非洲猪瘟病毒P12蛋白纳米颗粒及其制备方法与应用与流程

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种非洲猪瘟病毒p12蛋白纳米颗粒及其制备方法与应用。

背景技术：

非洲猪瘟(africanswinefever，asf)是非洲猪瘟病毒(africanswinefevervirus，asfv)感染家猪或野猪引起的一种急性、出血性、高度接触性传染病，其特征是病程短、高热和出血性病变，急性感染死亡率高达100％，严重威胁全球养猪业。

20世纪60年代，人们最先开始尝试使用asf灭活疫苗，但是绝大部分无保护作用。2014年blome等利用最新的佐剂联合asf灭活疫苗免疫，仍然不能抵御强毒攻击。利用保护性抗原(p72、p54、cd2v等)制备的亚单位疫苗，免疫猪仅能提供部分的保护作用，联合使用免疫却不能提供保护作用。人们尝试使用保护性抗原表达的dna疫苗和利用病毒载体表达的病毒载体疫苗，免疫效果同亚单位疫苗相似，也只能提供部分保护或无保护作用。

asfv的基因组约170-193kb，含有150-167个开放阅读框(openreadingframes，orfs)，编码150-200种蛋白质，其中约50多种是病毒的结构蛋白。asfv病毒粒子为二十面体结构，直径约200nm，是由核壳蛋白包裹的病毒基因组dna、病毒内囊膜、病毒衣壳和外囊膜组成的。囊膜蛋白是构成病毒颗粒的主要结构蛋白，也是重要的表面抗原，与宿主细胞嗜性、致病性、免疫原性密切相关。根据目前的研究，已知功能的asfv囊膜蛋白主要有cd2v、p54、p12、p30、p17和p22等，然而，这些蛋白作为抗原免疫猪后，均不能获得有效的保护作用。例如，neilan等人将p22与p30、p54、p72蛋白作为抗原对猪进行“鸡尾酒”式混合免疫，也没有获得有效保护作用。

通过对现有技术进行讨论和分析，目前的非洲猪瘟病毒亚单位疫苗、核酸疫苗和病毒活载体疫苗的保护效力偏低。因此需要进一步研究非洲猪瘟病毒蛋白免疫原性，并利用新技术和新方法构建出安全有效的asf疫苗。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种非洲猪瘟病毒p12蛋白纳米颗粒及其制备方法与应用。本发明将gstp1-mt3蛋白与非洲猪瘟病毒的p12抗原进行融合表达，在毕赤酵母表达系统中，经亚铁离子的诱导，能够自发地形成蛋白纳米颗粒。通过在小鼠体内进行免疫原性测定，该p12蛋白纳米颗粒能引起很强的免疫反应，极有潜力开发成为新的安全有效的非洲猪瘟病毒疫苗。

为此，第一方面，本发明提供一种非洲猪瘟病毒p12蛋白纳米颗粒，所述蛋白纳米颗粒由蛋白质单体自组装形成，所述蛋白质单体为从氨基酸至羧基端依次包含金属硫蛋白、谷胱甘肽硫转移酶和p12蛋白的融合蛋白。

进一步，所述蛋白纳米颗粒由所述蛋白质单体经金属离子诱导而自组装形成，所述金属离子为fe²⁺。

金属硫蛋白是一类低分子量、高金属含量、富含半胱氨酸，普遍存在于生物界的蛋白质。通常地，金属硫蛋白可以经金属离子诱导而自组装形成融合蛋白，例如cd²⁺、gd³⁺、cr³⁺、ni²⁺、fe²⁺、mn²⁺、co²⁺等，对于经不同金属离子诱导形成的自组装蛋白之间是否存在结构、性能差异，或者存在何种结构、性能差异，现有技术中并无通用性指导原则。本发明在研究过程中发现，对于本发明所提供的融合蛋白，相对于其他金属离子，在fe²⁺离子诱导下自组装形成的蛋白纳米颗粒具有显著更优的免疫性能，这可能与其自组装形成的结构有关。

进一步，所述金属硫蛋白为mt3，其氨基酸序列为seqidno：1所示。

进一步，所述谷胱甘肽硫转移酶为gstp1，其氨基酸序列为seqidno：2所示。

进一步，所述金属硫蛋白和谷胱甘肽硫转移酶之间还包括可选的第一连接肽，所述谷胱甘肽硫转移酶和所述p12蛋白之间，还包括可选的第二连接肽。

进一步，所述第一连接肽和所述第二连接肽各自独立地选自刚性连接肽或柔性连接肽，优选为柔性连接肽。在具体的实施方式中，所述连接肽为(ggggs)n，n为1-4的整数。

根据非洲猪瘟病毒中国流行株序列信息(africanswinefevervirusisolatechina/2018/anhuixcgq,completegenome，genbank:mk128995.1)，所述p12蛋白的氨基酸序列为seqidno：3所示。

进一步，所述蛋白质单体的氨基酸序列为seqidno：4所示。

进一步，所述蛋白质单体进一步包含信号肽，从而有助于本发明所述的蛋白质单体在宿主细胞中的分泌表达。在某些实施方式中，本发明的蛋白质单体在其氨基端包含信号肽。由于本发明在研究过程中发现，通过例如酵母的真核表达系统表达该蛋白质单体，相对于例如大肠杆菌的原核表达系统更有利于其表达、修饰、分泌和自组装，因此，在优选的实施方式中，所述信号肽可为α-factor分泌信号肽。

进一步，所述蛋白质单体进一步包含蛋白标签。这类蛋白标签是本领域熟知的，例如his、flag、mbp、ha、myc等，并且本领域技术人员已知如何根据期望目的(例如，纯化、检测或示踪)选择合适的蛋白标签。在某些实施方式中，本发明的蛋白质单体包含his标签。在某些实施方式中，本发明的蛋白质单体在其羧基端包含蛋白标签。

本发明的第二方面，提供一种核酸，其编码本发明所述的蛋白质单体。

进一步，所述核酸为seqidno：5的第13-987位，或者seqidno：5的第13-1005位。

本发明的第三方面，提供一种载体，其包含本发明所述的核酸。在某些实施方式中，所述载体为质粒、粘粒或噬菌体。

本发明的第四方面，提供一种宿主细胞，其包含本发明所述的核酸和/或载体，和/或表达本发明所述的蛋白质单体。所述宿主细胞包括原核细胞例如大肠杆菌细胞，以及真核细胞例如酵母细胞，昆虫细胞，植物细胞和动物细胞(如哺乳动物细胞，例如小鼠细胞、人细胞等)等。在优选的实施例中，所述宿主细胞为酵母细胞。

本发明的第五方面，提供本发明所述蛋白纳米颗粒的制备方法，其包括，在允许所述蛋白质单体表达的条件下，培养本发明所述的宿主细胞；在所述培养过程加入金属离子进行诱导；和对培养得到的宿主细胞培养物进行蛋白纯化，即制备得到所述蛋白质单体经自组装形成的蛋白纳米颗粒。

进一步，所述金属离子为fe²⁺，所述金属离子的浓度为0.01-0.5mm，优选为0.5mm。

进一步，所述培养的过程中，所用培养基的ph为6.5-8.0，优选为8.0。

本发明的第六方面，提供一种免疫原性组合物或疫苗，其包括本发明所述的蛋白纳米颗粒，和/或本发明所述的核酸，和/或本发明所述的载体，和/或本发明所述的宿主细胞。

进一步，所述免疫原性组合物或疫苗的活性成分为本发明所述的蛋白纳米颗粒，和/或本发明所述的核酸，和/或本发明所述的载体，和/或本发明所述的宿主细胞。

进一步，所述免疫原性组合物或疫苗还包含佐剂、药学上可接受的载体、药学上可接受的赋形剂中的一种或两种以上。

本发明的第七方面，提供本发明所述的蛋白纳米颗粒、本发明所述的核酸、本发明所述的载体、本发明所述的宿主细胞、或本发明所述的免疫原性组合物或疫苗，在制备用于在受试者中诱导针对非洲猪瘟病毒的特异性免疫应答和/或用于在受试者中预防和/或治疗非洲猪瘟病毒的产品中的应用。

进一步，所述产品为疫苗。

进一步，所述特异性免疫应答包括抗体应答。

进一步，所述受试者是哺乳动物，如猪、猴、鼠、人。

本专利的发明人自从首次公开gstp1-mt3蛋白以来，经过不断研究已发现其具有靶向线粒体、调控巨噬细胞功能表型、抗病毒特别是单链rna病毒的功能。在发表于本专利的最新研究中，发明人将gstp1-mt3蛋白与asfv的蛋白进行偶联，分别构建并表达了asfv结构蛋白pp220、cd2v、p54、p30、p17、p12、p49、p22、j18l、非结构蛋白ep153r和未知功能蛋白cp312r的纳米颗粒，并通过动物实验分析这些纳米颗粒抗原的免疫原性。研究结果显示上述纳米颗粒蛋白中，大多数都未取得良好效果，而由gstp1-mt3和p12融合得到的纳米蛋白颗粒疫苗免疫小鼠后，能够产生较高滴度的p12特异性抗体。

与现有技术相比，本发明具有以下显著的进步：

本发明将gstp1-mt3蛋白与非洲猪瘟病毒的p12蛋白进行融合，在毕赤酵母表达系统中，经亚铁离子的诱导，能够自发地形成蛋白纳米颗粒。通过在小鼠体内进行免疫原性测定，该蛋白纳米颗粒能引起很强的免疫反应。本发明提供的蛋白纳米颗粒克服了现有技术中非洲猪瘟病毒亚单位疫苗、核酸疫苗和病毒活载体疫苗的保护效力偏低的缺陷，极有潜力开发成为新的安全有效的非洲猪瘟病毒疫苗。

附图说明

通过阅读下文优选实施方式的详细描述，各种其他的优点和益处对于本领域普通技术人员将变得清楚明了。附图仅用于示出优选实施方式的目的，而并不认为是对本发明的限制。在附图中：

图1为质粒ppiczaa-gstp1-mt3-p12的谱图示意图；

图2为对gstp1-mt3-p12蛋白纳米颗粒进行表征的结果图；左侧为sds-page鉴定结果，右侧为westernblot分析结果；

图3为对gstp1-mt3-p12蛋白纳米颗粒的粒径分析结果；

图4为gstp1-mt3-p12蛋白纳米颗粒特异性抗体滴度检测结果。

具体实施方式

下面将参照附图更详细地描述本公开的示例性实施方式。虽然附图中显示了本公开的示例性实施方式，然而应当理解，可以以各种形式实现本公开而不应被这里阐述的实施方式所限制。相反，提供这些实施方式是为了能够更透彻地理解本公开，并且能够将本公开的范围完整的传达给本领域的技术人员。

本发明根据非洲猪瘟病毒中国流行株序列信息(africanswinefevervirusisolatechina/2018/anhuixcgq,completegenome，genbank:mk128995.1)，设计合成了gstp1-mt3-p12融合蛋白的氨基酸序列和dna序列，mw36kd，从n端到c端依次是mt3、linker1、gstp1、linker2以及p12蛋白。在具体的实施方式中，为了便于纯化，在gstp1-mt3-p12的c末端融合了histag标签，并构建酵母表达质粒，表达载体为毕赤酵母表达载体ppiczαa(invitrogen)，构建得到的质粒的图谱如图1所示。

实施例1质粒构建

本实施例提供非洲猪瘟病毒p12蛋白纳米颗粒(gstp1-mt3-p12)的氨基酸序列如seqidno：4所示。委托擎科生物公司合成c端融合有histag的gstp1-mt3-p12的dna片段，其核酸序列如seqidno：5所示(其中，第13-987位编码seqidno：4所示的序列，第988-1005位编码histag)，并构建到质粒载体ppiczaa中，构建得到的质粒的图谱见图1所示，将该质粒命名为ppiczaa-gstp1-mt3-p12。该质粒载体ppiczaa在插入片段前含有α-factor分泌信号肽序列。培养经测序正确的单克隆菌株，提取质粒ppiczaa-gstp1-mt3-p12备用。

gstp1-mt3-p12的氨基酸序列(seqidno：4)：

dpetcpcpsggsctcadsckcegckctsckksccsccpaecekcakdcvckggeaaeaeaekcsccqggggsmppytvvyfpvrgrcaalrmlladqgqswkeevvtvetwqegslkasclygqlpkfqdgdltlyqsntilrhlgrtlglygkdqqeaalvdmvndgvedlrckyisliytnyeagkddyvkalpgqlkpfetllsqnqggktfivgdqisfadynlldlllihevlapgcldafpllsayvgrlsarpklkaflaspeyvnlpingngkqggggsmaldgssgggsnmprqqkkcskaeectcnngscslkts

实施例2蛋白纳米颗粒的诱导表达

将实施例1制备得到的质粒经线性化后，电转至x-33酵母感受态细胞中，进行诱导表达，具体步骤如下：

(1)质粒线性化

取将实施例1制备得到的质粒ppiczaa-gstp1-mt3-p12，用线性化酶sacⅰ进行酶切，酶切体系如下：

混匀后，室温12000rpm，1min离心使液体甩到管底，37℃水浴4h。

酶切完成后取2μl，与原质粒进行1％琼脂糖凝胶电泳鉴定线性化结果，经鉴定，质粒已酶切完全，使用质粒试剂盒对酶切后的质粒回收后，用于后续试验步骤。

(2)电转(无菌操作)

将10μl步骤(1)得到的线性化质粒加入到90μlx-33酵母感受态细胞中，混匀后加入电转杯中；2000v，5ms电击，然后立即加入800μl山梨醇，将其全部吸出转移到15ml离心管中，25℃，200rpm摇床培养2h；再加入3ml无抗ypd培养基25℃，200rpm摇床培养2h。取培养得到的菌液进行涂板(ypd博来霉素抗性平板)，28℃培养箱倒置培养2天。

培养结束后，选取单克隆划在新的博来霉素抗性平板上，对其进行编号，28℃培养箱倒置培养24h，取出后4℃保存备用。

(3)诱导表达

挑取步骤(2)制备得到的单一菌落，接种于2.5mlypd中，28℃，250rpm培养至od600为6，约16-18h；然后取150μl菌液转接到ph8.0的3mlbmgy培养基，28℃，250rpm培养至od600为1，约8-12h；在室温条件下1100rpm，离心5min，去掉bmgy培养基，用ph8.0的3mlbmmy培养基重悬菌体，加入终浓度为0.5％的甲醇及0.1mm硫酸亚铁离子诱导表达。其中，甲醇需每隔24h加一次，并补充终浓度为1％的酵母抽提物和蛋白胨，金属离子不需重复添加。培养72h后，收集培养产物，经实施例3进行sds-page鉴定后，按照实施例4进行蛋白质纯化。

实施例3sds-page鉴定

吸取1ml经实施例2制备得到的培养产物，室温下以最大速度在离心机中离心2min，取上清，上清与loadingbuffer混合制成上样样品，进行sds-page鉴定，分析表达水平。sds-page鉴定结果见图2(左)所示，经鉴定成功表达了目标蛋白质。

实施例4蛋白质纯化

经sds-page鉴定后，对实施例2制备得到的培养产物进行蛋白质纯化，具体步骤如下：

收集培养产物，4000rpm离心20min，取上清，按照1:500加入蛋白酶抑制剂，用1mtris将其ph调至8.0；然后12000rpm离心，取上清，用滤纸抽滤，将抽滤后的上清用ni柱进行纯化。收集得到纯化后的gstp1-mt3-p12蛋白纳米颗粒，进行westernblot蛋白质印迹分析，结果如图2(右)所示；通过zeta电位分析仪对gstp1-mt3-p12蛋白纳米颗粒进行动态光散射粒径测定，结果如图3所示，显示其粒径为15nm，颗粒具有良好均一度。

实施例5小鼠免疫

用实施例4制备得到的gstp1-mt3-p12蛋白纳米颗粒进行小鼠免疫实验。

取gstp1-mt3-p12蛋白纳米颗粒10μg，加20μg氢氧化铝明矾佐剂(thermo；77161)，pbs混合至终体积100μl，用于小鼠免疫。取5周龄balb/c雌性小鼠(斯贝福公司购买)，对每只小鼠进行肌肉注射免疫；每两周免疫一次，免疫3次，分别在第21天和35天检测血清抗体，elisa检测血清抗体的具体步骤如下：

(1)实验材料：

pbs：solarbio；p1020-500

1×washingbuffer：来自elispot试剂盒；1:50稀释

elisa包被液：solarbio；c1050-100ml

5％牛血清白蛋白bsa：晶美生物工程有限公司；rf101-100

hrp标记的山羊抗小鼠igg：中杉金桥；zb-2305

可溶性单组分tmb底物溶液：tiangen；pa107-01

elisa终止液：solarbio；c1058-100ml

elisa封板膜：axygen；platemaxcyclersealsealingfilm

1×8flatbottom，certifiedhighbinding：costar；42592

(2)实验步骤：

1、抗原预包被：用包被液将p12抗原稀释至1μg/ml，加100μl/孔包被，4℃包被过夜。

2、洗板：弃去包被液，在滤纸上拍干，加入200μl1×washingbuffer，静置1min，弃去洗涤液，拍干，重复3次。

3、封闭：5％牛血清白蛋白bsa(0.5g/10ml，4℃暂存)，100μl/孔，37℃封闭1h。

4、洗板：弃去封闭液，在滤纸上拍干，加入200μl1×washingbuffer，静置1min，弃去洗涤液，拍干，重复3次。

5、加一抗：将待检测血清倍比稀释，100μl/孔，37℃孵育1h。

稀释血清：3μl血清+297μlpbs为1:100，取150μl+150μlpbs为1:200，依次倍比稀释至1:400，1:800，1:1600，1:3200，1:6400，1:12800等。

6、洗板：弃去一抗，在滤纸上拍干，加入200μl1×washingbuffer，静置1min，弃去洗涤液，拍干，重复3次。

7、加二抗：用hrp标记的山羊抗小鼠igg为二抗1:5000，用pbs稀释，100μl/孔，37℃避光孵育1h。

8、洗板：弃去二抗，在滤纸上拍干，加入200μl1×washingbuffer，静置1min，弃去洗涤液，拍干，重复3次。

9、显色：加入可溶型单组分tmb显色液，100μl/孔，避光显色15min。

10、终止：提前将酶标仪预热，加入终止液终止显色，100μl/孔，立即在酶标仪450nm波长下测定数值。

实验结果显示gstp1-mt3-p12蛋白纳米颗粒免疫小鼠35天后，能够在小鼠体内激发产生特异性抗体，平均滴度高达1:50000(图4)，证明gstp1-mt3-p12蛋白纳米颗粒具有良好的免疫原性。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

序列表

<110>北京四纬生物科技有限公司

<120>非洲猪瘟病毒p12蛋白纳米颗粒及其制备方法与应用

<160>5

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cyscyssercyscysproalaglucysglulyscysalalysaspcys

354045

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