一种三七WRKY转录因子基因PnWRKY15及应用

本发明涉及分子生物学以及基因工程相关技术研究领域，特别是一种具有抗真菌侵染能力的三七wrky转录因子基因pnwrky15及应用。

背景技术：

植物在生长发育过程中，经常遭遇来自外界的各种自然灾害和病虫害，从而导致生长发育不良，生长受阻、产量减少甚至死亡。当植物面对病原物入侵或其它逆境时，会以一种高度可变且时序性的方式对转录组进行大规模重新编程以应对胁迫，而这种赋予植物对不同环境条件具有可塑性适应的调控反应是多种转录因子网络作用的结果。转录因子（transcriptionfactor，tf）是一类能够结合在基因上游特异序列，并调控基因转录的蛋白质。植物体内有bhlh、bzip、zinc-finger、myb等多种转录因子蛋白家族，其中wrky转录因子备受瞩目。

wrky转录因子是植物特有的一类转录因子家族，作为一类dna结合蛋白，是植物最大的转录因子家族之一。编码wrky蛋白的第一个cdna是从甘薯（ipomoeabatatas）中克隆的。目前已经从拟南芥(arabidopsisthaliana)，大麦（hordeumvulgare），烟草（nicotianatabacum）等多种植物中分离了大量wrky基因。每个wrky转录因子的蛋白序列含都有一至三个保守结构域，该保守结构域大小约为60个氨基酸，在n末端具有一段高度保守的‘wrkygqk’七肽序列，在c端具有高度保守的锌指结构基序cx4-7-cx23-28-hx1-2-(h/c)。wrky转录因子的dna结合结构域通常与包含((c/t)tgac(c/t))基序的顺式作用元件w-box结合（jiangj，mas，yen,etal.wrkytranscriptionfactorsinplantresponsestostresses.journalofintegrativeplantbiology,2017,59(2):86-101.）。

wrky蛋白可以与其靶基因启动子中的w-box元件结合，并激活或抑制下游基因的表达，或与其他转录因子相互作用从而调节植物的抗病防卫反应（jiangj,mas,yen,etal.wrkytranscriptionfactorsinplantresponsestostresses:wrkyinplantresponsestostresses.journalofintegrativeplantbiology,2017,59(2):86-101;hussainr,sheikha,haideri,etal.arabidopsiswrky50andtgatranscriptionfactorssynergisticallyactivateexpressionofpr1.frontiersinplantscience,2018,9:930.）。tgac是w-box的核心序列，且高度保守，一旦其中某一核苷酸发生改变都会导致wrky蛋白与之结合的能力的降低，甚至丧失(谢政文,王连军,陈锦洋,等.植物wrky转录因子及其生物学功能研究进展.中国农业科技导报,2016,18(3):46-54.)。

wrky转录因子通过调控植物转录组重新编程以应对不同病原物的入侵，其对抗病反应相关基因的转录调控是植物对病原体防卫反应的关键组成部分，在植物防卫反应中起重要作用。植物中的wrky基因家族包含许多调节植物生长和发育以及防卫反应的成员(wuzj,lixh,liuzw,etal.transcriptome-wideidentificationofcamelliasinensiswrkytranscriptionfactorsinresponsetotemperaturestress.molgenetgenomics,2016,291(1):255-269.)。例如在草莓fawrky1负调控果实对炭疽菌(colletotrichumacutatum)的抗性(higuerajj,garrido-galaj,lekhboua,etal.thestrawberryfawrky1transcriptionfactornegativelyregulatesresistancetocolletotrichumacutatuminfruituponinfection.frontplantsci,2019,10:480.)。此外，水杨酸介导的活性氧信号传导增强了jcwrky转基因烟草对苜蓿炭腐病病原菌的抗性(agarwalp,patelk,agarwalpk.ectopicexpressionofjcwrkyconfersenhancedresistanceintransgenictobaccoagainstmacrophominaphaseolina.dnacellbiol,2018,37(4):298-307.)。

三七(panaxnotoginseng)为五加科人参属多年生草本植物，是云南省的重要中药材，具有消肿定痛、活血散瘀、止血补血、提高机体免疫力等功效，药用价值极高，市场需求量日益增加。但三七生长周期长，性喜温暖阴湿，病害严重，特别是真菌病害，严重危害三七产量和药材的品质。wrky参与应答多种生物和非生物胁迫，是植物防御系统的重要组成部分，因此对三七中wrky转录因子基因的发掘以及功能分析具有重要的研究及其应用价值。

技术实现要素：

本发明目的是提供一种三七wrky转录因子基因pnwrky15及其在提高烟草对厚垣镰刀菌（fusariumchlamydosporum）和致密链格孢（alternariacompacta）抗性中的应用。

本发明从三七中克隆获得的具有抗真菌活性的wrky转录因子的全长基因，wrky转录因子基因pnwrky15核苷酸序列如seqidno:1所示，该基因cdna全长序列为960bp，包含一个420bp的开放阅读框、214bp的5’非翻译区、326bp的3’非翻译区，编码如seqidno:2所示氨基酸序列的蛋白质。

本发明中pnwrky15基因的编码区是序列表seqidno:1中第215-634位所示的核苷酸序列。

本发明分离克隆三七的一个抗真菌相关基因的完整cdna片段，利用根癌农杆菌(agrobacteriumtumefaciens)介导将目的基因转入受体植物中并过量表达，通过进一步实验验证该基因是否具有抗真菌的活性，为后期利用该基因改良烟草及其他植物抵御真菌病害的能力奠定基础，发明人将这个基因命名为pnwrky15。

上述pnwrky15基因可以应用于提高烟草的抗真菌特性，具体操作如下：

（1）采用扩增pnwrky15的特异引物，从三七根中提取总rna，通过逆转录-聚合酶链式反应(reversetranscription-polymerasechainreaction，rt-pcr)扩增出pnwrky15的编码区，然后将其连接到pgem-t载体上，经测序获得具有目的基因的克隆；

（2）用限制性内切酶ecorⅰ和bamhⅰ酶切pgem-t-pnwrky15载体，通过胶回收得到目的基因片段，用同样的内切酶酶切植物表达载体pcambia2300s，胶回收获得所需载体大片段，再将所获得pnwrky15基因片段与pcambia2300s片段连接，构建植物超表达载体，之后将所构建的重组载体通过根癌农杆菌介导转入烟草中表达；

（3）以重组载体t-dna上具有的抗性标记筛选转化子，并通过pcr以及rt-pcr检测得到真正的转基因植株，分析转基因植株叶片抑制真菌生长的能力，最后筛选出对真菌抗性明显增强的转基因植株。

本发明为提高植物对真菌病害的抗性提供了一种新的方法，通过基因工程手段培育抗病植物可以克服传统育种的不足，不仅育种周期缩短，而且操作简单，容易获得高抗材料。本发明来自三七的pnwrky15基因能增强植物对真菌的抗性，将该基因导入烟草中，可以产生具有真菌抗性的新品种和新材料。利用基因工程技术培育抗性植物品种和材料具有明显的优势和不可取代的重要性；它不仅可以为大规模生产农作物、药材、园艺植物等提供方便，大量减少化学农药的使用，还可以为农业生产节约成本、减小环境污染，因此本发明具有广阔的市场应用前景。

附图说明

图1是本发明pnwrky15转基因烟草基因组dna的pcr检测结果图，图中：marker为dl15000dnamarker(大连宝生物)；阳性对照为质粒pgem-t-pnwrky15为模板的pcr产物；wt为非转基因烟草(野生型)总dna为模板的pcr产物；

图2是本发明阳性pnwrky15转基因烟草中pnwrky15转录水平的表达分析结果图；图中：marker是dl15000dnamarker(大连宝生物)；wt是非转基因烟草总rna逆转录cdna为模板的pcr产物；阳性对照是质粒pgem-t-pnwrky15为模板的pcr产物；

图3是本发明pnwrky15转基因烟草对两种病原真菌的抑制活性分析结果；图中a、b分别是转基因烟草叶片总蛋白对厚垣镰刀菌、致密链格孢的抑制效果；wt为野生型烟草，3、15、22为pnwrky15转基因烟草；buffer为空白对照，即无蛋白对照(用于提取蛋白的缓冲液)。

具体实施方式

下面通过附图和实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明保护范围不局限于所述内容，实施例中方法如无特殊说明均为常规方法，使用的试剂如无特殊说明均为常规市售试剂或按常规方法配制的试剂。

实施例1：pnwrky15全长基因克隆以及序列分析

取一年生三七的根部提取总rna，用液氮将三七根研磨成粉末，然后转入离心管中，采用异硫氰酸胍法提取总rna，采用逆转录酶m-mlv(promega)以总rna为模板合成cdna第一链，反应体系和操作过程为：取5μgtotalrna，依次加入50ngoligo（dt）、2μldntp（2.5mmeach）、depc水加至反应体积为14.5μl；混匀后，70℃加热变性5min后迅速在冰上冷却5min，然后依次加入4μl5×first-standbuffer、0.5μlrnasin（200u）、1μlm-mlv（200u），混匀并短时离心，42℃温浴1.5h，取出后70℃加热10min，终止反应；cdna第一链合成后置于-20℃保存备用。

以合成的第一链cdna为模板，扩增目的基因pnwrky15，所用上下游引物序列分别为5’atgactgatacttctcccaagtct3’及5’tcatgcatgcctcctaaggg3’。采用advantage^tm2pcrenzyme（clontech）扩增出目的基因；pcr反应条件：95℃5min；94℃30s，60℃30s，72℃50s，32个循环；72℃7min；反应体系（20μl）为0.5μlcdna、2μl10×advantage2pcrbuffer、0.4μl50×dntpmix（10mmeach）、0.4μl正向引物（10μm）、0.4μl反向引物（10μm）、0.4μladvantage2pcrpolymerasemix、15.9μlpcr-gradewater；pcr结束后，取5μl用于琼脂糖凝胶电泳，以检测扩增产物的特异性以及大小。

对pcr产物进行ta克隆，使用的试剂盒为pgem-teasyvectorsystemi（promega,usa），反应体系和操作过程为：取1.5μlpcr产物，依次加入1μlpgem-tvector（50ng/μl）和2.5μl2×ligationsolutioni，混匀后置于16℃过夜反应。采用热激转化法将连接产物转入大肠杆菌dh5α中。使用含有氨苄青霉素（ampicillin，amp）的lb固体培养基筛选阳性克隆，挑选若干个单菌落，摇菌后用扩增pnwrky15的特异引物鉴定出多克隆位点插入pnwrky15的克隆，将所鉴定的克隆进行测序，最终获得的pnwrky15全长cdna为960bp，通过ncbiorffinder（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html）分析发现其包含一个420bp的开放读码框（见序列表），pnwrky15编码一个含139个氨基酸的蛋白质，其分子量约为15.87kda，等电点约为7.51，且具有1个wrkygqk保守结构域。

实施例2：植物超表达载体构建

采用sanprep柱式质粒dna小量抽提试剂盒（上海生工）提取插入pnwrky15的大肠杆菌质粒pgem-t-pnwrky15以及植物表达载体pcambia2300s的质粒，取1μl用于琼脂糖凝胶电泳以检测所提取质粒的完整性及浓度高低；用限制性内切酶ecorⅰ（takara）和bamhⅰ（takara）分别对质粒pgem-t-pnwrky15和pcambia2300s进行双酶切（100μl体系），反应体系和操作过程为：分别取20μlpgem-t-pnwrky15和pcambia2300s质粒、依次加入10μl10×hbuffer、5μlecori、5μlbamhi、60μlddh2o，混匀后短时离心，置于37℃过夜反应。将所有酶切产物点于琼脂糖凝胶中进行电泳，然后对pnwrky15片段和pcambia2300s载体大片段分别进行胶回收，整个过程使用sanprep柱式dna胶回收试剂盒（上海生工）；取1μl回收产物通过琼脂糖凝胶电泳检测回收片段的大小以及浓度，置于-20℃保存备用。

利用t4dnaligase（takara），将回收的pnwrky15dna片段和pcambia2300s载体片段连接起来，反应体系（20μl）和操作过程为：取10μlpnwrky15dna片段依次加入2μlpcambia2300s载体dna、2μl10×t4dnaligasebuffer、1μlt4dnaligase、5μlddh2o，混匀后短时离心，然后16℃水浴过夜反应。接着采用热激转化法将连接产物转入大肠杆菌dh5α中，用含有50mg/l卡那霉素（kanamycin，km）的固体培养基筛选阳性克隆。挑选单菌落摇菌，以菌液为模板用扩增pnwrky15的特异引物进行pcr，挑选出pnwrky15与pcambia2300s成功连接的克隆，所检测的菌株若为阳性，加入甘油并置于-80℃保存备用。

提取并纯化上述大肠杆菌中的pcambia2300s-pnwrky15质粒。随后用液氮冻融法将上述构建的植物表达载体pcambia2300s-pnwrky15转入根癌农杆菌lba4404感受态细胞中。操作步骤为：取2μgpcambia2300s-pnwrky15质粒加入含有200μl感受态细胞的离心管中，轻轻混匀后冰浴5min，随后转入液氮中冷冻1min，然后迅速置于37℃水浴5min，之后立即冰浴2min，加入800μllb液体培养基于28℃振荡培养4h。将活化后的农杆菌涂于含有50mg/lkm的lb固体培养基上，28℃静止培养。挑选单菌落摇菌，再用扩增pnwrky15的特异性引物进行pcr，检测pcambia2300s-pnwrky15是否转入农杆菌中，对于阳性克隆，加入甘油后置于-80℃保存备用。

实施例3：农杆菌介导的植物遗传转化以及转基因植物筛选

本实验的转基因受体是烟草(nicotianatabacum)，将烟草种子用75%的酒精浸泡30s，用无菌水洗涤后用0.1%的hgcl2浸泡8min，然后再用无菌水洗涤若干次，播种于1/2ms培养基上，28℃暗培养6d，发芽后转至光照培养箱（25℃，16h/d光照），以后每月用ms培养基继代一次。

从-80℃冰箱中取出保存的含有pcambia2300s-pnwrky15质粒的农杆菌lba4404菌种，接种于5ml含有50mg/lkm和20mg/l利福平的lb液体培养基中，28℃培养至培养基浑浊。吸取1ml浑浊的菌液至含有50mg/lkm的lb固体培养基上，28℃培养48h；随后将lb固体培养基上的农杆菌刮下适量接种于附加有20mg/l的乙酰丁香酮的mgl液体培养基中，28℃振荡培养2-3h以活化农杆菌。

取烟草无菌苗叶片切成1cm²左右的叶盘，完全浸泡于上述含有活化农杆菌的mgl液体培养基中，浸染时间为15min，用无菌滤纸吸干叶片表面的菌液，将叶盘置于共培养基上进行室温培养，烟草转化的共培养基为ms+0.02mg/l6-ba+2.1mg/lnaa+30g/lsucrose+6g/l琼脂，22℃无光条件下共培养2天。

将共培养后的叶盘转到加有抗生素的ms筛选培养基中分化成苗，同时筛选转基因植株。烟草筛选培养基为ms+0.5mg/l6-ba+0.1mg/lnaa+30g/lsucrose+6g/l琼脂+50mg/lkm+200mg/l头孢霉素（cefotaximesodiumsalt，cef）；筛选培养时将培养瓶转移至光照培养箱培养（25℃，16h/d光照，8h/d黑暗），待烟草长出芽后用含有50mg/lkm和200mg/lcef的ms培养基继代培养。

采用ctab法提取转基因烟草植株叶片的基因组dna，取1μldna通过琼脂糖凝胶电泳检测其完整性和浓度，以转基因植株的基因组dna为模板用扩增pnwrky15的特异引物进行pcr，pcr结束后，取8μl产物用于琼脂糖凝胶电泳以检测阳性转基因植株，部分烟草转基因植株的扩增结果如图1所示，pnwrky15转基因烟草共筛选到39株阳性转基因植株。

实施例4：pnwrky15转基因烟草的表达分析以及抑菌活性分析

取阳性转基因单株以及非转基因烟草（野生型）的嫩叶提取总rna，逆转录生成第一链cdna，并以此为模板用扩增pnwrky15的特异引物进行pcr，分析各转基因单株中pnwrky15的表达水平，总rna提取以及rt-pcr的方法与实施例1中相同，pcr结束之后，取8μl用于琼脂糖凝胶电泳，部分单株的检测结果如图2所示，共检测到27个转基因单株中pnwrky15在转录水平大量表达，这些单株的编号为1～27。

将实验室保存的几种真菌接种于pda固体培养基(200g/l马铃薯，15g/l琼脂，20g/l葡萄糖)上，28℃暗培养，待菌落生长至直径约为2~3cm时添加蛋白，分析转基因植株叶片总蛋白对几种病原真菌的抑制活性。为了防止其它杂菌污染所提取的蛋白，整个植物蛋白提取过程均是无菌操作。首先取1g转基因烟草单株(编号分别为3、15、22)及野生型叶片放入研钵中，加入1ml蛋白提取液(1mnacl，0.1m乙酸钠，1%pvp（化学名称：聚乙烯吡咯烷酮），ph6.0)，充分研磨。转入1.5ml离心管中，混匀后4℃静置过夜。4℃离心30min(12,000g/min)，取上清于新的1.5ml离心管中，并取适量用紫外分光光度仪测定总蛋白浓度。将转基因和野生型植株的总蛋白浓度调整至0.2μg/μl，然后分别取20μl滴于各真菌培养基的无菌滤纸上。在每个真菌的平板上除了添加不同转基因烟草植株的总蛋白，同时平行添加野生型烟草的总蛋白和空白对照(蛋白提取液)。28℃培养几天后观察真菌生长的情况，并评价pnwrky15转基因烟草的抑菌活性，结果如图3所示，pnwrky15转基因烟草蛋白对厚垣镰刀菌和致密链格孢的生长具有明显的抑制作用。

序列表

<110>昆明理工大学

<120>一种三七wrky转录因子基因pnwrky15及应用

<160>4

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>960

<212>dna

<213>三七(panaxnotoginseng)

<400>1

tggaaaaaatcataaaggaaaggaggccaatccatcaaaagaaaatattttataatttcc60

agacacacagtctctcgatctctctctctcggtcacacagacacacagactctcgatctc120

tctctctcggtctttgtgtctagctaggttaaccaaaggtaggagctaggtaagtagatt180

cagaaagcagccacctaccatcagccatgagcccatgactgatacttctcccaagtctcc240

taacactgaagaatccacctctatggaatattcaagggaggaggaacaattagatataga300

tagaggagtactgagtaccaggttggtgctacccgaagatggtttcgaatggaggaaata360

tggacaaaagttcatcaaaaatattggaaaaacgaggagttatttcaaatgccaaaagag420

caattgtatagccaagaagaaagtggagtggtcagtctcagagcctggtaacctgaaaat480

tgtatatgaagcagaacacaatcatttatcccctcgagaaacttctaccactacaacagc540

agcaacagcaaatccatatgacttgttgactcaagttcttggagataatcaaacatcaac600

ttcttcttattattcccttaggaggcatgcatgatataaattgatcatttgaatatatat660

atatatatatatatatatatagggaacccttctctaacgaacttgtttgtcaacgaaccg720

gctaaggaacccttctctaacgaacctgtttgtcgatctatcgctatagtatagaaaaac780

gacgccaagactatgtcgacggttcgtactgttgttatagctctcagaaaatcaattttt840

ctatgatttaacgacgaatgaaccgtcgctttagtcaattcgtctttgattcacattttc900

tggttcgttagaaaaaatttccatatatatgtatatctttctttggtatatactagctct960

<210>2

<211>139

<212>prt

<213>三七(panaxnotoginseng)

<400>2

metthraspthrserprolysserproasnthrglugluserthrser

151015

metglutyrserarggluglugluglnleuaspileaspargglyval

202530

leuserthrargleuvalleuprogluaspglypheglutrparglys

354045

tyrglyglnlyspheilelysasnileglylysthrargsertyrphe

505560

lyscysglnlysserasncysilealalyslyslysvalglutrpser

65707580

valsergluproglyasnleulysilevaltyrglualagluhisasn

859095

hisleuserproarggluthrserthrthrthrthralaalathrala

100105110

asnprotyraspleuleuthrglnvalleuglyaspasnglnthrser

115120125

thrsersertyrtyrserleuargarghisala

130135

<210>3

<211>24

<212>dna

<213>人工序列(artificial)

<400>3

atgactgatacttctcccaagtct24

<210>4

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificial)

<400>4

tcatgcatgcctcctaaggg20