棒状链霉菌的制作方法

1.本发明总体上涉及棒状链霉菌(streptomyces clavuligerus)中棒酸产量的提升。特别地，本发明提供了在ccar启动子区和基因中包含点突变的棒状链霉菌、包含含有所述突变的ccar启动子区和基因以用于产生所述棒状链霉菌的载体以及使用所述棒状链霉菌产生棒酸的方法，以及使用所述棒状链霉菌产生的棒酸制备的药物制剂。
2.发明背景
3.β-内酰胺类抗生素，如青霉素，是使用最广泛的一类抗生素(bush&bradford(2016)cold spring harb perspect med)。然而，某些病原体通过产生β-内酰胺酶而对β-内酰胺类抗生素产生耐药性，从而降低了β-内酰胺类抗生素的有效性。
4.棒酸是一种β-内酰胺化合物，在结构上与青霉素相关，由棒状链霉菌作为发酵产物产生。棒酸是从棒状链霉菌中分离出来的，在1976年被reading和cole鉴定为一种新型的β-内酰胺酶抑制剂(reading&cole,(1977)antimicrob.agents chemother.)。棒酸的添加显示出增强β-内酰胺酶不稳定性抗生素的抗菌活性。
5.从那时起，棒酸与β-内酰胺类抗生素在制药工业中被广泛用于治疗由产生β-内酰胺酶的病原体引起的感染，这些病原体原本将对β-内酰胺类抗生素产生抗药性。据了解，棒酸的β-内酰胺结构代替β-内酰胺类抗生素与病原体产生的β-内酰胺酶的活性位点结合，对酶产生不可逆的抑制作用(labia and peduzzi,(1985)drugs exp.clin.res；georgopapadkou(2004)exp.opin.investig.drugs)。
6.棒状链霉菌菌株的改良对棒酸工业发酵过程中降低生产成本具有重要作用。传统上，在工业发酵中获得更高产量的棒酸的菌株改良策略很大程度上取决于随机诱变和选择技术。然而，随着对棒状链霉菌产生棒酸的关键生物合成途径和调控机制的了解增加，菌株改良策略也与基于知识的合理方法相结合(paradkar(2013)the journal of antibiotics)。
7.因此，对开发产生更高产量的棒酸的额外棒状链霉菌菌株和使用这些菌株以更低的成本产生更高产量的棒酸的改进方法存在持续需要。
8.发明概述
9.令人惊讶的是，发明人发现与野生型(wt)棒状链霉菌相比，在ccar启动子区和ccar基因中包含突变的棒状链霉菌菌株以更快的速率产生更高滴度的棒酸。本公开将使得用于产生棒酸的改进方法成为可能，与野生型棒状链霉菌相比，特别是在工业规模下，该方法以更低的成本生产更高滴度的棒酸。
10.根据本发明的第一方面，提供了一种在ccar启动子区包含两个点突变和在ccar基因中包含一个取代突变的棒状链霉菌，其中ccar启动子区中的点突变为与seq id no：1的第48位对应的位点处的c(胞嘧啶)到t(胸腺嘧啶)突变和与seq id no：1的第143位对应的位点处的g(鸟嘌呤)到a(腺嘌呤)点突变；并且其中ccar基因中的突变是与seq id no：2的第32位对应的位点处的精氨酸到色氨酸取代。
11.根据本发明的另一方面，提供了用于产生棒酸的本发明的棒状链霉菌。
12.根据本发明的另一方面，提供了包含核酸序列的载体，所述核酸序列包含含有两个点突变的ccar启动子区和含有一个取代突变的ccar基因，其中ccar启动子区中的点突变为与seq id no：1的第48位对应的位点处的c到t突变和与seq id no：1的第143位对应的位点处的g到a突变；并且其中ccar基因中的取代突变是与seq id no：2的第32位对应的位点处的精氨酸至色氨酸取代。
13.根据本发明的又一方面，提供了一种产生棒酸的方法，其包括使本发明的棒状链霉菌生长和回收由所述棒状链霉菌或其子代产生的棒酸的步骤。
14.根据本发明的另一方面，提供了一种产生包含β-内酰胺类抗生素和棒酸的药物制剂的方法，该方法包括以下步骤：(a)使本发明的棒状链霉菌生长；(b)回收由所述棒状链霉菌或其子代产生的棒酸；和(c)将步骤(b)中回收的棒酸与β-内酰胺类抗生素组合，以制备药物制剂。
附图说明
15.图1：组合的ccar突变m1、m2和m3对发酵的影响：棒酸滴度曲线
16.图2：ccar突变的影响：65小时时的发酵滴度
17.图3：ccar突变对发酵的影响：棒酸滴度曲线
18.图4：组合的ccar突变m1、m2和m3对发酵粘度曲线的影响
19.图5：ccar突变对发酵粘度曲线的影响
20.发明详述
21.本发明通过在ccar启动子区和基因中引入突变，对使用棒状链霉菌产生棒酸的方法提供了显著改进。由本发明的棒状链霉菌菌株产生的棒酸可以与β-内酰胺类抗生素如阿莫西林组合，以产生augmentin。
22.棒酸的生物合成可分为早期和晚期合成，因此，根据其功能，参与棒酸合成的基因也可分为早期和晚期基因。
23.棒状链霉菌ccar基因位于头霉素c基因簇内，并且位于blp基因的上游(perez-llarena等(1997)j.bacteriol.)。ccar启动子区、ccar基因和关联的blp基因的核苷酸序列可在genbank上获得(登录号z81324)。
24.ccar基因编码正向作用转录调节因子ccar，其控制棒酸和头霉素c的产生(alexander&jensen(1998)j.bacteriol.；santamarta等人(2011)mol.microbiol.)。棒酸和头霉素c的产生在棒状链霉菌ccar敲除突变体中消失，并在重新引入野生型ccar后恢复，这表明ccar正向调节这两种蛋白质的产生。
25.ccar直接和间接调节棒酸的产生。通过调节ceas2-bls-pah-cas2多顺反子转录物的表达直接调节，其产物参与导致棒胺酸(clavaminic acid)形成的“早期”反应途径。通过调节clar的表达间接调节，这反过来调节参与将棒胺酸转化为棒酸的“晚期”反应途径的基因的表达。此外，ccar显示出结合至ccar的上游并自动调节其自身的表达。
26.发明人已经鉴定了如下所述的ccar启动子区和基因内的三个突变，以用于开发改进的棒状链霉菌菌株，与野生型棒状链霉菌菌株相比，该菌株在较短的发酵期内产生更高滴度的棒酸。
27.突变1(m1)是与seq id no：1的第48位对应的位点处从c到t的点突变(48c》t)。
28.突变2(m2)是与seq id no：1的第143位对应的位点处从g到a的点突变(143g》a)。
29.突变3(m3)是与seq id no：2的第32位对应的位点处的精氨酸至色氨酸氨基酸取代(r32w)。
30.根据本发明的一个方面，提供了一种棒状链霉菌，其在ccar启动子区包含两个点突变并在ccar基因中包含一个取代突变，其中ccar启动子区中的点突变为与seq id no：1的第48位对应的位点处的c到t突变和与seq id no：1的第143位对应的位点处的g到a突变；并且其中ccar基因中的取代突变是与seq id no：2的第32位对应的位点处的精氨酸至色氨酸取代。
31.在一个实施方案中，精氨酸到色氨酸的氨基酸取代是由与seq id no：1的第344位对应的位点处的c到t点突变(344c》t)导致的结果。
32.在一个实施方案中，棒状链霉菌包含seq id no：3的核酸序列。公开了包含与seq id no：3具有至少80％、85％、90％、95％或者更高同一性的核酸序列的棒状链霉菌，其中所述核酸序列包含m1；m2；m3；m1和m3；m1和m2；m2和m3；或m1、m2和m3。
33.在一个实施方案中，包含m1、m2和m3中的一个或多个的ccar启动子区的核酸序列和编码ccar基因的核酸序列整合到棒状链霉菌菌株的染色体dna中。在另一个实施方案中，包含m1、m2和m3中的一个或多个的ccar启动子区的核酸序列和编码ccar基因的核酸序列位于棒状链霉菌菌株的染色体外。
34.包含ccar启动子区和基因序列的棒状链霉菌不同菌株的多个序列是可用的。在这种不同序列的情况下，技术人员将容易地识别对应于m1、m2和m3的各个位置。例如，棒状链霉菌f613-1是一种工业菌株。f613-1基因组于2016年测序，提供了完整的棒状链霉菌基因组序列(genbank登录号cp016559.1)。技术人员将容易地确定，在该序列中，m1、m2和m3的位置分别对应于2,011,673、2,011,768和2,011,969位点。作为另一个例子，在棒状链霉菌f1d-5菌株染色体(genbank登录号cp032052.1)内，m1、m2和m3的位置分别对应2,013,392、2,013,487和2,013,688位点。在genbank登录号ah006362(棒状链霉菌atcc 27064)内，m1、m2和m3的位置分别对应于14,042、14,137和14,338位点。
35.在引入ccar启动子区和基因突变后，菌株中可见的一个显著优势是棒酸的累积速度。换言之，与野生型棒状链霉菌菌株相比，本发明的棒状链霉菌菌株产生更高滴度的棒酸，并且这种更高的滴度是在减少的发酵时间内达到的。由于产物与杂质的比率提高，本发明的突变棒状链霉菌菌株提高了棒酸的生产力，这对于在棒酸的提取和纯化中实现更有效的下游过程来说是关键的。进而，生产包含棒酸的药物制剂的工厂的能力和速度得到提升，从而降低生产成本。
36.与野生型棒状链霉菌菌株相比，本发明的棒状链霉菌菌株产生更高滴度的棒酸。在一个实施方案中，棒状链霉菌能够产生约0.5g/l或更高、约0.75g/l或更高、约1g/l或更高、约1.25g/l或更高、约1.5g/l或更高、约1.75g/l或更高、约2g/l或更高或约2.5g/l或更高滴度的棒酸。在进一步的实施方案中，棒状链霉菌能够产生约2.1g/l或更高滴度的棒酸。
37.在一个实施方案中，在发酵65小时后，棒状链霉菌能够产生约0.5g/l或更高、约0.75g/l或更高、约1g/l或更高、约1.25g/l或更高、约1.5g/l或更高、约1.75g/l或更高、约2g/l或更高、约2.1g/l或更高或约2.5g/l或更高滴度的棒酸。在进一步的实施方案中，在发酵65小时后，棒状链霉菌能够产生约2.1mg/ml或更高滴度的棒酸。在一个实施方案中，在约
40小时、45小时、50小时、55小时、60小时、65小时、70小时、72小时、75小时、80小时、85小时、90小时、95小时、100小时、105小时、110小时、115小时、120小时、125小时、130小时、135小时或140小时的发酵后产生上述滴度。
38.在一个实施方案中，与野生型(wt)棒状链霉菌相比，棒状链霉菌能够产生约50％或更高、约75％或更高、约100％或更高、约125％或更高、约150％或更高、约175％或更高、约200％或更高、约225％或更高、约250％或更高、约275％或更高、约300％或更高、约325％或更高、约350％或更高或约375％或更高、约400％或更高、约425％或更高、约450％或更高、约475％或更高、约500％或更高、约525％或更高、约550％或更高、约575％或更高、约600％或更高、约625％或更高、约650％或更高、约675％或更高、约700％或更高、约725％或更高、约750％或更高、约775％或更高、约800％或更高、约825％或更高、约850％或更高、约875％或更高、约900％或更高、约925％或更高、约950％或更高、约975％或更高、或约1000％或更高滴度的棒酸。在一些实施方案中，与野生型棒状链霉菌相比，棒酸滴度所述增加的百分比是在发酵65小时后产生的。在一些实施方案中，与野生型棒状链霉菌相比，棒酸滴度所述增加的百分比是在发酵约40、45、50、55、60、65、70、72、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135或140小时后产生的。优选地，在一个实施方案中，与野生型棒状链霉菌相比，在发酵65小时后，本发明的棒状链霉菌能够产生约1000％或更高滴度的棒酸。
39.包含ccar启动子区和基因突变的菌株赋予的另一个显著优势是发酵培养物粘度的降低。棒状链霉菌是一种丝状生物，发酵培养物的形态是影响发酵过程中气体和热量传递效率的重要参数。培养样品的粘度测量用于指示在大规模发酵中控制溶解氧和保持温度所涉及的难度和能量。培养物的期望特征是高滴度而没有非常高的粘度。
40.因此，在一些实施方案中，与野生型棒状链霉菌相比，本发明的棒状链霉菌能够使包含其的发酵液粘度降低约10％或更多、约15％或更多、约20％或更多、约25％或更多、约30％或更多、约35％或更多、或约40％或更多。
41.在一个实施方案中，与野生型棒状链霉菌相比，在发酵65小时后，本发明的棒状链霉菌能够使发酵液的粘度降低约40％或更多。在这些实施方案中，发酵液包含本发明的棒状链霉菌。
42.在一个实施方案中，本发明的棒状链霉菌能够使包含其的发酵液具有约35厘泊或更低、约30厘泊或更低、25厘泊或更低或20厘泊或更低的粘度。在一个实施方案中，相对于野生型棒状链霉菌的粘度，本发明的棒状链霉菌能够使包含其的发酵液的粘度降低约5厘泊或更多、约7厘泊或更多、约10厘泊或更多、13厘泊或更多、15厘泊或更多、17厘泊或更多或20厘泊或更多。在一个实施方案中，相对于野生型棒状链霉菌的粘度，本发明的棒状链霉菌能够使包含其的发酵液的粘度降低约6厘泊或更多、13厘泊或更多或17厘泊或更多。在一种实施方案中，所述粘度或粘度降低是在发酵65小时之后。在一个实施方案中，本发明的棒状链霉菌在发酵65小时后，能够使包含其的发酵液的粘度为约28厘泊或更低。在一个实施方案中，本发明的棒状链霉菌在发酵65小时后，能够使包含其的发酵液的粘度为约25厘泊或更低。
43.因此，提供了一种涉及突变棒状链霉菌菌株的棒酸生产的改进方法。
44.棒状链霉菌可包含一个或多个选自m1、m2和m3的突变。棒状链霉菌可以包含两个选自m1、m2和m3的突变。棒状链霉菌可包含两个选自m1、m2和m3的突变，其中两个突变之一
是m2。例如，包含m2和m1的棒状链霉菌或包含m2和m3的棒状链霉菌。棒状链霉菌可包含选自m1、m2和m3的单个突变。
45.根据本发明的另一方面，提供了用于产生棒酸的本发明的棒状链霉菌。
46.在本发明的另一方面，提供了包含核酸序列的载体，所述核酸序列包含含有两个点突变的ccar启动子区和含有取代突变的ccar基因，其中ccar启动子区中的点突变为与seq id no：1的第48位对应的位点处的c到t点突变和与seq id no：1的第143位对应的位点处的g到a点突变；并且其中ccar基因中的突变是与seq id no：2的第32位对应的位点处的精氨酸至色氨酸取代。
47.在一个实施方案中，精氨酸到色氨酸的氨基酸取代是由于seq id no：1的第344位对应的位点处的c到t点突变导致的结果。
48.在一个实施方案中，载体是质粒。在另一个实施方案中，载体是线性dna。在又一个实施方案中，载体是噬菌体。能够将遗传物质人为地携带到另一个细胞中，使其可以被复制和/或表达的其他载体是本领域公知的，并且也可以使用。
49.ccar启动子区与ccar基因可操作地连接。然而，在一个实施方案中，ccar启动子区未与ccar基因可操作地连接。
50.在一个实施方案中，载体包含seq id no：3的核酸序列。
51.公开了包含与seq id no：3具有至少80％、85％、90％、95％或者更高同一性的核酸序列的棒状链霉菌，其中所述核酸序列包含m1；m2；m3；m1和m3；m1和m2；m2和m3；或m1、m2和m3。
52.在另一个实施方案中，本发明的载体用于产生本发明的棒状链霉菌。
53.合适地，本发明的突变的ccar启动子区和基因可以基于本文提供的序列通过常规克隆方法(例如pcr)获得。
54.进一步合适地，本发明的载体用于通过使用本领域已知的方法转化到能够随后与棒状链霉菌接合的生物体来制备本发明的棒状链霉菌。例如，链霉菌属生物学中使用的技术和基础载体在practical streptomyces genetics(t.keiser,m.j.bibb,m.j.buttner,k.f.chater,d.a.hopwood(2000))中有所描述，该手册由john innes中心出版。
55.迄今为止，基于知识的棒状链霉菌菌株改良策略可大致分为三种方法：(1)增加前体进入途径的流量，(2)增加关键生物合成和/或调控基因的基因剂量，以及(3)消除将途径流转向非棒酸产物的竞争反应。
56.例如，3-磷酸甘油醛(g3p)和精氨酸是棒酸途径中的两种必需前体。除了棒酸产生途径外，g3p还可替代地进入由3-磷酸甘油醛脱氢酶(gap)引导的糖酵解途径，然后进入三羧酸循环。与带有野生型gap-1的菌株相比，gap-1突变棒状链霉菌菌株显示出80-110％的棒酸产量增加(li&townsend(2006)metab.eng.)。
57.此外，增加cas2和ccar的基因剂量导致棒酸的产生水平增加(hung等人(2007)j.micrbiol.biotechnol.)。
58.cvm1编码一种参与棒胺酸转化为3s，5s棒酸(与棒酸的3r，5r立体化学相反)的酶，它不具有β-内酰胺酶抑制特性。cvm1的失活导致棒酸产量的增加(paradkar等人(2001)appl.environ.microbiol.)。
59.在一些实施方案中，本发明的棒状链霉菌菌株进一步包含本领域已知的遗传修
饰。在一个实施方案中，本发明的载体用于将ccar启动子区和基因突变引入包含进一步基因突变的棒状链霉菌菌株(与野生型棒状链霉菌相比)。
60.本领域的遗传修饰可以是基于根据知识方法的靶向突变，或者可以是由随机诱变和选择方法产生的突变。可以预见，本领域已知的此类遗传修饰与本发明的ccar启动子区和基因突变组合将提供对棒状链霉菌菌株的进一步改进，例如与单独的本领域中已知的相应遗传修饰相比或与单独的本发明的ccar启动子和基因突变相比，进一步增加棒酸滴度。
61.可将本文公开的ccar启动子区和基因内的突变引入包含进一步突变但包含野生型ccar启动子区和基因的棒状链霉菌菌株。这可以使用携带本文公开的ccar启动子区和基因突变的载体进行。
62.或者，可以将本领域已知的突变引入本发明的棒状链霉菌菌株。此类菌株可以使用本领域已知的常规基因工程方法产生。
63.wo98/33896(smithkline beecham plc；governors of the university of alberta)中描述了适于引入本发明的ccar启动子区和基因突变的棒状链霉菌突变株。
64.在一些实施方案中，本发明的棒状链霉菌菌株包含野生型ccar启动子区和基因的拷贝。换言之，包含本文描述的突变的ccar启动子区和基因并未取代野生型ccar启动子区和基因，而是添加到其中。在一些实施方案中，在ccar启动子区和基因中包含突变的本发明的棒状链霉菌菌株包含一个或多个拷贝的野生型ccar启动子区和基因。
65.在本发明的又一方面，提供了一种产生棒酸的方法，其包括使本发明的棒状链霉菌生长和回收由所述修饰的棒状链霉菌或其子代产生的棒酸的步骤。
66.使棒状链霉菌生长和回收棒酸的方法是本领域已知的。例如，wo01/87891(smithkline beecham p.l.c.)和ser等人(ser等人(2016)front.microbio.)已经描述了用于棒状链霉菌发酵和棒酸提取的合适条件。
67.在一个实施方案中，该方法产生约0.5g/l或更高、约1g/l或更高、约1.5g/l或更高、约2g/l或更高或约2.5g/l或更高滴度的棒酸。
68.优选地，在一个实施方案中，所述滴度的棒酸是在发酵65小时后通过该方法产生的。在一些实施方案中，所述滴度的棒酸是在约50、55、60、65、70、72、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135或140小时的发酵后通过该方法产生的。
69.在一个实施方案中，与野生型(wt)棒状链霉菌相比，该方法产生约50％或更高、约75％或更高、约100％或更高、约125％或更高、约150％或更高、约175％或更高、约200％或更高、约225％或更高、约250％或更高、约275％或更高、约300％或更高、约325％或更高、约350％或更高或约375％或更高、约400％或更高、约425％或更高、约450％或更高、约475％或更高、约500％或更高、约525％或更高、约550％或更高、约575％或更高、约600％或更高、约625％或更高、约650％或更高、约675％或更高、约700％或更高、约725％或更高、约750％或更高、约775％或更高、约800％或更高、约825％或更高、约850％或更高、约875％或更高、约900％或更高、约925％或更高、约950％或更高、约975％或更高、或约1000％或更高滴度的棒酸。在一些实施方案中，与野生型棒状链霉菌相比，棒酸滴度所述增加的百分比是在发酵65小时后产生的。在一些实施方案中，棒酸滴度所述增加的百分比是在发酵约40、45、50、55、60、65、70、72、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135或140小时后产生的。优选地，在一个实施方案中，与野生型棒状链霉菌相比，在发酵65小时后，本发明的棒状
链霉菌能够产生约1000％或更高滴度的棒酸。
70.在一些实施方案中，与野生型棒状链霉菌相比，包含本发明的突变棒状链霉菌菌株的发酵液的粘度降低约10％或更多、约15％或更多、约20％或更多、约25％或更多、约30％或更多、约35％或更多、或约40％或更多。在一个实施方案中，所述粘度降低是在发酵65小时后获得的。在一个实施方案中，所述粘度降低是在发酵约40、45、50、55、60、65、70、72、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135或140小时后获得的。
71.在一个实施方案中，与野生型棒状链霉菌相比，包含本发明的突变链霉菌菌株的发酵液的粘度在发酵65小时后降低约40％或更多。
72.在一个实施方案中，包含本发明的突变棒状链霉菌菌株的发酵液的粘度为约35厘泊以下、约30厘泊以下、25厘泊以下或20厘泊以下。在一个实施方案中，所述粘度是在发酵65小时之后。在一个实施方案中，在发酵65小时后，包含本发明的突变棒状链霉菌菌株的发酵液的粘度为约28厘泊或更低。在一个实施方案中，在发酵65小时后，包含本发明的突变棒状链霉菌菌株的发酵液的粘度为约25厘泊或更低。
73.在本发明的另一方面，提供了一种制备包含β-内酰胺类抗生素和棒酸的药物制剂的方法，其包括以下步骤：
74.(a)使本发明的修饰的棒状链霉菌生长；
75.(b)回收由所述修饰的棒状链霉菌或其子代产生的棒酸；以及
76.(c)通过将步骤(b)中回收的棒酸与β-内酰胺类抗生素组合来制备药物制剂。
77.在一个优选的实施方案中，β-内酰胺类抗生素是阿莫西林。
78.产品co-amoxiclav由葛兰素史克公司(glaxosmithkline)作为augmentin销售，用于治疗细菌感染。它包含β-内酰胺类抗菌剂阿莫西林和棒酸的组合。该产品以各种药物制剂形式提供，例如片剂、胶囊粉剂和含有自由流动颗粒的小袋。药物制剂可包含不同比例的β-内酰胺类抗生素和棒酸，β-内酰胺抗生素例如为阿莫西林或替卡西林。在一个实施方案中，棒酸与β-内酰胺类抗生素以3：1至30：1的比例组合。具体比例可取决于制剂类型、给药方案、给药途径和/或目标适应症。
79.在一些实施方案中，本发明的药物制剂包含阿莫西林三水合物和棒酸钾。
80.wo94/27557(smithkline beecham公司)和wo98/35672(smithkline beecham药学实验室)描述了用于本发明的包含阿莫西林和棒酸的合适药物制剂。
81.本发明还公开了一种药物制剂，其包含通过本发明所述的方法产生的棒酸，还包含β-内酰胺类抗生素。优选地，β-内酰胺类抗生素是阿莫西林。在一个实施方案中，药物制剂是augmentin。
82.在又一方面，提供了一种产生棒酸的基因工程化微生物，其包含ccar启动子区中的两个点突变和ccar基因中的取代突变，其中ccar启动子区中的点突变为与seq id no：1的第48位对应的位点处的c到t点突变和与seq id no：1的第143位对应的位点处的g到a点突变；并且其中ccar基因中的取代突变是与seq id no：2的第32位对应的位点处的精氨酸至色氨酸取代。
83.在一个实施方案中，基因工程化微生物是棒状链霉菌。在另一个实施方案中，ccar基因被整合到所述微生物的染色体dna中。
84.在一个实施方案中，精氨酸到色氨酸取代是由与seq id no：1的第344位对应的位
点处的c到t点突变导致的结果。在另一个实施方案中，基因工程化微生物包含seq id no：3的核酸序列。在一个实施方案中，基因工程化微生物能够产生约0.5g/l或更高、约1g/l或更高、约1.5g/l或更高、约2g/l或更高或约2.5g/l或更高滴度的棒酸。在一个实施方案中，基因工程化微生物能够产生约2.1g/l或更高滴度的棒酸。在一个实施方案中，所述棒酸滴度在发酵65小时后产生。在一个实施方案中，与野生型(wt)微生物相比，在发酵65小时后，基因工程化微生物能够产生约100％或更高、约200％或更高、约300％或更高、约400％或更高、约500％或更高、约600％或更高、约700％或更高、约800％或更高、约900％或更高、或约1000％或更高滴度的棒酸。应当理解，提及野生型微生物是指与基因工程化微生物相同的微生物物种，即相同物种的非基因工程化微生物。在一个实施方案中，与野生型微生物相比，在发酵65小时后，基因工程化微生物能够产生约1000％或更高滴度的棒酸。在一个实施方案中，与野生型微生物相比，在发酵65小时后，基因工程化微生物能够使发酵液的粘度降低约10％或更多、约15％或更多、约20％或更多、约25％或更多、约30％或更多、约35％或更多、或约40％或更多。在另一个实施方案中，与野生型微生物相比，在发酵65小时后，所述微生物能够使发酵液的粘度降低约40％或更多。
85.在一方面，提供了用于产生棒酸的本文所述的基因工程化微生物。
86.在另一方面，提供了产生棒酸的方法，其包括使本文所述的基因工程化微生物生长和回收由该基因工程化微生物或其子代产生的棒酸的步骤。
87.在该方法的一个实施方案中，产生约0.5g/l或更高、约1g/l或更高、约1.5g/l或更高、约2g/l或更高或约2.5g/l或更高滴度的棒酸。在进一步的实施方案中，产生约2.1g/l或更高滴度的棒酸。在又一个实施方案中，所述棒酸滴度在发酵65小时后产生。在该方法的一个实施方案中，与野生型(wt)微生物相比，在发酵65小时后，产生约100％或更高、约200％或更高、约300％或更高、约400％或更高、约500％或更高、约600％或更高、约700％或更高、约800％或更高、约900％或更高、或约1000％或更高滴度的棒酸。在一个实施方案中，与野生型微生物相比，在发酵65小时后，产生1000％或更高滴度的棒酸。在一个实施方案中，与野生型微生物相比，在发酵65小时后，包含基因工程化微生物的发酵液的粘度降低约10％或更多、约15％或更多、约20％或更多、约25％或更多、约30％或更多、约35％或更多、或约40％或更多。在一个实施方案中，与野生型微生物相比，在发酵65小时后，包含基因工程化微生物的发酵液的粘度降低约40％或更多。
88.在另一方面，提供了一种制备包含β-内酰胺类抗生素和棒酸的药物制剂的方法，其包括以下步骤：
89.(a)使本文所述的基因工程化微生物生长，
90.(b)回收由基因工程化微生物或其子代产生的棒酸；以及
91.(c)通过将步骤(b)中回收的棒酸与β-内酰胺类抗生素组合来制备药物制剂。
92.在一个实施例方案，β-内酰胺抗生素是阿莫西林。在一个实施方案中，药物制剂是augmentin。
93.上文描述的棒状链霉菌菌株的所有方面和实施方案也适用于产生棒酸的基因工程化微生物。为避免疑问，此类方面和实施方案还包括使用棒状链霉菌菌株产生棒酸的方法、使用棒状链霉菌菌株产生药物制剂的方法。
94.定义
95.除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的技术人员通常理解的相同含义。本文提及的所有专利和出版物均通过引用而整体并入。
96.术语“包含”包括“包括”或“由
……
组成”，例如“包含”x的组合物可仅由x组成或可包括额外的东西，例如x+y。
97.术语“基本上由
……
组成”将特征的范围限制为指定的材料或步骤，以及不会对要求保护的特征的基本特性产生实质性影响的材料或步骤。
98.术语“由
……
组成”不包括任何附加成分的存在。
99.涉及数值x的术语“约”是指例如x
±
10％、5％、2％或1％。
100.如本文所用的术语“启动子区”是指包含基因功能或表达所需的任何调控区的核酸序列。
101.术语“棒状链霉菌(streptomyces clavuligerus)”，“s.clavuligerus”、“棒状链霉菌菌株”可互换使用，是指棒状链霉菌及其菌株。
102.在“棒状链霉菌(streptomyces clavuligerus)”、“s.clavuligerus”、“棒状链霉菌菌株”语境下使用的术语“野生型”或“wt”是指以天然、非突变形式存在的棒状链霉菌菌株(即棒状链霉菌
–
培养物保藏中心atcc 27064)。在本文中在棒状链霉菌的语境中使用的wt特别是指在ccar启动子区和ccar基因中不包含名为m1、m2或m3的突变的菌株。
103.术语“ccar”和“ccar基因”可互换使用并且如本文所用是指ccar基因。
104.如本文所用的术语“ccar”是指由ccar基因编码的蛋白质。
105.如本文所用的术语“点突变”是指核苷酸序列中单个碱基对的改变。例如，一个碱基可以替换为另一个。这种点突变可具有三种效果之一。首先，碱基替换可以是沉默突变，其中改变的密码子对应相同的氨基酸。其次，碱基替换可以是错义突变，其中改变的密码子对应不同的氨基酸。第三，碱基替换可以是无义突变，其中改变的密码子对应终止信号。
106.如本文所用的术语“取代突变”是指将一种氨基酸替换为另一种氨基酸。它也可以指将核苷酸序列中的一个碱基对替换为另一碱基对。
107.在发酵的上下文中，如本文所用的术语“发酵小时”和“log小时”是指从种子培养物接种到生产培养基的时间点起始的发酵小时数。
108.如本文所用的术语“发酵液”是指发酵培养基和在其中发酵的细胞(特别是棒状链霉菌)的混合物。
109.术语“载体”或“核酸载体”是指能够人工将遗传物质携带到另一个细胞中以进行复制和/或表达的媒介物。
110.现在将参考以下非限制性实施例更详细地描述本发明。
实施例
111.实施例1
112.ccar突变质粒构建
113.单独或组合评估了ccar启动子区和ccar基因内的三个突变对棒酸产量的影响。突变是：
114.突变1(m1)
–
seq id no：1的第48位从c到t的点突变；
115.突变2(m2)
–
seq id no：1的第143位从g到a的点突变；以及
116.突变3(m3)
–
seq id no：2的第32位处的精氨酸到色氨酸的氨基酸取代。
117.m1和m2的位置在ccar启动子区。m3的位置在ccar基因内。
118.制作初始构建体
119.·
引物nc_18_22和nc_18_23用于使用q5
tm
聚合酶通过pcr扩增ccar基因和周边的4kb dna(每侧2kb)。这些引物分别包含hindiii和xbai位点。使用不同的基因组dna作为模板进行了三个pcr——dna来自棒状链霉菌野生型菌株、菌株3(sc3)或菌株4(sc4)。使用这些不同的基因组制备物将分别产生不含突变、含m1+m2突变和含所有三种突变(m1+m2+m3)的产物。
120.·
pcr产物在其hindiii和xbai位点克隆到含有可用作选择工具的coda基因的pkc1132中，并转化到大肠杆菌neb10中。使用引物nc_18_22和nc_18_23通过菌落pcr筛选菌落。从产生正确大小的pcr产物的菌落中提取质粒，并将它们命名为pclv23(野生型序列)、pclv24(sc3序列/m1+m2)和pclv25(sc4序列/m1+m2+m3)。对质粒进行测序以检查克隆的dna是否正确。
121.制作含有一个突变的质粒
122.·
使用pclv23作为模板，使用引物组ccar_qcm1_f和ccar_qcm1_r；ccar_qcm2_f和ccar_qcm2_r；ccar_qcm3_f和ccar_qcm3_r建立三个“诱变”pcr，以分别进行m1、m2和m3突变。它们与标准pcr的不同之处在于使用高浓度的模板dna(25μlpcr体系中预备1μl标准质粒)，使用低浓度引物(25μlpcr体系中储备1μl的1mm引物)，退火温度始终为60℃，pcr仅循环12次。
123.·
pcr后，每份混合物都用dpni消化以去除模板dna，并转化到大肠杆菌neb10中。从每种诱变选择6个菌落制备质粒并测序。每种挑出一个含有正确突变的质粒，这些质粒命名为pclv26(m1)、pclv27(m2)和pclv28(m3)。
124.测序结果和后续诱变
125.·
在构建的原始质粒中，pclv25包含正确的序列。发现pclv23在orf10基因的ccar上游存在点突变。因此，pclv26、pclv27和pclv28也包含此突变。发现pclv24在ccar基因中存在不需要的突变。
126.·
使用引物qc_correct_orf10_f和qc_correct_orf10_r对pclv23、pclv26、pclv27和pclv28进行了诱变pcr。将得到的质粒送去测序，从中选出包含正确的orf10基因序列的质粒，最终质粒命名为pclv29(野生型序列)、pclv31(m1)、pclv32(m2)和pclv33(m3)。
127.·
使用引物qc_correct_ccarmut_f和qc_correct_ccarmut_r对pclv24进行了诱变pcr。将得到的质粒送去测序，从中选出含有正确的ccar基因序列的质粒。最终质粒命名为pclv30(m1+m2)。
128.·
为了获得包含突变的所有迭代的突变体，需要另外两个质粒来覆盖突变m1+m3和m2+m3。为了将m1或m2添加到已经含有m3的质粒中，使用pclv33(m3)作为模板，分别使用引物组ccar_qcm1_f和ccar_qcm1_r；ccar_qcm2_f和ccar_qcm2_r进行诱变pcr。对所得质粒进行测序，并从中选择含有期望突变的质粒。最终质粒命名为pclv34(m1+m3)和pclv35(m2+m3)。
129.引物表：
[0130][0131][0132]
最终构建体：
[0133][0134]
实施例2
[0135]
ccar突变棒状链霉菌
[0136]
如实施例1中所述制备的ccar突变质粒用于制备棒状链霉菌的ccar突变菌株。
[0137]
1.质粒dna的制备
[0138]
·
将每种质粒转化到电感受态的大肠杆菌et12567[puz8002]中。这种大肠杆菌菌株为dam-dcm-，因此产生未甲基化的质粒dna并含有puz8002质粒，该质粒含有orit(转移基因的起始)，能够进行接合。et12567对氯霉素具有抗性；puz8002对卡那霉素具有抗性。
[0139]
2.质粒dna的接合
[0140]
第1天
[0141]
·
将每种大肠杆菌et12567[puz8002]中的质粒接种到含有50μg/ml安普霉素、50μ
g/ml卡那霉素和10μg/ml氯霉素的5ml溶原肉汤(lb)液体培养基中。在35℃下250rpm孵育过夜。
[0142]
第2天
[0143]
·
每种过夜的大肠杆菌培养物取2ml接种到250ml直边烧瓶中，该烧瓶内有30ml溶原肉汤(lb)+安普霉素、卡那霉素和氯霉素。在35℃下以250rpm孵育，直到od600＝～0.6。
[0144]
·
每种大肠杆菌培养物取10ml倒入50ml离心管中，并以4000rpm的速度离心5-10分钟。然后将所得沉淀在10ml lb中洗涤3次。最终的大肠杆菌沉淀重新悬浮在500μl lb中。
[0145]
·
将3ml lb移液到板上，每种待接合的质粒收获两板棒状链霉菌孢子，使用环移出孢子，然后将lb从板转移到2ml微量离心管中。孢子在7000rpm下离心10分钟，所得沉淀在lb中洗涤一次。最终的沉淀物重新悬浮在250μl lb中。孢子在50℃下孵育10分钟，然后立即置于冰上。
[0146]
·
250μl大肠杆菌悬浮液与每份孢子试样混合。然后将该混合物涂抹在l3m9琼脂板上并在26℃下孵育过夜。
[0147]
l3m9：
[0148]
成分g/lmilliq水1升thingum糊精3海藻糖二水合物10无水正磷酸氢二钾0.5氯化钠1硫酸镁1氯化钙0.5酪蛋白氨基酸2mops缓冲液10.5硫酸锌0.001一水硫酸锰0.00076硫酸亚铁0.001roko琼脂30
[0149]
第3天
[0150]
·
向每块板覆盖安普霉素和磷霉素——将700μl的含15μl 100mg/ml安普霉素原液和45μl 50mg/ml磷霉素原液均匀涂抹在每块板上，然后将板在26℃下孵育7-10天。
[0151]
3.获得双交换
[0152]
·
通过接合获得的安普霉素抗性菌落是单交换(single-crossover)——这些菌落将在整合到棒状链霉菌染色体中的整个载体中具有突变的ccar拷贝，并且仍将包含ccar(wt)的原始拷贝。需要二次同源重组事件来去除插入的质粒dna以及ccar的原始拷贝。
[0153]
·
使用无菌木制鸡尾酒棒挑取菌落并涂在覆盖有安普霉素和磷酸霉素的l3m9板上。在26℃下孵育7-10天。
[0154]
·
一旦斑块生长并开始形成孢子，将菌株重新涂在仅含有安普霉素的l3m9板上，并在26℃下培养7-10天。
[0155]
·
随后将斑块涂在不含抗生素的l3m9板上两次。
[0156]
·
通过将3ml 10％蔗糖移液到板上，使用环将孢子移出，然后将该孢子悬浮液移入含有棉绒的无菌注射器中，从最终的l3m9板上收集孢子。将孢子推过注射器并将所得孢子悬浮液稀释至10-8
。稀释液铺在覆盖有300μl10mg/ml 5-氟胞嘧啶的l3m9板上(本工作中使用的质粒表达coda，其将5-氟胞嘧啶转化为有毒的5-氟尿嘧啶。因此，能够在5-氟胞嘧啶中生长的菌落将从其染色体中丢失该质粒)。将板在26℃下孵育7-10天。
[0157]
·
挑取菌落，将复制物(replica)铺(以斑块的形式)到含有安普霉素和不含安普霉素的l3m9板上。5天后，未在含有安普霉素的板上生长的斑块被认为丢失了已经整合到棒状链霉菌染色体中的质粒(经历了二次重组事件)。
[0158]
使用的所有构建体都包含突变的ccar区，其两侧是2kb的dna序列，该序列与棒状链霉菌基因组上发现的ccar上游和下游的序列相同，称为同源臂，这是促进质粒和棒状链霉菌基因组同源重组所必需的。在将质粒dna与棒状链霉菌接合后，突变体经历了质粒和棒状链霉菌基因组之间的单交换事件——产生了包含ccar的原始拷贝和突变的ccar和质粒dna的菌株。突变株随后在dna复制过程中进行了第二次同源重组事件，其中质粒dna丢失，并且ccar的突变副本被替换为ccar的原始副本。这些突变体被称为双交换(double-crossover)。第二次重组事件也可导致质粒和ccar的突变拷贝的切除，从而产生恢复为野生型菌株的菌株。
[0159]
位于质粒同源臂中用于突变每种菌株的基因之一是orf10。尽管该基因在棒酸合成方面的功能仍然未知，但在棒状链霉菌中敲除该基因会产生不能产生棒酸的突变体(jensen等，(2000)antimicrob.agents chemother.)。在制备ccar突变构建体的克隆步骤中，该基因中出现了点突变——这需要修复，以使ccar启动子区和基因侧翼的区域与棒状链霉菌基因组上相同位置的区域具有100％的同源性(见实施例1)。
[0160]
4.对双交换进行测序
[0161]
·
需要测序以确认菌株保留ccar的突变拷贝还是ccar的原始野生型拷贝。
[0162]
·
使用无菌环刮取安普霉素敏感斑块并将其放入50μldmso中。将其冷冻在-70℃，解冻并涡旋，然后再冷冻两次。
[0163]
·
所得混合物用作pcr反应的模板，使用phusion聚合酶和引物组nc_20和nc_21，从而产生约1.5kb的pcr产物，该产物包含已引入菌株的突变。对pcr产物进行清理并使用在pcr产物中退火的测序引物ccar_seq或ccar_seq_rev进行sanger测序。
[0164]
引物序列nc_20atatcccgggatggcaattaaagaaatgccnc_21atatactagtttacccagcccacacgtcttccar_seqaggccgacgtctgcaactggccar_seq_revcatcggatccgcccaggtc
[0165]
·
将获得的序列与棒状链霉菌ccar基因和启动子序列进行比对，以评估是否存在正确的突变。
[0166]
5.工作孢子原液的制备
[0167]
·
将棒状链霉菌突变体涂在三个l3m9板上，并在26℃下孵育2周，以在每个板上生长成菌苔。随后通过在每个板上添加3ml10％蔗糖，使用无菌10μl环刮下孢子并将其放入无
菌25ml管中来收获孢子。将每种孢子悬浮液的总体积用10％蔗糖补足为15ml，然后使用无菌超声探头以14微米的振幅超声处理30秒。随后将超声处理的孢子悬浮液等分到冷冻管中并储存在-70℃直至需要发酵。
[0168]
·
为了计算每种孢子悬浮液中每毫升的菌落形成单位的数量(cfu/ml)，将一个冷冻管解冻，并在聚山梨醇酯80(0.1％v/v)中系列稀释至10-8
。将100μl 10-7
和10-8
稀释液接种到胰蛋白酶大豆琼脂平板上，并在26℃下培养五天。随后对菌落进行计数，并计算cfl/ml。
[0169]
实施例3
[0170]
棒酸的发酵罐测定
[0171]
发酵
[0172]
在2l微发酵罐规模下测试如实施例2中所述产生的棒状链霉菌ccar突变株的棒酸积累和生长曲线，以野生型(sc2)棒状链霉菌工作原液作为对照。(测试是在五次发酵罐运行中进行的，每次运行包括十个容器。每次运行都包括野生型(sc2)对照以解释任何运行之间的不同)。
[0173]
·
将冷冻孢子原液以1.5x 105个孢子每毫升接种到500ml锥形瓶中，其中装有100ml s13a种子培养基(20g/l sofarine脱脂大豆粉、10g/l糊精、0.6g/l磷酸二氢钾、5g/l菜籽油，用10m氢氧化钠将ph调节至7.0)。烧瓶在26℃和220rpm下孵育。
[0174]
·
52小时后，将3％体积接种到含有1.4ls8a2最后阶段培养基(38.5g/lsofarine脱脂大豆粉、10g/l糊精、0.175g/l磷酸二氢钾、23g/l菜籽油、1g/lfoamdoctor
tm
消泡剂、0.1g/l六水氯化镁、0.03g/l七水硫酸亚铁、0.005g/l氯化锌、0.005g/l氯化铜、0.005g/l一水硫酸锰)的2l微发酵罐中。使用17％v/v氢氧化铵溶液将接种前培养基的ph值调节至7.0，并使用该溶液将ph值始终控制在6.8。温度保持在26℃，搅拌速度为1400rpm，气流速度为0.8vvm(空气体积/液体体积/分钟)。32％w/v麦芽糖糊精进料从24小时开始以1.4毫升/小时的速率引入并自始至终保持。5.67％w/v磷酸二氢钾进料溶液从0小时以0.3毫升/小时的速率引入直到24小时，然后增加到1.1毫升/小时直到48小时，此时终止。发酵过程自始至终对棒酸滴度进行取样，并在大约140小时时终止，如下所述。
[0175]
测定棒酸的浓度
[0176]
·
将1.5ml摇匀的肉汤倒入一次性eppendorf管中，并在4℃下以13,000rpm离心10分钟。
[0177]
·
使用hamilton
tm
稀释器将上清液以1：20稀释到cobas杯中。对每个样品进行重复稀释。
[0178]
·
稀释样品在mira s plus自动分析仪上运行，参数如下所述。该测定涉及棒酸和咪唑之间的化学反应，检测两者混合时的吸光度变化，在313nm处测量。
[0179]
通用
[0180][0181]
分析
[0182][0183]
计算
[0184]
[0185][0186]
校正
[0187][0188]
对照
[0189]
cs1位置：
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
无
[0190]
cs2位置：
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
无
[0191]
cs3位置：
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
无
[0192]
注意：测定应在30℃下进行。
[0193]
测定发酵液的粘度
[0194]
使用设置为20rpm的brookfield dv-ii+粘度计测量粘度。将1ml发酵液放入粘度计样品杯的中心，并打开电机——转动浸没在发酵液中的主轴所需的力矩，从而得到粘度
的测量值。一旦读数稳定，几秒钟后进行测量。
[0195]
结果
[0196]
引入ccar突变后在突变体中可看到的最大优势是棒酸的累积速度。在包含所有三个突变(m1+m2+m3)的突变体的情况下，发现棒酸滴度在发酵进入65log小时达到峰值，然后趋于平稳(参见图1和图3)。因此，65log小时的时间点将用于比较所有菌株的棒酸生产率。
[0197]
ccar启动子区和基因中所有三个突变(m1+m2+m3)的存在产生了最高的棒酸滴度，与对照(野生型棒状链霉菌)相比，在65log小时的滴度提高了1031％(参见表1、图1、图2和图3)。次高的滴度是由单独携带m2突变的菌株实现的(65log小时的滴度为对照的808％)，强调尽管这似乎是三个突变中最具影响力的，但其他两个需要与此结合才能完全最大化对滴度的影响。m1和m3无论是单独还是组合存在，都使滴度增加，但没有达到与将它们与m2组合后的相同程度，在65log小时后，m1、m3、和m1+m3的滴度比野生型对照分别增加163％、145％和133％。
[0198]
表1
[0199][0200]
表2中提供了如通过突变菌株所观察到的65log小时时的粘度、平均峰值粘度、相对于野生型对照65log小时时的百分比粘度和的百分比峰值粘度的数据。
[0201]
表2
[0202][0203]
ccar突变降低了峰值产量时的粘度以及所观察到的峰值粘度(参见表2、图4和图5)。在65log小时时，携带所有三种突变(m1+m2+m3)的菌株在发酵过程中粘度降低最大，其次是仅携带m2的菌株，与野生型对照相比，粘度降低了41％和32％。
[0204]
低粘度与高生产率相结合是棒状链霉菌发酵中非常理想的属性。
[0205]
在图1、2、3和4中，误差线表示从多次发酵运行中获得的数据
±
一个标准偏差。
[0206]
序列表
[0207]
seq id no：1：野生型ccar启动子区和基因的核酸序列。
[0208]
seq id no：2：野生型ccar基因的氨基酸序列。
[0209]
seq id no：3：包含本文所述突变的ccar启动子区和ccar基因的核酸序列。
[0210]
seq id no：4：包含本文所述取代突变ccar基因的氨基酸序列。
[0211]
seq id no：1
[0212]
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[0213]
seq id no：2
[0214]
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[0215]
seq id no：3
[0216][0217][0218]
(突变位置(m1＝48,m2＝143,m3＝344)以粗体和下划线表示)
[0219]
seq id no：4
[0220][0221]
(m3突变位置(r32w)以粗体和下划线表示)