一种水稻抗纹枯病基因SBR11及其分子标记和应用

本发明属于作物分子生物学
技术领域：
，涉及一种水稻抗纹枯病基因sbr11及其分子标记和应用。
背景技术：
：水稻(oryzasatival.)是我国最重要的粮食作物。由强腐生性真菌立枯丝核菌(rhizoctoniasolanikühn)引起的水稻纹枯病是我国水稻三大病害之一。纹枯病由于其发生面积广、防治难度大，造成的产量损失位于水稻各病害之首。长期以来，对纹枯病的防治主要依赖于化学药剂，但效果一直不佳。推广和培育抗病品种是控制病害最经济有效的措施。水稻对纹枯病的抗性属于数量性状抗性，受多基因或qtl(quantitativetraitlocus)控制，克隆抗纹枯病相关基因具有重要的理论价值和实际意义。技术实现要素：本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的缺陷，提供一种稻抗纹枯病基因sbr11及其分子标记和应用，本发明通过遗传转化证实了sbr11基因正调控水稻对纹枯病的抗性。通过等位基因功能和单倍型分析，证实了该基因编码区190，926位点snp导致基因功能变异，进而本发明也开发了两个分子标记用于检测这两个位点基因型。本发明的技术方案为：本发明的目的之一为提供一种水稻抗纹枯病基因sbr11，其为以下任一：(1)所述sbr11的全长序列如seqidno.1所示；或(2)seqidno.1所示核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或几个核苷酸编码相同功能蛋白的基因；或(3)所述sbr11的全长序列为seqidno.1所示序列的第190位碱基由t变为a；或(4)所述sbr11的全长序列为seqidno.1所示序列的第926位碱基由g变为a；或(5)所述sbr11的全长序列为seqidno.1所示序列的第1492位碱基由a变为g。本发明的目的之二为提供上述的水稻抗纹枯病基因sbr11编码的蛋白质，所述蛋白质的氨基酸序列具有：(1)如seqidno.2所示的氨基酸序列；或(2)seqidno.2所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸且具有同等活性的由2)衍生的蛋白质。本发明的目的之三为提供含有上述水稻抗纹枯病基因sbr11的生物材料，所述生物材料为载体、转基因细胞系、工程菌、宿主细胞或表达盒。本发明的目的之四为提供上述的水稻抗纹枯病基因sbr11、蛋白质或生物材料在水稻抗纹枯病育种中的应用。本发明的目的之五为提供用于检测水稻抗纹枯病基因sbr11的分子标记，所述分子标记包括snp位点190和snp位点926，所述snp位点190位于sbr11编码区第190位碱基，该碱基snp变异，其多态性为t/a；所述snp位点926位于sbr11编码区第926位碱基，该碱snp变异，其多态性为g/a。上述的分子标记，所述snp位点190位于水稻第11号染色体第4851244位碱基，该snp位点190前后共176bp的序列如seqidno.3所示，第154bp的碱基即为snp位点19；所述snp位点926位于水稻第11号染色体第4851980位碱基，该snp位点926前后共262bp的序列如seqidno.4所示，第125bp的碱基即为snp位点926。本发明的目的之六为提供用于检测上述分子标记的引物组合，包括检测snp位点190和检测snp位点926的引物组；检测snp位点190的引物为primer190f、primer190r,所述primer190f的序列如seqidno.5所示,所述primer190r的序列如seqidno.6所示；检测snp位点926的引物为primer926f、primer926r,所述primer926f的序列如seqidno.7所示,所述primer926r的序列如seqidno.8所示。本发明的目的之七为提供检测水稻抗纹枯病基因sbr11的方法：通过核苷酸序列如seqidno.5和seqidno.6所示的引物对样品基因组dna进行pcr扩增，利用限制性内切酶pvuii酶切pcr扩增产物，酶切产物在浓度为4％的琼脂糖凝胶电泳中检测；若电泳结果出现一条176bp的特征条带，则待测水稻在snp190处碱基与sbr11抗病等位基因sbr11一致；若电泳结果出现一条155bp的特征条带，则待测水稻在snp190处碱基与sbr11感病等位基因sbr11一致；通过核苷酸序列如seqidno.7和seqidno.8所示的引物对样品基因组dna进行pcr扩增，利用限制性内切酶ddei酶切pcr扩增产物，酶切产物在浓度为4％的琼脂糖凝胶电泳中检测；若电泳结果出现两条分别为124bp和140bp的特征条带，则待测水稻在snp926处碱基与sbr11抗病等位基因sbr11一致；若出现一条262bp的特征条带，则待测水稻在snp190处碱基与sbr11感病等位基因sbr11一致；只有该样品基因组在snp190和snp926处都与sbr11抗病等位基因sbr11一致，才可以判断该样品中含有sbr11抗病等位基因sbr11，否则该样品中含有sbr11感病等位基因sbr11。本发明的目的之八为提供上述的分子标记、引物组合或检测方法在检测水稻抗纹枯病基因sbr11中的应用。本发明所达到的有益效果：本发明克隆了水稻抗纹枯病基因sbr11，并通过遗传转化验证了该基因的功能：利用超表达技术增强sbr11基因的表达量以及利用rnai技术降低sbr11基因的表达量，证实了该基因可以显著提高水稻对纹枯病抗性。本研究还分析了sbr11的抗感等位变异类型并开发了识别抗病等位基因的功能标记。利用该标记可以检测sbr11等位基因并进行选择，为水稻抗病分子设计育种提供更多的资源，加快育种进程。附图说明图1为sbr11超量表达材料(sbr11oe)的大田抗性鉴定结果；图2为sbr11干扰材料(sbr11rnai)的大田抗性鉴定结果；图3为sbr11互补材料(sbr11cp)的大田抗性鉴定结果；图4为sbr11启动子和编码区在teqing(tq)和lemont(le)中的序列变异示意图；图5为le和nil在接种纹枯病后sbr11的表达量情况；图6为过表达sbr11和sbr11编码区的转基因植株的大田抗性鉴定结果；图7为过表达sbr11和sbr11编码区的转基因植株的温室抗性鉴定结果；图8为分别将sbr11中64，309，498位点改变后，再用ubiquitin启动子驱动转入感病等基因系nil的转基因植株温室抗性鉴定结果；图9为8个品种中sbr11第64、309位点的dcaps分子标记检测情况，第64位点处为snp190，第309位点处为snp926。具体实施方式下面结合附图对本发明作进一步描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，而不能以此来限制本发明的保护范围。实施例1、候选基因的验证本实施利用le和tq构建的近等基因系,在le第11号染色体上检测到一个抗纹枯病候选基因sbr11。为了验证该基因的功能，本发明构建了sbr11超表达(sbr11oe)和rnai载体(sbr11rnai)，将sbr11-oe载体转入感病近等基因系nil-sbr11tq(nil)中,将sbr11rnai载体转入le中。大田抗性鉴定结果显示，与对照相比，sbr11oe转基因系对纹枯病的抗性显著增加(图1)，sbr11rnai转基因系对纹枯病的抗性显著降低(图2)。从le中克隆了sbr11的全长基因，并将其转入感病近等基因系nil中，同时设置了空载对照(#8)。对获得的8个独立转化系(含1个空载对照)进行纹枯病菌接种鉴定。结果显示(图3)，有4个系的抗性显著高于感病对照nil及空对照，且其中有2个系(#2和#4)的表型与携带sbr11的野生型对照le基本相当。以上结果都证明了sbr11正调控水稻对纹枯病的抗性。实施例2、sbr11功能分析sbr11的抗病等位基因(sbr11)来自le,籼稻品种tq在该座位上携带的是感病等位基因(sbr11)。测序结果显示(图4)，sbr11在抗、感等位基因供体亲本之间不仅在atg上游2kb内存在11个snp差异，在编码区也存在5个突变，其中第190，926和1492处为有义突变。sbr11在纹枯病菌侵染后的诱导表达水平明显高于sbr11(图5)。为了验证sbr11的基因功能，本发明将两个等位基因sbr11、sbr11的编码区分别用过表达启动子ubiquitin驱动，转入感病近等基因系nil中。对转基因系进行纹枯病菌温室离体接种(图6)和大田接种鉴定(图7)。结果显示，与对照相比，过表达sbr11编码区的转基因植株的抗性显著增加，而过表达sbr11编码区的转基因植株抗性无显著变化。表明sbr11与sbr11间的功能差异主要由于编码区变异所致。由于le和tq编码区存在3个氨基酸的差异，本发明分别扩增了sbr11中第190,926,1492个碱基发生改变的dna序列，即其中64，309，498个氨基酸分别变为tq型，具体的氨基酸改变情况如表1所示。用ubiquitin启动子驱动后，利用农杆菌介导法转入感病近等基因系nil中。温室接种鉴定结果显示(图8)，nil-sbr11oe转基因植株对纹枯病的抗性显著高于野生型nil，当第64位氨基酸由c变为s，或第309位氨基酸由s变为n时，转基因材料的抗性显著降低，而第498位氨基酸无论是k还是e，都不影响水稻对纹枯病的抗性。因此推测，第64，309位氨基酸影响sbr11对纹枯病的抗性。表1氨基酸改变情况64309498tq丝氨酸s天冬氨酸n谷氨酸ele半胱氨酸c丝氨酸s赖氨酸k实施例3、分子标记的开发本发明针对snp190和snp926碱基变异开发了dcaps标记用于基因选择，这两个dcaps标记具体信息如下：snp190：位于水稻第11号染色体第4851244位碱基，即sbr11基因第190个碱基，分子标记多态性为t/a，该snp位点前后共176bp的序列如seqidno.3所示，第154bp的碱基即为snp位点190；sbr11抗病等位基因在该位点的碱基为t，不会被限制性内切酶pvuii识别，扩出片段大小为176bp。感病等位基因sbr11在该位点的碱基为a，会被限制性内切酶pvuii识别，切掉21bp的片段，只剩155bp的片段。snp926：位于水稻第11号染色体第4851980位碱基，即sbr11基因第926个碱基，分子标记多态性为g/a，该snp位点前后共262bp的序列如seqidno.4所示，第125bp的碱基即为snp位点926；sbr11抗病等位基因在该位点的碱基为g，会被限制性内切酶ddei识别，被切成124bp和140bp的片段；感病等位基因sbr11在该位点的碱基为a，不会被限制性内切酶ddei识别，仍为262bp。只有当snp160和snp926位点处，全部为抗纹枯病纯合基因型，才可判定该待检样品为抗纹枯病基因型。只要有任意一处位点与感病基因型一致，则直接判定该待检样品为感纹枯病基因型。检测snp位点190的引物为primer190f、primer190r,primer190f的序列如seq.id.no.5所示,primer190r的序列如seq.id.no.6所示，使用的限制性内切酶为pvuii；检测snp位点926的引物为primer926f、primer926r,primer926f的序列如seq.id.no.7所示,primer926r的序列如seq.id.no.8所示，使用的限制性内切酶为ddei。实施例4、分子标记的应用(1)提取待测水稻基因组dna待测水稻样品共8份，提取水稻基因组dna，检测dna浓度，以确保a260/280介于1.8-2.0之间。(2)pcr扩增：pcr体系(20ul)：dna模板:20ng；f引物(10um):0.5ul；r引物(10um):0.5ul；dntp(2mm):2ul；mg2+(2.5mm):1.2ul；10xpcrbuffer:2ul；taq酶:0.2ul；ddh2o:补足至20ul。pcr扩增程序：94℃预变性5min后，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，38个循环后，72℃保持10min，后置于4℃保存待检测。(3)酶切：酶切体系共10ul:5ulpcr产物，10xbuffer1ul，内切酶0.3ul，ddh2o补足至10ul。(4)对8份待测水稻样品和2份对照(le和tq)进行pcr扩增，酶切后在浓度为4％的琼脂糖凝胶电泳中检测。snp190：若电泳结果出现一条176bp的特征条带，则待测水稻在snp190处碱基与sbr11抗病等位基因sbr11一致(即le中所带等位基因)；若电泳结果出现一条155bp的特征条带，则待测水稻在snp190处碱基与sbr11感病等位基因sbr11一致(即tq中所带等位基因)；snp926：若电泳结果出现两条分别为124bp和140bp的特征条带，则待测水稻在snp190处碱基与sbr11抗病等位基因sbr11一致(即le中所带等位基因)；若出现一条262bp的特征条带，则在snp190处碱基与sbr11感病等位基因sbr11一致(即tq中所带等位基因)。只有该样品基因组在snp190和snp926处都与sbr11抗病等位基因sbr11一致，才可以判断该样品中含有sbr11抗病等位基因sbr11，否则该样品中含有sbr11感病等位基因sbr11。结果如图9所示，snp190标记中，1、2、3、4号样品的条带为155bp，则可以得出1、2、3、4号样品在snp190处碱基与sbr11感病等位基因sbr11一致，5、6、7、8号样品的条带为176bp，则可以得出5、6、7、8号样品在snp190处碱基与sbr11抗病等位基因sbr11一致。snp926标记中，1、2、3、4、5、7号样品出现一条262bp，则可以得出1、2、3、4、5、7号样品在snp190处碱基与sbr11感病等位基因sbr11一致，6、8号样品出现两条分别为124bp和140bp的特征条带，则可以得出6、8号样品在snp190处碱基与sbr11抗病等位基因sbr11一致。综上可得出6、8号样品含有sbr11抗病等位基因sbr11，1、2、3、4、5、7号样品含有sbr11感病等位基因sbr11。snp190和snp926标记在这些品种中具有多态性，带型清晰，多态性明显，扩增片段大小适中，说明开发的标记可成功检测水稻不同品种中sbr11的基因变异。本发明可以快速预测水稻植株对纹枯病的抗性，加快抗纹枯病水稻材料的选择进度。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变形，这些改进和变形也应视为本发明的保护范围。序列表<110>扬州大学<120>一种水稻抗纹枯病基因sbr11及其分子标记和应用<160>8<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>1884<212>dna<213>水稻(oryzasatival.)<400>1atggaggtgatgagtcggcaccatgctcccgatagaagcctgtgcttactgttactgctg60ctgttcttgcttcttggtgtgcccatggcagcgtccaccgaacaatcgccagcgcgactg120aacaaggcacacgaggacatcatgcgagatattctgagctcggtgggcagtaccaagaac180tggaacacctgctcaaatccatgccaatggagtggtgttcattgctcttcagttgcatcc240tctgcgtttgtcactaggctatccctccccggatgtggcctctccaatgccaccatcctt300gcgtccatatgcaatcttcataccttgcgatctcttaacctctcgagaaactcgttcacc360gatttgccaagccaactctctccgtgccccatgaaggctgaattgcaagtgctggatctc420agtagcaatatgctgtctggtcaacttggtgatttcgttggttttcacaagctcgaggtt480cttgatttgtcctccaactctttaaatggcaatataagtacccagctgagtgatttgcca540aaactgagaagcttgaaccttagttccaatggttttgaaggcccagtccctacaagcatc600gctacctctctggaagacctcgtgctctcgggtaataatttcagtgatcatattccaatg660ggtttgttcaggtatggaaatcttactctgttggatctctgccgcaataatctacacggt720gatgtcccagatggcttcttgagcttcccaaaactcaggattttggtcctttcagaaaac780aacctgacaggaaaaattccacggagcttgctgaatgtcaccacactgtttcggtttgga840ggtaatcagaataattttgttggctcaattcctcaaggaattaccaggaacattaggatg900ttggatttgagttacaacatgctcagtggtgatataccctctgaactgctctcacctgat960actttggagaccattgacctcactgcaaataggcttgaagggttcatccctgggaatgtt1020tctcggagcctccatagtattcggcttggtcgaaacttgctcggtggaagcatcccagaa1080tcaataggcaatgccattgacttggttaatcttctgttagatggcaataagttggttgga1140tatataccttggcagctcagcagatgcaagaacttggcactcatcgatctgtcatcaaac1200caggtgcagggtaatatacctattgggctgggcaaccttgagcagctcgtagtcttgaag1260ctccaaaagaacaatctcagtggagatatcccaagttcattttctgacatgtcagccctg1320gaaatacttaacctgagtcataactcattcactggagaactacctttcacaaattctact1380cagtcactgaagctctgctacttaggtttgcatggcaacaagctcaatggtgtgattcca1440tcgtcgatcagcttgctgcagtctctgatcaccattgatctggggaacaataagttgatt1500ggaattatccccacaaacattggaacctttctgaagttggagcgtcttgatctttcaaaa1560aactacttgtcaggtcaggtgccatcctcagttgcaaacctggaaagattaatgtgtcta1620ttcctttcagacaataacctttccggaccattgcctgagctacctaaatgggtgatggtc1680aatgtaactggaaatccaggcatcatactagacacggaagaaaatagaacttcaggcagt1740atgaaaggctcccaggatgatttcagatcagctatatgggtcgcagcagcttcttttgta1800cttggattcagcttgtccttctattgggctggaccaggggaaaaattgatgccaaggttg1860gagactcttcactgtgacgattga1884<210>2<211>627<212>prt<213>水稻(oryzasatival.)<400>2metgluvalmetserarghishisalaproaspargserleucysleu151015leuleuleuleuleupheleuleuleuglyvalprometalaalaser202530thrgluglnserproalaargleuasnlysalahisgluaspilemet354045argaspileleuserservalglyserthrlysasntrpasnthrcys505560serasnprocysglntrpserglyvalhiscysserservalalaser65707580seralaphevalthrargleuserleuproglycysglyleuserasn859095alathrileleualaserilecysasnleuhisthrleuargserleu100105110asnleuserargasnserphethraspleuproserglnleuserpro115120125cysprometlysalagluleuglnvalleuaspleuserserasnmet130135140leuserglyglnleuglyaspphevalglyphehislysleugluval145150155160leuaspleuserserasnserleuasnglyasnileserthrglnleu165170175seraspleuprolysleuargserleuasnleuserserasnglyphe180185190gluglyprovalprothrserilealathrserleugluaspleuval195200205leuserglyasnasnpheserasphisileprometglyleuphearg210215220tyrglyasnleuthrleuleuaspleucysargasnasnleuhisgly225230235240aspvalproaspglypheleuserpheprolysleuargileleuval245250255leusergluasnasnleuthrglylysileproargserleuleuasn260265270valthrthrleupheargpheglyglyasnglnasnasnphevalgly275280285serileproglnglyilethrargasnileargmetleuaspleuser290295300tyrasnmetleuserglyaspileprosergluleuleuserproasp305310315320thrleugluthrileaspleuthralaasnargleugluglypheile325330335proglyasnvalserargserleuhisserileargleuglyargasn340345350leuleuglyglyserileprogluserileglyasnalaileaspleu355360365valasnleuleuleuaspglyasnlysleuvalglytyrileprotrp370375380glnleuserargcyslysasnleualaleuileaspleuserserasn385390395400glnvalglnglyasnileproileglyleuglyasnleugluglnleu405410415valvalleulysleuglnlysasnasnleuserglyaspileproser420425430serpheseraspmetseralaleugluileleuasnleuserhisasn435440445serphethrglygluleuprophethrasnserthrglnserleulys450455460leucystyrleuglyleuhisglyasnlysleuasnglyvalilepro465470475480serserileserleuleuglnserleuilethrileaspleuglyasn485490495asnlysleuileglyileileprothrasnileglythrpheleulys500505510leugluargleuaspleuserlysasntyrleuserglyglnvalpro515520525serservalalaasnleugluargleumetcysleupheleuserasp530535540asnasnleuserglyproleuprogluleuprolystrpvalmetval545550555560asnvalthrglyasnproglyileileleuaspthrglugluasnarg565570575thrserglysermetlysglyserglnaspasppheargseralaile580585590trpvalalaalaalaserphevalleuglypheserleuserphetyr595600605trpalaglyproglyglulysleumetproargleugluthrleuhis610615620cysaspasp625<210>3<211>176<212>dna<213>水稻(oryzasatival.)<400>3agcctgtgcttactgttactgctgctgttcttgcttcttggtgtgcccatggcagcgtcc60accgaacaatcgccagcgcgactgaacaaggcacacgaggacatcatgcgagatattctg120agctcggtgggcagtaccaagaactggaacacctgctcaaatccatgccaatggag176<210>4<211>262<212>dna<213>水稻(oryzasatival.)<400>4cggagcttgctgaatgtcaccacactgtttcggtttggaggtaatcagaataattttgtt60ggctcaattcctcaaggaattaccaggaacattaggatgttggatttgagttacaacatg120ctcagtggtgatataccctctgaactgctctcacctgatactttggagaccattgacctc180actgcaaataggcttgaagggttcatccctgggaatgtttctcggagcctccatagtatt24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