑的表型。花青素是植物次级代谢产物，是类黄酮的一个亚类。花青素可以在植物的花、果实、叶片等器官由于积累使其呈现出不同的颜色。花青素在植物的花器官中积累，可以吸引昆虫，有助于传粉。花青素还能保护植物免受紫外线和强光的伤害。并且由于花青素具有清除自由基和抗氧化的性质，人们在饮食中摄入花青素可以有效减少癌症、心血管疾病、糖尿病的发病风险，还可以延缓衰老。因此花青素的研究具有很强的应用价值。但是，棉花花冠颜色的表达在基因水平上具体是由什么控制，并且利用基因工程手段是否能直接对棉花花冠颜色控制表达是现阶段针对棉花进行研究的重要课题。

技术实现要素：

本发明的技术任务是解决现有技术的不足，提供一种引起棉花花冠颜色变化的基因及其鉴定方法。

花青素是在内质网中合成的，之后运输到液泡中进行储存和显色。花青素的合成需要通过一系列的酶促反应，包括查尔酮合成酶(chs)、查尔酮异构酶(chi)、黄烷酮3羟化酶(f3h)、二羟基黄酮醇还原酶(dfr)、花青素合酶(ans)和类黄酮3-o-糖基转移酶(ufgt)。花青素合成之后转运到液泡中。花青素的转运主要是通过囊泡运输、膜转运蛋白(abc转运蛋白，mate转运蛋白)和谷胱甘肽s转移酶。花青素的合成和积累收到多种环境调节，如紫外光、寒冷、干旱和渗透胁迫。花青素的合成还受到茉莉酸、赤霉素等激素的调节。这种调节是通过mbw(myb、bhlh、wd40)模型的调控。拟南芥中myb转录因子pap1，苜蓿中的lap1能够直接激活花青素合成基因来影响花青素的合成和积累。gst基因的表达同样受到myb转录因子的调控。如拟南芥tt19、猕猴桃的acgst1、苹果的mdgstf6均受到myb转录因子的调控。有研究证明，bzip转录因子hy5能够调控myb转录因子，从而影响花青素的合成。但是bzip转录因子能够调控gst的表达来调节花青素的积累还没有报道。

本发明涉及一种棉花的gst基因，其编码谷胱甘肽s转移酶(gst)。利用野生二倍体比克氏棉与陆地棉远缘杂交得到的红花品种hb118,与白花品种陆地棉遗传标准系tm-1杂交或得遗传群体，通过图位克隆技术得到该基因。通过调控该基因的表达，可以控制棉花花冠颜色的变化。

本发明的技术方案是：

控制棉花花冠颜色变化的基因是棉花的gst基因，该基因编码谷胱甘肽s转移酶gst。

控制棉花花冠颜色变化的基因的基因序列是seqidno.10。

用于鉴定控制棉花花冠颜色变化的基因的候选基因是seqidno.9、seqidno.10、seqidno.11、seqidno.12或seqidno.13。

控制棉花花冠颜色变化的基因是谷胱甘肽s转移酶gst蛋白的基因，该基因所编码gst蛋白的氨基酸序列是seqidno.5、seqidno.6、seqidno.7、或seqidno.8。

用于鉴定控制棉花花冠颜色变化的基因的候选基因所编码蛋白的氨基酸序列是seqidno.5、seqidno.6、seqidno.7、或seqidno.8。

一种基因工程体，该基因工程体的基因中至少含有如权利要求1所述棉花的gst基因，该基因的基因序列是seqidno.10；或该基因工程体的中至少含有编码谷胱甘肽s转移酶gst的蛋白，所编码gst蛋白的氨基酸序列是seqidno.5、seqidno.6、seqidno.7、或seqidno.8。

一种控制棉花花冠颜色变化的方法是：利用野生二倍体比克氏棉与陆地棉远缘杂交得到的红花品种hb118，与白花品种陆地棉遗传标准系tm-1杂交或得遗传群体，通过图位克隆技术得到棉花的gst基因，其编码谷胱甘肽s转移酶gst，通过调控该基因的表达，控制棉花花冠颜色的变化。

一种引起棉花花冠颜色变化的基因的鉴定方法，该方法的过程是：

(1)定位筛选除花色表现性状不同之外其他形性状均相同的同源或近源的红花系棉种和白花系棉种，选定：

红花系棉种：hb118

白花系棉种：118

针对上述两种棉花通过hplc-ms/ms检测分析hb118和118中色素成分及含量，并用比色法检测验证；

(2)红花基因的精细定位和图位克隆：

以118为母本，hb118为父本，杂交得到f1代，f1代通过严格自交得到f2遗传群体，统计f2遗传群体总株数，以及其中的红色花瓣植株的株数、白色花瓣植株的株数，分析孟德尔遗传定律分离比，确定是否为单基因控制的显性形状；

定位红花基因的染色体区间；

在染色体区间中的候选基因中确定与植物色素相关的基因；

用于鉴定控制棉花花冠颜色变化的基因的候选基因有seqidno.1、seqidno.2、seqidno.3、或seqidno.4；

鉴定候选基因在红花系棉种和白花系棉种的花瓣中的差异表达，分析候选基因，通过图位克隆分析基因差异，验证定位结果；

(3)定位基因特征分析：

对定位基因的编码蛋白进行分析；

关联花青素进行分析，定位基因的编码蛋白在hb118和118中对比是否影响其与花青素结合的能力；

结合定位基因的编码蛋白氨基酸序列的影响因素，对比分析在hb118和118中定位基因的编码蛋白的表达量的差异；

综合判断红色花瓣的差异因素的决定性因素；

(4)判断定位基因在hb118和118中差异表达是否由于启动子活性变化所导致：

针对定位基因在hb118和118的花瓣、花丝、根、茎、叶不同组织进行差异表达检测；

将定位基因-hb118与定位基因-118基因的启动子活性检测：将定位基因-hb118与定位基因-118基因的启动子进行克隆，将两个启动子与gus连接后进行启动子活性检测瞬时转化烟草，对比二者启动子的启动活性，判断启动子活性差异；

对两个启动子序列进行原件分析：利用newplace对两个启动子序列进行原件分析，判断二者与转录因子的因素关联性；判断两个启动子的原件是否具有转录因子结合位点，

(5)判断定位基因的表达调控机制：

对比定位基因-hb118与定位基因-118二者的启动子上的转录因子结合位点的差异，并调查所差异的转录因子的组织特异表达热图，进行对比分析；

序列分析相关的转录因子差异在hb118和118中的表达的差异性；

分析二者转录因子在棉花中的同源基因，分析同源基因在调控花青素合成通路基因的表达方式，并在在hb118和118棉种中进行转录因子orf克隆，序列分析二者转录因子的差异性；

针对二者转录因子所调控表达的同源基因，在棉花中提取该转录因子，并进行聚类分析及序列对比，分析相关转录因子同源基因参与红花基因的基因调控的相关性；

推测红花基因的基因调控由哪一个同源基因所参与基因调控；

验证推测结果，针对二者的转录因子同源基因分别与定位基因-hb118和定位基因-118的启动子进行酵母单杂实验，分析和验证转录因子和启动子同源基因的结合性；

(6)外界生长环境因素的变化对红花表型的干扰：

试验和分析不同光照强度条件下，对定位基因-hb118与定位基因-118的表达差异；

(7)结合花青素合成通路相关基因及其他调控相关基因的表达分析相关基因在hb118和118花瓣中的表达差异；

(8)综合分析关于hb118红花近等基因系的特异基因表达的分子机制。

hb118棉种是陆地棉白花品种118的近等基因系棉种，hb118棉种是由陆地棉与比克氏棉远缘杂交得到，表现出红色花冠、花瓣底部具有深色基斑的性状。

棉花的gst基因，或棉花中编码谷胱甘肽s转移酶gst的蛋白，在控制棉花花冠颜色变化的基因工程中的应用。

本发明与现有技术相比所产生的有益效果是：

本发明的一种引起棉花花冠颜色变化的基因及其鉴定方法，引起棉花花冠颜色变化的基因是棉花的gst基因，其编码谷胱甘肽s转移酶(gst)。利用野生二倍体比克氏棉与陆地棉远缘杂交得到的红花品种hb118,与白花品种陆地棉遗传标准系tm-1杂交或得遗传群体，通过图位克隆技术得到该基因。通过调控该基因的表达，可以控制棉花花冠颜色的变化。

本发明确定了红花材料hb118花冠花青素种类。通过液质联用方法，确定了hb118花瓣中花青素种类：只含有一种花青素，为矢车菊素-3-氧葡萄糖苷(cy3g)。

本发明完成了hb红花基因图位克隆及精细定位。通过图位克隆鉴定hb红花基因r3^bic编码谷胱甘肽-s-转移酶(gst)，是拟南芥tt19的同源基因，定位于棉花的a07染色体上，将其命名为gobrpa。

本发明明确了hb118和118花冠颜色是由于gobrpa表达量的差异引起的。gobrpa在hb118花瓣中具有较高的基因表达，而在118的花瓣中基本不表达。hb118和118的gobrp蛋白具有3个氨基酸差异，但是两个基因都能够回复拟南芥tt19突变表型，具有与矢车菊素-3-氧葡萄糖苷结合的能力。

本发明揭示了gobrpa基因在hb118和118花瓣中的表达差异原因。hb118启动子上具有bzip及myb转录因子结合位点，使其启动子活性升高从而导致gobrpa基因表达提高。

本发明揭示了gobrpa基因上游调控分子机理。酵母单杂发现，ghhy5d和ghpap1d能够直接结合到gobrpa-hb118启动子上从而使启动子活性提高，而gobrpa-118启动子既不能与ghhy5d结合，而且与ghpap1d结合能力仅仅是gobrpa-hb118启动子的1/5，最终导致gobrpa-hb118启动子活性明显高于gobrpa-118启动子。

本发明的一种引起棉花花冠颜色变化的基因及其鉴定方法通过调控该基因的表达，可以控制棉花花冠颜色的变化，在棉花的育种方面具有指导意义。

附图说明

图1：hb118和118表型；

a、118和hb118大田植株表型。b、118和hb118开花前2天，开花前1天，开花当天的花瓣及花丝表型。

图2：hb118和118花瓣中花青素种类及含量测定；

a、hb118中主要含有1中花青素，118中基本没有花青素存在。b、hb118花瓣中花青素种类检测为cy3g。c、hb118和118中总花青素含量检测。

图3：hb红花基因r3^bic的精细定位。

图4：候选基因在hb118和118中差异表达

a、候选基因在tm-1中组织表达模式。b、候选基因在hb118和118花瓣中差异表达。

图5：hb118和118中gobrp基因orf序列克隆。

图6：红花特异snp分子标记设计；

a、红花snp引物设计。b、snp引物在f2群体中扩增情况。

图7：棉花中gst蛋白与已报到的拟南芥tt19同源基因进化树。

图8：不同物种中tt19同源基因氨基酸序列对比。

图9：gobrpa-118和gobrpa-hb118回复拟南芥tt19突变体表型。

图10：原核表达gobrpa-hb118与gobrpa-118蛋白；

a、sds-page检测。b、westinblot检测。

图11：gobrpa-hb118与gobrpa-118蛋白与cy3g结合能力检测。

图12：gobrpa在hb118和118中组织表达模式；

a、不同组织中gobrpa表达模式。b、不同光照强度下gobrpa的表达模式。

图13：gobrpa-hb118与gobrpa-118启动子活性鉴定；

a、烟草gus染色。b、gus基因相对表达量。

图14：启动子原件分析。

图15：bzip转录因子的组织特异表达热图。

图16：bzip转录因子进化树。

图17：ghhy5基因序列分析。

图18：myb转录因子序列对比及聚类分析；

a、myb转录因子序列对比。b、myb转录因子聚类分析。

图19：酵母单杂；

a、对照试验。

b、ghpap1d能与gobrpa-hb118和gobrpa-118启动子结合。

c、ghhy5d能与gobrpa-hb118和ghpap1d启动子结合但不能与gobrpa-118启动子结合。

图20：不同光照条件下hb118花的表型。

图21：ghhy5和ghpap1的组织差异表达。

图22：ghhy5和ghpap1在不同光照条件下表达。

图23：花青素合成及调控通路相关基因差异表达。

图24：gobrpa参与花瓣显色的分子机理。

具体实施方式

下面结合附图对本发明的一种引起棉花花冠颜色变化的基因及其鉴定方法作以下详细说明。

控制棉花花冠颜色变化的基因是棉花的gst基因，该基因编码谷胱甘肽s转移酶gst。

控制棉花花冠颜色变化的基因的基因序列是seqidno.10。

用于鉴定控制棉花花冠颜色变化的基因的候选基因是seqidno.9、seqidno.10、seqidno.11、seqidno.12或seqidno.13。

控制棉花花冠颜色变化的基因是谷胱甘肽s转移酶gst蛋白的基因，该基因所编码gst蛋白的氨基酸序列是seqidno.5、seqidno.6、seqidno.7、或seqidno.8。

用于鉴定控制棉花花冠颜色变化的基因的候选基因所编码蛋白的氨基酸序列是seqidno.5、seqidno.6、seqidno.7、或seqidno.8。

红色花冠棉花的四个亚族，及其引起棉花花冠颜色变化的基因序列是：

gobrpa-118，seqidno.1

gobrpd-118，seqidno.2

gobrpa-hb118，seqidno.3

gobrpd-hb118，seqidno.4。

红色花冠棉花的四个亚族，及其引起棉花花冠颜色变化的蛋白序列是：

118-a，seqidno.5

hb118-a，seqidno.6

118-d，seqidno.7

hb118-d，seqidno.8。

本发明的一种引起棉花花冠颜色变化的基因及其鉴定方法：

(一)hb118花瓣呈现红色是由于cy3g的积累导致的

比克氏棉(gossypiumbickii)是野生的二倍体棉种(2n＝2x＝26，g1)，原产于澳洲，具有许多优异性状，如抗黄萎病、种子无腺体而植株有腺体、多毛、抗棉蚜等特点。此外，比克氏棉有红色花冠，花冠底部具有深色基斑。hb118是由陆地棉与比克氏棉远缘杂交所得红花系与黄河流域棉区主推品种鲁棉研21号(编号为118)多次回交后获得的近等基因系。hb118与118除了花瓣及花丝颜色不同外其他性状未表现出差异。118的花瓣及花丝与普通陆地棉花色一致，均为白色，hb118花瓣、花丝均表现为红色，且带有深红色基斑(如图1)。

通过hplc-ms/ms检测分析发现，hb118中只含有一种色素，而118中没有检测到色素(如图2a)。进一步分析发现，hb118中花色苷分子量449，母核为287矢车菊素(449-287＝162为一个葡萄糖分子量)，判断花色苷结构为矢车菊素葡萄糖苷(cy3g)，所以推断出hb118花瓣呈现红色是由于cy3g的积累所导致的(如图2b)。用比色法检测了hb118和118中花青素的含量(花青素的最大吸收波长为530nm)，结果显示hb118中花青素含量较高，而118中基本不含花青素，这与hplc-ms/ms检测结果一致(如图2c)。

(二)hb红花基因r3^bic的精细定位和图位克隆

以118为母本，hb118为父本，杂交得到f1代，f1代通过严格自交得到f2遗传群体共352株，其中红色花瓣植株共252株，白色花瓣植株共100株。其f1代表现为红色花瓣，(x²＝2.0<x²0.05,1＝3.84)，符合孟德尔遗传定律3:1分离比，因此认为hb118红色花瓣性状为单基因控制的显性质量性状。根据前人的报道，比克氏棉红色花瓣记为r3^bic。对2672对引物进行了多态性筛选，共得到差异引物236对。利用bsa方法，对差异引物进一步筛选，得到了5对多态性明显的引物，将hb红花基因r3^bic定位在棉花的a07染色体，位于a07-0594和a07-0592标记之间，其物理距离为33.2kb(如图3)。该区间共包括5个orf(表1)。

表1、定位区间内候选基因

候选基因gh_a07g0666

候选基因gh_a07g0667

候选基因gh_a07g0668

候选基因gh_a07g0669

候选基因gh_a07g0670

5个orf的候选基因的序列如：seqidno.9、seqidno.10、seqidno.11、seqidno.12、seqidno.13。

其中：

orf1是未知功能蛋白，

orf2为谷胱甘肽s转移酶，

orf3为八氢番茄红素合成酶，

orf4为类谷氨酰胺转酰胺酶类家族蛋白，

orf5是mt-a70家族蛋白甲基转移酶。

五个候选基因中与植物色素相关基因有2个：

orf2参与花青素从内质网到液泡的运输，

orf3是类胡萝卜素合成的关键酶。

通过对比tm-1转录组测序结果发现orf1在各个组织中没有表达(如图4a)。对区间内候选基因在hb118和118花瓣中的差异表达进行了鉴定。结果显示，orf2在hb118花瓣中表达量极高，而在118花瓣中基本不表达；而另一色素相关基因orf3在hb118和118的花瓣中均不表达。此外，orf4和orf5在两个材料的花瓣中表达量没有差异(如图4b)。花青素是从内质网中合成并通过转运蛋白及囊泡运输等方式进入液泡存储，通过液泡中的ph改变从而显色。orf2编码gst蛋白，将orf2命名为gobrp(gossypiumbickiiredpetalgene)。图位克隆结果表明gobrpa-hb118与gobrpa-118共有8个核苷酸的差异，造成了3个氨基酸的变化；gobrpd-hb118与gobrpd-118序列完全相同(如图5)。

在hb118中，未克隆到gobrpa-118序列。因此，推测hb118是比克氏棉的片段置换系。利用第288bp处的核苷酸差异，设计snp引物，其中hb118的a能够扩增条带，而118的g不能扩增出条带(如图6a)。

在扩大的f2群体中进行了检测，发现在1191个f2群体中，868个红花单株均有扩增条带，而323个白花单株均没有扩增条带，没有分离，这进一步验证了的定位结果(图6b)。

(三)gobrp基因特征分析

gobrp的编码区共642bp，编码214个氨基酸，有2个结构域：pfam02798:gst_n,pfam00043:gst_c。对陆地棉中同时包含两个结构的基因进行了挖掘，在陆地棉tm-1中共有25个gst基因家族成员同时包含两个结构域。通过与已经报道过的15条gst蛋白序列聚类分析，发现gobrp蛋白与拟南芥的tt19相似性最高，为59％(如图7)。氨基酸序列比对发现，gst蛋白序列相对保守，且gobrpa-hb118与gobrpa-118三个差异氨基酸并不处于关键位置(如图8)。`

为了进一步验证3氨基酸的变化能否影响其基因功能。将gobrpa-118和gobrpa-hb118通过花粉管通道法回复拟南芥tt19突变体(拟南芥tt19突变体在3％的蔗糖培养基中，下胚轴和子叶边缘不能变红)。实验发现，gobrpa-118和gobrpa-hb118都能够回复拟南芥tt19的表型(如图9)。

利用原核表达技术将gobrpa-hb118与gobrpa-118构建到pet-30a原核表达载体，在大肠杆菌中表达并纯化得到了gobrpa-hb118与gobrpa-118蛋白，并进行了westernblot检测。实验结果显示，两个蛋白均能够在上清中正常表达，其蛋白分子量均为24.6kd(如图10)。

利用biacore8k对两个蛋白与矢车菊素葡萄糖苷的结合能力进行了检测，结果显示gobrpa-hb118与gobrpa-118蛋白均能够与矢车菊素葡萄糖苷相结合。体外结合实验表明，gobrp能够作为转运蛋白直接与花青素相结合，其结合能力分别为7.01×10^-5和3.45×10^-5处于相同数量级(如图11)，因此推断gobrpa蛋白在hb118和118中氨基酸序列差异并不影响其与花青素结合的能力。因此所以认为引起hb118红色花瓣的原因是gobrpa基因表达量的差异造成的，而不是由于氨基酸序列变化引起的。

(四)gobrpa在hb118和118中差异表达是由于启动子活性变化所导致

对gobrp基因在hb118和118不同组织进行了差异表达检测。结果发现，在hb118中，gobrp基因在花瓣中极优势表达，其次是花丝。hb118花瓣和花丝中的表达量分别是118的240和12余倍。gobrp基因在根茎叶中表达量比较低，并且与118没有显著差异并且，该基因在强光照条件下，表达量更高。

对gobrpa-hb118与gobrpa-118基因的启动子进行了克隆，分别克隆到了1694bp和1652bp。将两个启动子与gus连接后进行启动子活性检测瞬时转化烟草。结果发现与gobrpa-118启动子相比，gobrpa-hb118启动子具有更强的启动活性，在注射的烟草中hb118启动子启动的gus基因的表达量比118启动子高9倍(如图13)。启动子序列分析发现gobrpa-hb118与gobrpa-118基因的启动子差异非常大，具有很多snp变异及缺失以及大片段的插入缺失(如图14)。

利用newplace对两个启动子序列进行了原件分析。在gobrpa-hb118启动子上发现了两个acgt-box(aacgtt)和两个act原件(actcat)，这两个原件是bzip转录因子的结合位点。此外在gobrpa-hb118启动子上还发现两个myb转录因子结合位点ac原件和eec原件。但是在gobrpa-118启动子上均未发现以上转录因子结合原件。

(五)ghhy5和ghpap1能够直接调控gobrpa-hb118基因表达

由于在gobrpa-hb118启动子上发现了gobrpa-118启动子上所没有的两个bzip转录因子结合位点，因此调查了棉花中bzip转录因子，共有88个。根据tm-1转录组测序分析完成了88个bzip转录因子的组织特异表达热图(如图15)，发现gh_d08g2461和gh_a08g2092转录因子与gobrpa-hb118的基因表达模式十分接近，都是在花瓣中表达最高，其次是花丝，在根茎叶中表达量非常少。

gh_d08g2461和gh_a08g2092转录因子是拟南芥athy5基因的同源基因(如图16)。有研究报道，hy5基因在拟南芥中调控花青素合成通路基因的表达，参与花青素的积累。因此分别在hb118和118中进行了gh_d08g2461(ghhy5d)gh_a08g2092(ghhy5a)转录因子orf克隆，序列分析发现，ghhy5d和ghhy5a在hb118和118中没有差异(如图17)。

在多个物种中研究报道myb转录因子能够直接调控tt19同源基因的表达，如拟南芥的atpap1。提取了棉花中atpap1转录因子同源基因，并进行了聚类分析及序列对比(如图18)。棉花中atpap1转录因子同源基因包括ghpap1和ghpap2基因，其结构相对保守，具有较高的同源性，且棉花中组成型过表达ghpap1能够引起棉花全株呈现红色。因此，推测ghpap1和ghhy5参与hb红花基因gobrpa的基因调控。

为了验证推测，对ghhy5d和ghpap1d分别与gobrpa-hb118和gobrpa-118启动子进行了酵母单杂实验。结果显示，ghhy5d能够与gobrpa-hb118启动子直接结合，但是不能与gobrpa-118启动子结合；ghpap1d能够与gobrpa-hb118直接结合，且强度较高，而与gobrpa-118启动子结合较弱。有研究发现，bzip转录因子能够调控myb基因的表达，所以研究了ghhy5d与ghpap1转录因子的结合能力。酵母单杂显示，ghhy5d能够直接结合ghpap1的启动子(如图19)。

(六)外界生长环境因素的变化对红花表型的干扰：

还发现，hb118花冠颜色在不同的光照条件下红色表型有差异。在大田条件下(光强为80000lx)较温室中(光强为3200lx)花瓣红色更鲜艳(如图20)，组织差异表达分析发现在高光强下gobrpa-hb118基因表达更高，ghhy5基因和ghpap1基因的组织表达模式同gobrp基因类似，都是在花瓣中表达较高，其次是花丝，在根茎叶表达较低(如图21)，并且它们都受到光照信号的调控，在高光强条件下表达更高(如图22)。

因此推测，gobrpa基因受到ghhy5和ghpap1的调控，且由于二者都受到光照强度的调控，导致gobrpa在低光照强度条件下表达较低，花瓣中花青素积累较少，所以花冠红色程度较高光照条件下不鲜艳。

(七)结合花青素合成通路相关基因及其他调控相关基因的表达分析相关基因在hb118和118花瓣中的表达差异：

研究花青素合成通路相关基因及其他调控相关基因的表达发现，合成通路基因ghpal1、ghchs1、ghchs2、ghfls1、ghdfr1、ghdfr2、ghans1的表达及转录调控基因ghwd40、ghtt8-1、ghgl3的表达在hb118和118花瓣中均没有差异，只有ghans2和ghufgt在hb118花瓣中表达更高(如图23)。

通过一系列分析研究，关于hb红花近等基因系的特异基因表达的分子机制最终得出以下结论：红花品种hb118中，在高光照条件下ghhy5启动ghpap1基因的表达，而且ghhy5和ghpap1直接结合到gobrpa-hb118启动子上，从而启动gobrpa基因的表达，产生的gobrp蛋白进而将从内质网合成的花青素cy3g转运到液泡中储藏，并由于ph的改变在酸性条件下呈现出红色；在低光照条件下ghhy5和ghpap1基因表达较弱，使gobrp基因表达减弱，花瓣红色变弱。而在白花品种118中，虽然gobrpa-118也能够与花青素cy3g相结合，但是由于启动子的差异，ghhy5不能结合到gobrpa-118启动子，且ghpap1与gobrpa-118启动子较弱结合，导致gobrpa-118基因表达极低，不能将花青素转运到液泡，因此花瓣呈白色(如图24)。

序列表

<110>山东棉花研究中心

<120>一种引起棉花花冠颜色变化的基因及其鉴定方法

<160>87

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>645

<212>dna

<213>gobrpa-118

<400>1

atggtagtgaaagtgtatggtccaatcaaggcagcttgccctcaaagggtattggcatgc60

cttcttgagaaagaggttgaatttcagatcgtcgacgtcgatctcgaagccggcgatcat120

aaaaaacccgatttcctcctccgtcaaccgtttggacaagtcccagctatagaggatggc180

gacttcaaactttttgagtctagggcaatcataaggtactatgcagccaaatatgaaaag240

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<210>2

<211>645

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<212>prt

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202530

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metlysleualaasntyr

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metmetleualaasntyr

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metlysleualaasntyr

210

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<213>hb118-d

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metlysleualaasntyr

210

<210>9

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<212>dna

<213>人工序列(候选基因gh_a07g0666)

<400>9

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<210>10

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<212>dna

<213>人工序列(候选基因gh_a07g0667)

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<210>11

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<400>11

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<210>12

<211>1179

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<213>人工序列(候选基因gh_a07g0669)

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<210>13

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<213>人工序列(候选基因gh_a07g0670)

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aagggtgccaaatccagcagcagggaagagagaagagttgatgctgagaagagtaagagc840

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agatcaggtagggagaaaattgagaagcacagacagcagagaactccctctggtcgagat960

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gataaaagttcaagagaagtagggcaaacaaacaggtctaggacccctgagagaagtagt1080

aggcgttatcaagactcagatcccactgagatggattttgaaagaagctcagaacgcaaa1140

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aatattcgatcaggttggcttactgttggtaaaggactgtcttcatcgaattttaatgca3120

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cgaaatccacccccagatgcacctcatttggtgaagacaacctcagatatagaagcactg3240

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tcaccgatggaagccttcagaggacgagaaggcatgaacatgtcttcagatgataggatg3480

tttgatatatatggatatggtagccaggcaaatggggaatatctggattttgagtctcat3540

agaccaatgaatttaatgtag3561

<210>14

<211>23

<212>dna

<213>人工序列(引物a07-0646f精细定位)

<400>14

acttttcaccactttactgctgc23

<210>15

<211>26

<212>dna

<213>人工序列(引物a07-0646r精细定位)

<400>15

atcatagttgaaggaccaaaattgga26

<210>16

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(引物a07-0592f精细定位)

<400>16

cttcccggtcgatgtagacg20

<210>17

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(引物a07-0592r精细定位)

<400>17

ccttcgggtggcctaagttt20

<210>18

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(引物a07-0594f精细定位)

<400>18

ttgtgcccattccgcgtata20

<210>19

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(引物a07-0594r精细定位)

<400>19

ccgttgtggaaaggactcga20

<210>20

<211>22

<212>dna

<213>人工序列(引物ch07-44f精细定位)

<400>20

ggaatatgtttcatggaatggc22

<210>21

<211>23

<212>dna

<213>人工序列(引物ch07-44r精细定位)

<400>21

cttcctttcctatctacccatgc23

<210>22

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(引物ch07-53f精细定位)

<400>22

tgtgaaccaggaccctatct20

<210>23

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(引物ch07-53r精细定位)

<400>23

tcaaacgccacaaaattaag20

<210>24

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(引物s49f定量引物-gobrpa)

<400>24

ttcaccttggccgaccttag20

<210>25

<211>22

<212>dna

<213>人工序列(引物s49r定量引物-gobrpa)

<400>25

gcgagcttcatgagtttcttcc22

<210>26

<211>21

<212>dna

<213>人工序列(引物s59f定量引物-gh_a07g0668)

<400>26

ggagaagatgcacaaagggga21

<210>27

<211>21

<212>dna

<213>人工序列(引物s59r定量引物-gh_a07g0668)

<400>27

tgaaacaacattctggccctc21

<210>28

<211>23

<212>dna

<213>人工序列(引物s42f定量引物-gh_a07g0669)

<400>28

tgctgggtattaaggtttccttc23

<210>29

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(引物s42r定量引物-gh_a07g0669)

<400>29

ccatctcttcggcacacaga20

<210>30

<211>22

<212>dna

<213>人工序列(引物s54f定量引物-gh_a07g0670)

<400>30

atatggtagccaggcaaatggg22

<210>31

<211>21

<212>dna

<213>人工序列(引物s54r定量引物-gh_a07g0670)

<400>31

aattggctgttgtccagtgat21

<210>32

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(引物s209f定量引物-ghpal1(gh_d09g1401))

<400>32

cacagctatgtgccaaggga20

<210>33

<211>23

<212>dna

<213>人工序列(引物s209r定量引物-ghpal1(gh_d09g1401))

<400>33

ggaaattccaacaacaaatgcga23

<210>34

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(引物s189f定量引物-ghchs1(gh_d02g0304))

<400>34

gacttggaaccacgggtgaa20

<210>35

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(引物s189r定量引物-ghchs1(gh_d02g0304))

<400>35

tgggctagccaacatgaaca20

<210>36

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(引物s191f定量引物-ghchs2(gh_a10g1079))

<400>36

ggagtggggagtgctctttg20

<210>37

<211>21

<212>dna

<213>人工序列(引物s191r定量引物-ghchs2(gh_a10g1079))

<400>37

aaaactgcaagccaagtggag21

<210>38

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(引物s206f定量引物-ghfls1(gh_a05g3400))

<400>38

gggcctcatcctaagctcgt20

<210>39

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(引物s206r定量引物-ghfls1(gh_a05g3400))

<400>39

agctggccatggaagcttgt20

<210>40

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(引物s196f定量引物-ghdfr1(gh_a05g1647))

<400>40

acatgccgagaaaagggact20

<210>41

<211>21

<212>dna

<213>人工序列(引物s196r定量引物-ghdfr1(gh_a05g1647))

<400>41

ggaagacatgggtaggcactc21

<210>42

<211>22

<212>dna

<213>人工序列(引物s197f定量引物-ghdfr2(gh_a06g0066))

<400>42

agggttaattgcacctccaaca22

<210>43

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(引物s197r定量引物-ghdfr2(gh_a06g0066))

<400>43

gcccttaacaccaaagccct20

<210>44

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(引物s199f定量引物-ghans1(gh_d08g1902))

<400>44

tctgagaccgaacctccact20

<210>45

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(引物s199r定量引物-ghans1(gh_d08g1902))

<400>45

agacagacgccacaaccaag20

<210>46

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(引物s202f定量引物-ghans2(gh_a12g2045))

<400>46

ggctctaggtgtggaagctc20

<210>47

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(引物s202r定量引物-ghans2(gh_a12g2045))

<400>47

gcggtaatccacttgccttc20

<210>48

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(引物s239f定量引物-ghufgt(gh_a02g1341))

<400>48

cagttggagcaaacggaagc20

<210>49

<211>23

<212>dna

<213>人工序列(引物s239r定量引物-ghufgt(gh_a02g1341))

<400>49

acctcatgattccacactaacga23

<210>50

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(引物s227f定量引物-ghwd40(gh_d08g1130))

<400>50

cagtggtctgctactcagcc20

<210>51

<211>22

<212>dna

<213>人工序列(引物s227r定量引物-ghwd40(gh_d08g1130))

<400>51

ccacctaattacaagcgtgagc22

<210>52

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(引物s245f定量引物-ghtt8-1(gh_d11g1273))

<400>52

agggaagggttgttggttga20

<210>53

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(引物s245r定量引物-ghtt8-1(gh_d11g1273))

<400>53

ccacttcacctccgttatgc20

<210>54

<211>21

<212>dna

<213>人工序列(引物s248f定量引物-ghgl3(gh_d08g1966))

<400>54

tgccactcagttcagtcatct21

<210>55

<211>21

<212>dna

<213>人工序列(引物s248r定量引物-ghgl3(gh_d08g1966))

<400>55

caatgcttgctcgattggtcc21

<210>56

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(引物s295f定量引物-ghpap1d)

<400>56

gctaacgacggtaataacga20

<210>57

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(引物s295r定量引物-ghpap1d)

<400>57

ctggctatgggttgaacaca20

<210>58

<211>21

<212>dna

<213>人工序列(引物s307f定量引物-ghhy5(gh_d08g2461))

<400>58

atgcagctgatggaacccttt21

<210>59

<211>24

<212>dna

<213>人工序列(引物s307r定量引物-ghhy5(gh_d08g2461))

<400>59

gagagaaccaaagttccaattgtc24

<210>60

<211>22

<212>dna

<213>人工序列(引物y8991f定量引物-（histone-3）)

<400>60

cggtggtgtgaagaagcctcat22

<210>61

<211>24

<212>dna

<213>人工序列(引物y8991r定量引物-（histone-3）)

<400>61

aatttcacgaacaagcctctggaa24

<210>62

<211>22

<212>dna

<213>人工序列(引物s213f定量引物-gus)

<400>62

atccggtcagtggcagtgaagg22

<210>63

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(引物s213r定量引物-gus)

<400>63

cagcgtaagggtaatgcgag20

<210>64

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(引物s214f烟草内标引物-ef1a)

<400>64

acaagatggatgctaccacc20

<210>65

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(引物s214r烟草内标引物-ef1a)

<400>65

aaccagagatggggacaaag20

<210>66

<211>25

<212>dna

<213>人工序列(引物s173fcds序列克隆-gobrpa-118)

<400>66

atggtagtgaaagtgtatggtccaa25

<210>67

<211>23

<212>dna

<213>人工序列(引物s173rcds序列克隆-gobrpa-118)

<400>67

ggtgatcaataattagcgagctt23

<210>68

<211>24

<212>dna

<213>人工序列(引物s176fcds序列克隆-gobrpa-hb118)

<400>68

agaatggtagtgaaagtgtatggt24

<210>69

<211>24

<212>dna

<213>人工序列(引物s176rcds序列克隆-gobrpa-hb118)

<400>69

agctacatggtaacttttaattcg24

<210>70

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(引物r5fcds序列克隆-gh_a07g0669)

<400>70

aatcattgggccggcatcta20

<210>71

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(引物r5fcds序列克隆-gh_a07g0669)

<400>71

ccatctcttcggcacacaga20

<210>72

<211>23

<212>dna

<213>人工序列(引物s289fcds序列克隆-ghpap1)

<400>72

acagcttttatatggaaggctca23

<210>73

<211>21

<212>dna

<213>人工序列(引物s289rcds序列克隆-ghpap1)

<400>73

tttctggctatgggttgaaca21

<210>74

<211>22

<212>dna

<213>人工序列(引物s305fcds序列克隆-ghhy5)

<400>74

acgaagaaatgcaagaacaagg22

<210>75

<211>25

<212>dna

<213>人工序列(引物s305rcds序列克隆-ghhy5)

<400>75

agagagaaccaaagttccaattgtc25

<210>76

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(引物s128f启动子序列克隆-gobrpa)

<400>76

atgccctcttcgtcacttgg20

<210>77

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(引物s128r启动子序列克隆-gobrpa)

<400>77

taccctttgagggcaagctg20

<210>78

<211>43

<212>dna

<213>人工序列(引物s162f启动子活性分析-gobrpa-118)

<400>78

gaccatgattacgccaagcttgattatgccctcttcgtcactt43

<210>79

<211>43

<212>dna

<213>人工序列(引物s162r启动子活性分析-gobrpa-118)

<400>79

accacccggggatcctctagacattcttaaattttattattat43

<210>80

<211>43

<212>dna

<213>人工序列(引物s163f启动子活性分析-gobrpa-hb118)

<400>80

gaccatgattacgccaagcttgattatgccctcttcgtcactt43

<210>81

<211>43

<212>dna

<213>人工序列(引物s163r启动子活性分析-gobrpa-hb118)

<400>81

accacccggggatcctctagacattcttaatttattattatta43

<210>82

<211>42

<212>dna

<213>人工序列(引物s311fpbi121载体构建-gobrpa-118)

<400>82

gagaacacgggggactctagaatggtagtgaaagtgtatggt42

<210>83

<211>42

<212>dna

<213>人工序列(引物s311rpbi121载体构建-gobrpa-118)

<400>83

cgatcggggaaattcgagctctcaataattagcgagcttcat42

<210>84

<211>42

<212>dna

<213>人工序列(引物s312fpbi121载体构建-gobrpa-hb118)

<400>84

gagaacacgggggactctagaatggtagtgaaagtgtatggt42

<210>85

<211>42

<212>dna

<213>人工序列(引物s312rpbi121载体构建-gobrpa-hb118)

<400>85

cgatcggggaaattcgagctctcaataattagcgagcatcat42

<210>86

<211>28

<212>dna

<213>人工序列(引物s273f共分离snp标记)

<400>86

aaactcattggaagaacgagcaatggaa28

<210>87

<211>27

<212>dna

<213>人工序列(引物s273r共分离snp标记)

<400>87

ttccaagcagctcggttagaaatggtc27