MASP抑制化合物及其用途的制作方法

masp抑制化合物及其用途
1.本发明涉及新型与甘露糖结合凝集素(mbl)相关的丝氨酸蛋白酶(masp)抑制化合物及其类似物和衍生物、其制备方法、其单独或组合用于治疗和/或预防疾病的用途，以及其用于制备用于治疗和/或预防疾病，尤其是用于治疗和/或预防肾脏和心血管病症以及缺血再灌注损伤的药物的用途。
2.补体系统由蛋白质、受体和酶的复杂级联网络组成，其中许多在血流中循环。补体系统是先天免疫的重要组成部分，对于防御入侵病原体和清除死细胞和病毒感染的细胞至关重要。它在先天免疫反应和适应性免疫反应之间架起了一座桥梁。补体系统的激活也参与败血症和缺血再灌注损伤(例如在心肌梗塞、缺血性肾损伤或器官移植后)的病理学。已经确定补体系统的三个分支：凝集素途径、典型途径和替代途径(dunkelberger和song，complement and its role in innate and adaptive immune responses.cell res.2010；20(1)：34-50)。凝集素途径通过沉积在血流中循环的凝集素而激活，并且在通常条件下通过分别识别外来和改变的碳水化合物表面模式并修饰它们的表面，从而具有对抗入侵病原体和死细胞的哨兵(sentinel)功能。甘露糖结合凝集素(mbl)、纤维胶凝蛋白(ficolin)和胶原凝集素(collectin)是这些产生于肝脏、肾脏和其他器官中的凝集素的主要代表(garred等人，a journey through the lectin pathway of complement-mbl and beyond.immunol rev.2016；274(1)：74-97)。它们沉积之后，进一步从血流中补充(recruitment)基本上两种密切相关的丝氨酸蛋白酶的酶原，与甘露糖结合凝集素相关的丝氨酸蛋白酶1和2(masp-1和masp-2)形成复合物，其中酶原彼此靠近。目前的理论是在体内条件下，masp-1酶原在补充后自我激活，然后通过裂解激活masp-2酶原。激活的masp-1进一步将补体因子c2裂解成c2a和c2b。激活的masp-2还裂解c2并将补体因子c4裂解成c4a和c4b，其与c2a一起形成c4bc2a复合物，其作为补体因子c3转化酶。c3转化酶活性和靶细胞c3连续沉积到靶细胞表面的构成代表所有三种补体途径的汇聚点，其激活共同的下游级联反应，导致炎症介质的产生和靶细胞裂解。在完整的人血清中，两种masp酶的活性对于c3转化酶的形成都是必不可少的(h
é
ja等人，revised mechanism of complement lectin-pathway activation revealing the role of serine protease masp-1as the exclusive activator of masp-2.proc natl acad sci u s a.2012；109(26)：10498-503)。
3.微血管系统在炎症和缺血性器官病症中起重要作用。屏障功能、白细胞运输和凝血控制密切依赖于小血管中管腔内皮细胞表面的完整性。管腔内皮表面衬有一层致密的来自膜整合的糖蛋白、蛋白聚糖和糖脂的糖基化延伸层，其整体称为糖萼(glycokalyx)。对来自动物实验和人类病理学样本的电子显微镜分析表明，特别是内皮糖萼在缺血性挑战以及炎症条件下(如败血症)会迅速而根本地降解。这些变化导致碳水化合物残余物暴露在正常条件下无法检测到的血流中(综述参见：sieve等，regulation and function of endothelial glycocalyx layer in vascular diseases.vascul pharmacol.2018；100：26-33)。除了细胞表面的其他变化，特别是改变的碳水化合物模式被认为激活凝集素途径，导致模式识别凝集素的沉积、随后的c3沉积和细胞裂解的启动。mbl和c3沉积显示发生在包
括人类在内的物种的缺血和急性肾损伤之后。凝集素途径激活与再灌注损伤特别相关，因为mbl和masp-2的靶向缺失保护小鼠免受肾脏心脏和肠道的缺血再灌注损伤(moller-kristensen等人，mannan-binding lectin recognizes structures on ischaemic reperfused mouse kidneys and is implicated in tissue injury.scand j immunol.2005；61(5)：426-34；schwaeble等人，targeting of mannan-binding lectin-associated serine protease-2confers protection from myocardial and gastrointestinal ischemia/reperfusion injury.proc natl acad sci u s a.2011；108(18)：7523-8)。此外，胶原凝集素11(另一种主要在肾脏中表达的masp激活凝集素)的缺失使小鼠对缺血性急性肾损伤具有抵抗力(farrar等人，collectin-11detects stress-induced l-fucose pattern to trigger renal epithelial injury.j clin invest.2016；126(5)：1911-1925)。masp 1和masp 2的选择性肽抑制剂已从噬菌体展示库中鉴定出来，该库采用来自向日葵或蚱蜢的天然胰蛋白酶抑制剂作为起点。这些肽已显示在体外抑制凝集素途径依赖的c3转化酶形成(kocsis等人，selective inhibition of the lectin pathway of complement with phage display selected peptides against mannose-binding lectin-associated serine protease(masp)-1and-2：significant contribution of masp-1 t0 lectin pathway activation.j immunol.2010；185(7)：4169-78；h
é
ja等人，monospecific inhibitors show that both mannan-binding lectin-associated serine protease-1(masp-1)and are essential for lectin pathway activation and reveal structural plasticity of masp-2.j biol chem.2012；287(24)：20290-300)。然而，尚无关于这些肽抑制剂的药物实用性和体内功效的证据。同样，干扰masp酶原相互作用的针对masp-2的抗体已被鉴定并用于非典型溶血性尿毒症综合征和其他炎性肾病的临床开发(clinicaltrials.gov identifier：nct03205995；nct02682407；nct03608033)。然而，仍然缺少用于预防或治疗急性、特别是缺血性器官损伤的实用性的临床证据。
4.wo 2004/075837公开了抗-masp抗体、其功能等效片段和masp结合肽，用于通过抑制补体系统降低与缺血-再灌注损伤或taaa修复相关的组织损伤引起的发病率和死亡率。用于治疗与补体系统(主要是凝集素途径)相关的疾病的小肽(如向日葵masp抑制剂-1(sfmi-1)和向日葵masp抑制剂-2(sfmi-2)及其衍生物)首次记载于wo2010/136831中。
5.wo 2015/054298公开了通过降低masp-1、masp-2或masp-3的活性来保护受试者的视力或减少视力丧失以及抑制或减少受试者的感光细胞死亡的方法。wo 2004/106384、wo 2005/123128、wo 2007/117996和wo 2014/144542公开了用于治疗与masp-2-依赖性补体激活相关的疾病的抗-masp-2抗体。
6.本发明的目的为提供新型肽，其对masp-1和/或masp-2酶具有抑制作用并具有其他有益特性，使其适合作为用于预防和/或治疗与masp-1和/或masp-2相关的如下定义的疾病的有效和安全的替代品。另一个目的为提供对人masp-1和/或masp-2酶和/或大鼠masp-1和/或masp-2酶具有改善的抑制作用的新型肽。
7.本发明一般涉及用作masp-1和/或masp-2酶抑制剂的肽及其制备和使用方法。
8.特别地，本发明提供含有可以被分离和/或纯化的肽或衍生物、前药、类似物、药学上可接受的盐、溶剂合物或盐的溶剂合物的化合物，所述肽包含以下结构式(i)、基本上由
以下结构式(i)组成或由以下结构式(i)组成：
9.(x0)
p
(x1)q(x2)rx3x4x5x6x7x8x9x
10
x
11
x
12
(x
13
)s(x
14
)
t
(x
15
)uꢀꢀ
(i)，
10.其中
11.x0代表式(iia)的基团
[0012][0013]
其中
[0014]
＊标记与相邻氨基酸的末端氨基连接的键，
[0015]
a为键或c
1-c
6-亚烷基，其中c
1-c
6-亚烷基中的一个ch2基团可以替换为-o-或-s-，并且其中c
1-c
6-亚烷基至多被选自羟基、甲氧基、乙氧基、羧基、氨基和卤素的基团相同或不同地三取代，
[0016]
b为不存在、芳基、杂芳基、c
3-c
8-环烷基或c
3-c
7-杂环烷基，
[0017]
其中芳基、杂芳基、c
3-c
8-环烷基和c
3-c
7-杂环烷基至多可以被选自c
1-c
4-烷基、羟基、甲氧基、乙氧基、羰基、羧基、氨基和卤素的基团相同或不同地三取代，和
[0018]
r1为氢、卤素、氨基、羟基或c
1-c
20-烷基，其中c
1-c
20-烷基至多被选自羟基、羧基、氨基和卤素的基团相同或不同地三取代，
[0019]
p代表整数0或1，
[0020]
x1代表任何天然氨基酸或非天然氨基酸，而任何天然氨基酸和/或非天然氨基酸可为d-或l-立体构型，
[0021]
并且在p为0且q不为0的情况下，x1的末端氨基为未取代的、乙酰化的或被c
1-c
20-烷基单取代或双取代的，
[0022]
q表示0至5的整数，
[0023]
x2代表选自i、l、m、v和a的天然氨基酸，或选自以下的非天然氨基酸：l-n-甲基异亮氨酸((n-me)i)、别-l-异亮氨酸(别-i)、l-环丁基丙氨酸(cba)、l-正缬氨酸(nva)、l-2-氨基丁酸(abu)、(2s，3s)-2-[(3r)-3-氨基-2-氧代吡咯烷-1-基]-3-甲基戊酸、(2s，3s)-2-[2-氧代哌嗪-1-基]-3-甲基戊酸、(2s，3s)-2-[(3s)-2-氧代哌嗪-1-基]-3-甲基戊酸、l-甲硫氨酸-l-亚砜、l-甲硫氨酸-砜和l-叔丁基甘氨酸，
[0024]
而每个l-立体构型的天然氨基酸和/或非天然氨基酸都可以被d-立体构型的立体异构体替代，
[0025]
并且在p和q均为0且r为1的情况下，x2的末端氨基为未取代的、乙酰化的或被c
1-c
20-烷基单取代或双取代的，
[0026]
r代表整数0或1，
[0027]
x3代表天然氨基酸c，或选自l-青霉胺(pen)和l-n-甲基半胱氨酸((n-me)c)的非天然氨基酸，
[0028]
在p和q和r均为0的情况下，x3的末端氨基为未取代的、乙酰化的或被c
1-c
20-烷基单取代或双取代的，
[0029]
x4代表选自s、c、t、r或k的天然氨基酸，或选自别-l-苏氨酸(别-t)、l-高丝氨酸(hser)的非天然氨基酸和l-鸟氨酸(orn)，
[0030]
x5代表天然氨基酸r或n(5)-甲基-l-精氨酸((me)r)，
[0031]
x6代表选自s、c或t的天然氨基酸，或选自别-l-苏氨酸(别-t)和l-2，3-二氨基丙酸(dap)，
[0032]
x7代表选自l、f或n的天然氨基酸或选自以下的非天然氨基酸：2，3，3a，4，5，6，7，7a-八氢吲哚-2-羧酸(oic)、l-4-溴苯丙氨酸((4-bromo)f)、2，5-二氟-l-苯丙氨酸((2，5-二-氟)f)、l-叔丁基丙氨酸((tbu)a)、2-氯-l-苯丙氨酸((2-氯)f)、l-2-溴苯丙氨酸((2-溴)f)、(s)-2-(氨基)-1，6-己二酸(aad)、(2s)-2-氨基-4，4，4-三氟丁酸、l-2-氨基-4-氰基丁酸(cnba)、4-氟-亮氨酸((4-氟)l)、(s)-(三氟甲基)-l-半胱氨酸、(2s)-2-氨基-3-(1-甲基环丙基)丙酸、l-叔丁基甘氨酸((tbu)g)、3-(三甲基甲硅烷基)-l-丙氨酸、2，5-二氟-l-苯丙氨酸、2-氨基-7-(叔丁氧基)-7-氧代庚酸、5，5，5-三氟-l-亮氨酸((三氟)l)、2-甲基-l-苯丙氨酸((2-me)f)、l-环丁基丙氨酸(cba)、l-环戊基丙氨酸(cpa)、l一环丙基甲基丙氨酸、l-三氟甲基丙氨酸、l-二氟甲基丙氨酸、2-氟-l-苯丙氨酸((2-氟)f)、(2s)-3-(2，3-二氟苯基)-2-氨基丙酸、(2s)-3-(3-氰基苯基)-2-氨基丙酸和(2s)-3-(吲哚-4-基)-2-(氨基)丙酸，
[0033]
x8代表天然氨基酸p，或选自以下的非天然氨基酸：(1s，2s，5r)-3-氮杂双环[3.1.0]己烷-2-羧酸、l-羟基脯氨酸(hyp)、(3s)-吗啉-3-羧酸(吗啉-3-羧基)、l-高脯氨酸(pip)、(4ar，6ar，9s，11as)-11-氧代-2，3，4，4a，6a，7，8，9，11，11a-十氢-1h-吡啶并[3，2-e]吡咯并[1，2-a]氮杂-9-羧酸、反式-4-氟脯氨酸((反式-4-氟)p)和(1r，2s，5s)-3-氮杂双环[3.1.0]己烷-2-羧酸，
[0034]
x9代表天然氨基酸p，或选自以下的非天然氨基酸：2，3，3a，4，5，6，7，7a-八氢吲哚-2-羧酸(oic)、l-羟脯氨酸(hyp)、(2s，4s)-4-三氟甲基-四氢吡咯-2-羧酸((4-cf3)p)、(2s，4s)-4-氟脯氨酸((顺式-4-氟)p)、反式-4-氟脯氨酸((反式-4-氟)p)，(2s)-2-氨基-4，4，4-三氟丁酸、l-反式-3-羟基脯氨酸((3s-oh)p、(1r，3s，5r)-2-氮杂双环[3.1.0]己烷-3-羧酸、(6s)-5-氮杂螺-[2.4]庚烷-6-羧酸、rel-(1r，3r，5r，6r)-6-(三氟甲基)-2-氮杂双环[3.1.0]己烷-3-羧酸、(2s)-2-氨基-4，4，4-三氟丁酸、(2s，3as，6as)-八氢环戊二烯并ib]吡咯-2-羧酸，反式-4-氟脯氨酸((反式-4-氟)p)、(2s，4s)-4-氟脯氨酸((顺式-4-氟)p)，l-4，4-二氟脯氨酸((二氟)p)、rel-(3r，6r)-1，1-二氟-5-氮杂螺[2.4]庚烷-6-羧酸(对映异构体1)和rel-(3r，6r)-1，1-二氟-5-氮杂螺[2.4]庚烷-6-羧酸(对映异构体2)，
[0035]
x
10
代表天然氨基酸i，或选自以下的非天然氨基酸：l-环戊基甘氨酸(cpg)、l-环己基甘氨酸(chg)、(s)-2-氨基-3-乙基-戊酸、3-氯苯基甘氨酸((3-氯-ph)g)、l-叔丁基甘氨酸、别-l-异亮氨酸(别-i)、l-环丁基甘氨酸、l-正缬氨酸(nva)和(2s)-2-(氨基)-2-[(1s，3r)-3-羟基环己基]乙酸，
[0036]
x
11
代表天然氨基酸c，或选自l-n-甲基半胱氨酸((n-me)c)和l-青霉胺(pen)的非天然氨基酸，
[0037]
x
12
代表天然氨基酸i，或选自以下的非天然氨基酸：别-l-异亮氨酸(别-i)、(s)-2-氨基-2-环丁基乙酸(cbg)、(2s，3s)-2-((氨基)甲基)-3-甲基戊酸、l-苯基甘氨酸(phg)、2-[(1s，2s)-1-(氨基)-2-甲基丁基]-1，3-噁唑-4-羧酸、2-甲基-d-别异亮氨酸、l-正缬氨酸(nva)、l-2-氨基丁酸(abu)、l-叔丁基甘氨酸和氨基异丁酸(aib)，
[0038]
在u和t和s均为0的情况下，x
12
的末端羧基为未取代的或酰胺化的，
[0039]
x
13
代表选自p、a、s、t、g、d、e、q或n的天然氨基酸，或选自以下的非天然氨基酸：n-甲基-甘氨酸((n-me)g)、5-氮杂螺-[2.4]庚烷-6-羧酸、l-2-氨基丁酸(abu)、2-氨基异丁酸(aib)、2-甲基-l-脯氨酸(2-me)p、羟基脯氨酸(hyp)、2，3，3a，4，5，6，7，7a-八氢吲哚-2-羧酸(oic)、反式-4-氟脯氨酸((反式-4-氟)p)、(2s，4s)-4-氟脯氨酸((顺式-4-氟)p)、l-4，4-二氟脯氨酸((二氟)p)、l-环戊基甘氨酸(cpg)、(s)-2-氨基-2-环丁基乙酸(cbg)和(2s)-吡咯烷-2-基乙酸(β-高-p)，
[0040]
而每个l-立体构型的天然氨基酸和/或非天然氨基酸都可以被d-立体构型的立体异构体替代，
[0041]
如果u和t均为0且s不为0，则x
13
的末端羧基未被取代或酰胺化，
[0042]
s代表0至3的整数，
[0043]
x
14
代表任何天然氨基酸或非天然氨基酸，而任何天然氨基酸和/或非天然氨基酸可以是d-或l-立体构型，
[0044]
如果u为0且t不为0，则x
14
的末端羧基未被取代或酰胺化，
[0045]
t代表0至4的整数，
[0046]
x
15
代表式(iib)的基团
[0047][0048]
其中
[0049]
＊标记与相邻氨基酸末端羧基连接的键，
[0050]
a1为键或c
1-c
6-亚烷基，其中c
1-c
6-亚烷基中的一个ch2基团可以替换为-o-或-s-，并且其中c
1-c
6-亚烷基至多被选自羟基、甲氧基、乙氧基、羧基、氨基和卤素的基团相同或不同地三取代，
[0051]
b1为不存在、芳基、杂芳基、c
3-c
8-环烷基或c
3-c
7-杂环烷基，
[0052]
其中芳基、杂芳基、c
3-c
8-环烷基和c
3-c
7-杂环烷基可以至多被选自c
1-c
4-烷基、羟基、甲氧基、乙氧基、羰基、羧基、氨基和卤素的基团相同或不同地三取代，和
[0053]
r2为氢、卤素、氨基、羟基或c
1-c
20-烷基，其中c
1-c
20-烷基至多被选自羟基、羧基、氨基和卤素的基团相同或不同地三取代，
[0054]
u代表整数0或1，
[0055]
条件是x1至x
14
中的至少一个为非天然氨基酸。
[0056]
本发明进一步提供了含有下式(ii)的肽或衍生物、前药、类似物、药学上可接受的盐、溶剂合物或盐的溶剂合物的化合物，
[0057]
(x1)q(x2)rx3x4x5x6x7x8x9x
10
x
11
x
12
(x
13
)s(x
14
)
t
ꢀꢀ
(ii)，
[0058]
其中
[0059]
x1代表天然氨基酸或非天然氨基酸，
[0060]
q代表整数0或1，
[0061]
x2代表天然氨基酸i，
[0062]
r代表整数0或1，
[0063]
x3代表天然氨基酸c或非天然氨基酸l-青霉胺(pen)，
[0064]
x4代表天然氨基酸s，
[0065]
x5代表天然氨基酸r或非天然氨基酸n(5)-甲基-l-精氨酸((me)r)，
[0066]
x6代表天然氨基酸s，
[0067]
x7代表天然氨基酸l或非天然氨基酸l-叔丁基丙氨酸((tbu)a)，
[0068]
x8代表天然氨基酸p或非天然氨基酸l-脯氨酸(3，4-2
h)，
[0069]
x9代表天然氨基酸p或非天然氨基酸2，3，3a，4，5，6，7，7a-八氢吲哚-2-羧酸(oic)，
[0070]
x
10
代表天然氨基酸i，
[0071]
x
11
代表选自l-n-甲基半胱氨酸((n-me)c)和l-青霉胺(pen)的非天然氨基酸
[0072]
x
12
代表天然氨基酸i，
[0073]
x
13
代表天然氨基酸p，
[0074]
s代表整数0或1，
[0075]
x
14
代表选自d、q和e的天然氨基酸，
[0076]
t代表整数0或1，
[0077]
其中肽的n-末端未被取代、乙酰化或被c
1-c
20-烷基单取代或双取代，
[0078]
其中肽的c-末端未被取代或酰胺化，和
[0079]
其中肽是环化的，优选通过连接x3和x
11
的键连接。
[0080]
除非本文另有定义，否则本技术中使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。通常，本文所述的与化学、分子生物学、细胞和癌症生物学、免疫学、微生物学、药理学以及蛋白质和核酸化学相关的命名和技术是本领域公知和常用的那些。
[0081]
贯穿本说明书，词语“包含(comprise)”或其变体例如“包含(comprises)”或“包含(comprising)”将被理解为暗示包括规定的整数(或组分)或整数组(或组分)，但不排除包括任何其他整数(或组分)或整数组(或组分)。除非上下文另有明确规定，单数形式“一”、“一个”和“所述”包括复数形式。术语“包括(including)”和“包含(containing)”用于表示“包括但不限于”，这两个表达可以互换使用。特别地，表述“含有肽的化合物”意指含有确定的肽序列并且可以任选地含有与肽共价结合的其他化学基团或取代基的化合物，例如氨基酸、脂肪酸、化学基团以增强肽或任何其他化学基团的药效学或药代动力学特性。还应理解，表述“含有肽的化合物”明确包括确定的肽序列，没有与该肽共价结合的任何其他化学基团或取代基。
[0082]
如本文所用，除非另有说明，否则以下术语具有赋予它们的含义。“基本上由......组成”理解为肽与其比较的肽至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同。
[0083]
术语“蛋白质”、“多肽”和“肽”可互换使用以泛指连接(优选通过肽(酰胺)键连接)在一起的两个或多个氨基酸的序列。当一个氨基酸的羧基与另一个氨基酸的氨基反应时，形成肽(酰胺)键。还应理解，术语“蛋白质”、“多肽”和“肽”并不表示氨基酸聚合物的特定长度，也不旨在暗示或区分多肽是使用重组技术、化学或酶促合成产生的，还是天然存在的。还应理解，在本技术的定义下，肽可包含一个或多个不是氨基酸的部分。这些部分优选存在于肽的n-和c-末端。
[0084]
如本文所用，术语“氨基酸”或“任何氨基酸”是指含有胺基(-nh2)和羧基(-cooh)
官能团以及侧链的有机化合物，是指任何和所有氨基酸，包括天然存在的氨基酸(例如，α-l-氨基酸)、非天然氨基酸、修饰的氨基酸和非天然氨基酸。“天然氨基酸”包括那些在自然界中发现的氨基酸，例如结合成肽链以形成大量蛋白质的组成部分的23种氨基酸。这些主要是l立体异构体，尽管一些d-氨基酸存在于细菌包膜和一些抗生素中。表2列出了标准遗传密码中的20种蛋白原天然氨基酸。“非标准”天然氨基酸是吡咯赖氨酸(存在于产甲烷生物和其他真核生物中)、硒代胱氨酸(存在于许多非真核生物以及大多数真核生物中)和n-甲酰甲硫氨酸(在细菌、线粒体和叶绿体中由起始密码子aug编码)。
[0085]“非天然(unnatural)”或“非天然(non-natural)”氨基酸是天然存在或化学合成的非蛋白氨基酸(即非天然编码或在遗传密码中发现的那些)。已知超过140种天然氨基酸，并且可能有数千种组合。“非天然”氨基酸的实例包括β-氨基酸(β3和β2)、高氨基酸、脯氨酸和丙酮酸衍生物、3-取代的丙氨酸衍生物、甘氨酸衍生物、环取代的苯丙氨酸和酪氨酸衍生物、线性核心氨基酸、二氨基酸、d-氨基酸和n-甲基氨基酸。非天然或非天然氨基酸还包括修饰的氨基酸。“修饰的”氨基酸包括已经被化学修饰以包括氨基酸中非天然存在的一个基团、多个基团或化学部分的氨基酸(例如，天然氨基酸)。根据本发明，优选的非天然氨基酸列于表1中。表1显示了作为d-和/或l-立体异构体的非天然氨基酸，然而，本发明优选的非天然氨基酸为列于表1中的非天然的d-和l-立体异构体。
[0086]
表1：优选的非天然氨基酸
[0087]
[0088]
[0089]
[0090]
[0091]
[0092][0093]
更优选的非天然氨基酸选自n-甲基-丙氨酸(n-me)a、n-甲基-甘氨酸((n-me)g)、(1r，3s，4s)-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-3-羧酸、l-3-溴苯丙氨酸((3-溴)f)、l-n，n-二甲基丙氨酸((n，n-dime)a)、n，n-二甲基甘氨酸((n，n-dime)g)、n-苯基甘氨酸((n-ph)g)、(r)-哌啶-3-羧酸、(s)-哌啶-3-羧酸、l-叔丁基丙氨酸((tbu)a)、l-2-吡啶基丙氨酸(2-pal)、l-3-吡啶基丙氨酸(3-pal)、l-4-吡啶基丙氨酸(4-pal)、3-(氨基甲基)苯甲酸、3-氨基-2，2-二甲基丙酸、3-氨基-3-甲基丁酸、4-(氨基甲基)苯甲酸、l-2-氨基丁酸(abu)、1-氨基环丁烷-1-羧酸(acba)、6-氨基己酸(ahx)、2-氨基异丁酸(aib)、l-2-噻吩丙氨酸(β-2-噻吩丙氨酸)、β-丙氨酸(β-a)、β-脯氨酸(β-p)、l-瓜氨酸(cit)、l-2，4-二氨基丁酸(dab)、l-2，3-二氨基丙酸(dap)、γ-氨基丁酸(γ-abu)、l-3-甲基组氨酸(3-me)h)、l-二氢乳清酸(hoo)、l-正亮氨酸(nle)、n-甲基-l-脯氨酸((n-me)p)、l-正缬氨酸(nva)、l-鸟氨酸(orn)、l-高脯氨酸(pip)、(2s)-2[(氨基)-2-(四氢-2h-吡喃-4-基)]乙酸；2，3，3a，4，5，6，7，7a-八氢吲哚-2-羧酸(oic)、l-n-甲基半胱氨酸((n-me)c)、n(5)-甲基-l-精氨酸((me)r)、l-青霉胺(pen)和氨甲环酸(传明酸)。
[0094]
最优选的非天然氨基酸选自n-甲基-l-丙氨酸(n-me)a、n-甲基-甘氨酸((n-me)g)、l-正亮氨酸(nle)、l-正缬氨酸(nva)、l-鸟氨酸(orn)、n(5)-甲基-l-精氨酸((me)r)、l-叔丁基丙氨酸((tbu)a)、2，3，3a，4，5，6，7，7a-八氢吲哚-2-羧酸(oic)、l-n-甲基半胱氨酸((n-me)c)和l-青霉胺(pen)。
[0095]
还应理解，本发明的肽可以包含一个或多个在本发明的定义下不是氨基酸的化学基团。这些化学基团可以存在于肽的n-末端和/或c-末端，并由式x0和x
15
表示。应当理解，本发明的肽的所有氨基酸和化学基团均通过肽(酰胺)键连接。通常肽是通过连接α-氨基酸的α-氨基和羧基形成的，然后通过α-肽键连接。根据本发明，肽键可由存在于相应的天然或非天然氨基酸中的任何羧基和氨基形成。例如，除α-氨基外还含有第二个氨基的α-氨基酸(例如l-赖氨酸)或除α-羧基外还含有第二个羧基的α-氨基酸(例如，l-天冬氨酸和l-谷氨酸)可以通过其他的氨基或羧基连接。
[0096]
根据本领域技术人员的理解，本文公开的肽序列代表通过α-肽键连接的氨基酸序列。通过肽键(非α-肽键)连接的氨基酸用“＊”标记。“＊”位于氨基酸的左侧或右侧，以表明该氨基酸的其他氨基或其他羧基是否用于连接相邻氨基酸的肽键(例如(＊l)、(e＊)、(＊dap)等)。
[0097]
根据本领域技术人员的理解，本文公开的肽序列从左到右显示，序列的左端为肽的“n-末端”(“氨基末端”、“n-末端”)，序列的右端为肽的“c-末端”(“羧基末端”，“c-末端”)。该术语n-末端(氨基末端，n-末端)”适用，无论肽在n-末端实际是否含有氨基。该术语c-末端(羧基末端，c-末端)适用，无论肽在c-末端实际是否含有羧基。术语“末端氨基”是指存在于n-末端的任何氨基。术语“末端羧基”是指存在于c-末端的任何羧基。
[0098]
根据本发明，在p代表1的情况下，n-末端可以由x0形成。或者在q代表至少1并且p代表0的情况下，n-末端可以由x1形成。或者在r代表1，p和q均代表0的情况下，n-末端可以由x2形成。在p、q和r均代表0的情况下，在线性肽的情况下，n-末端由x3形成。如果本发明的肽通过连接x3和x
11
的键环化并且p、q和r均代表0，则该肽不包含n-末端。
[0099]
根据本发明，在u代表1的情况下，c-末端可由x
15
形成。或者在t代表至少为1的整数且u代表0的情况下，c-末端可由x
14
形成。或者在s代表1，且t和u均代表0的情况下，c-末端可由x
13
形成。在s、t和u均代表0的情况下，c-末端可以由x
12
形成。
[0100]
在本发明中，本文使用的天然存在和非天然存在的氨酰基残基的名称优选遵循iupac commission on the nomenclature of organic chemistry和iupac-iub commission on biochemical nomenclature建议的命名规定，如nomenclature of α-amino acids(recommendations，1974)，biochemistry，14(2)，(1975)所列出的。
[0101]
在本说明书中，天然存在的蛋白氨基酸通常用它们的常规单字母缩写命名。或者，它们也可以通过它们的三个字母的缩写(例如特别是在序列表中)或它们的全名来表示，如下表2所示：
[0102]
表2：天然氨基酸的标准缩写
[0103][0104]
对于非蛋白氨基酸或非天然存在的氨基酸，除非以其全名(例如鸟氨酸等)提及，否则对其残基通常使用三至六个字符的代码，包括如下文中的缩写列表(表3)中的所示的那些缩写。
[0105]
如本文所用，术语“l-氨基酸”是指氨基酸的“l”异构形式，相反，术语“d-氨基酸”是指氨基酸的“d”异构形式。用大写字母如ala/a、arg/r等表示l-氨基酸，用小写字母如ala/a、arg/r等表示d-氨基酸也是一种常规方式。
[0106]
如上表2所示表格中的三字母代码(code)(即ala、arg、asn等)，并且如本说明书中通常使用的，除非另有明确说明，一般应包括d-和l-形式以及高-(homo-)和正-(nor)形式。前缀“正”是指一种结构类似物，其可以通过去除一个碳原子以及伴随的氢原子而衍生自母体化合物。前缀“高”表示同源系列中的下一个更高的成员。对特定异构形式的引用将由如上所述的大写前缀l-或d-表示(例如d-arg、l-arg等)。因此，对高-形式或正-形式的具体引用将由各自的前缀(例如高-arg、高-r、正-arg、正-r、高-cys、高-c等)明确表示。
[0107]
术语“c
1-c
6-烷基”是指具有1、2、3、4、5或6个碳原子的直链或支链饱和单价烃基，例如甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、仲丁基、异丁基、叔丁基、戊基、异戊基、2-甲基丁基、1-甲基丁基、1-乙基丙基、1，2-二甲基丙基、新戊基、1，1-二甲基丙基、己基、1-甲基戊基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、4-甲基戊基、1-乙基丁基、2-乙基丁基、1，1-二甲基丁基、2，2-二甲基丁基、3，3-二甲基丁基、2，3-二甲基丁基、1，2-二甲基丁基或1，3-二甲基丁基或其异构体。特别地，所述基团具有1、2、3或4个碳原子(“c
1-c
4-烷基”)，例如甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、仲丁基、异丁基或叔丁基，更特别地具有1、2或3个碳原子(“c
1-c
3-烷基”)，例如甲基、乙基、正丙基或异丙基。特别优选的为甲基、乙基、正丙基。最优选的为甲基。
[0108]
术语“c
1-c
20-烷基”是指具有1至20个碳原子的直链或支链饱和单价烃基，例如甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、仲丁基、异丁基、叔丁基或戊基、异戊基、己基、异己基、庚基、异庚基、辛基和异辛基、壬基、癸基、十二烷基或二十烷基。
[0109]
术语“c
1-c4一亚烷基”是指具有1至4个碳原子的直链或支链烃桥(hydrocarbon bridge)，例如亚甲基、亚乙基、亚丙基、α-甲基亚乙基、β-甲基亚乙基、α-乙基亚乙基、β-乙基亚乙基、亚丁基、α-甲基亚丙基、β-甲基亚丙基和γ-甲基亚丙基。
[0110]
术语“c
1-c
6-亚烷基”是指具有1至6个碳原子的直链或支链烃桥，例如亚甲基、亚乙
基、亚丙基、α-甲基亚乙基、β-甲基亚乙基、α-乙基亚乙基、β-乙基亚乙基、亚丁基、α-甲基亚丙基、β-甲基亚丙基、γ-甲基亚丙基、α-乙基亚丙基、β-乙基亚丙基、γ-乙基亚丙基、亚戊基和亚己基。
[0111]
术语“c
3-c
8-环烷基”是指含有3、4、5、6、7或8个碳原子的饱和烃环。所述c
3-c
8-环烷基为例如单环烃环，例如环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基或环辛基，双环烃环，例如双环[4.2.0]辛基或八氢并环戊二烯基(octahydropentalenyl)，或桥接或笼状饱和环基团，例如降冰片烷或金刚烷和立方烷。
[0112]
术语“c
3-c
7-杂环烷基”是指含有一个或两个来自n、o和s组的相同或不同的环杂原子的具有4、5、6或7个的饱和杂环，所述杂环烷基可以通过任何一个碳原子或氮原子(如果存在)连接至分子的其余部分。所述c
3-c
7-杂环烷基，可以为但不限于四元环，例如氮杂环丁烷基、氧杂环丁烷基或硫杂环丁烷基；或五元环，例如四氢呋喃基、1，3-二氧戊环、硫杂环戊烷基、吡咯烷基、咪唑烷基、吡唑烷基、1，1-二氧硫杂环戊烷基、1，2-噁唑烷基、1，3-噁唑烷基或1，3-噻吩基；或6元环，例如四氢吡喃基、四氢噻喃基、哌啶基、吗啉基、二噻吩基、硫代吗啉基、哌嗪基、六氢嘧啶基、1，3-二噁烷基、1，4-二噁烷基或1，2-噁嗪基(1，2-oxazinanyl)；或7元环，例如氮杂环庚烷基(azepanyl)、1，4-二氮杂环庚烷基(1，4-diazepanyl)或1，4-氧杂氮杂环庚烷基(1，4-oxazepanyl)。
[0113]
术语“芳基”是指具有6至10个碳原子的不饱和或部分不饱和环。优选的芳基为苯基和萘基。
[0114]
术语“杂芳基”是指单价的具有5、6、8、9、10、11、12、13或14个环原子(“5至14元杂芳基”基团)，特别是5、6、9或10个环原子的单环、双环或三环芳环，其包含至少一个环杂原子和任选的一个、两个或三个来自n、o和/或s组的其他环杂原子，并且其通过环碳原子或任选地通过环氮原子连接(如果化合价允许))。所述杂芳基可以是5元杂芳基，例如噻吩基、呋喃基、吡咯基、噁唑基、噻唑基、咪唑基、吡唑基、异噁唑基、异噻唑基、噁二唑基、三唑基、噻二唑基或四唑基；或6元杂芳基，例如吡啶基、哒嗪基、嘧啶基、吡嗪基或三嗪基；或三环杂芳基，例如咔唑基、吖啶基或吩嗪基；或9元杂芳基，例如苯并呋喃基、苯并噻吩基、苯并噁唑基、苯并异噁唑基、苯并咪唑基、苯并噻唑基、苯并三唑基、吲唑基、吲哚基、异吲哚基、吲哚茚基或嘌呤基；或10元杂芳基，例如喹啉基、喹唑啉基、异喹啉基、肉桂基、酞嗪基、喹喔啉基或蝶啶基。
[0115]
一般而言，除非另有说明，杂芳基或杂亚芳基包括其所有可能的异构形式，例如：关于与分子其余部分的连接点的互变异构体和位置异构体。因此，对于一些说明性的非限制性实例，术语吡啶基包括吡啶-2-基、吡啶-3-基和吡啶-4-基；或术语噻吩基包括噻吩-2-基-和噻吩-3-基。
[0116]
在本文公开的序列中包括在序列的羧基末端(c-末端)处并入
“‑
oh”部分或
“‑
nh
2”部分的序列。序列c-末端的
“‑
oh”或“nh
2”部分表示羟基或氨基，分别对应于在c-末端存在羧基或酰氨基(-(c＝o)-nh2)。在本发明的每个序列中，c-末端
“‑
oh”部分可以被c-末端
“‑
nh
2”部分取代，在本发明中也称为“酰胺化c-末端”，反之亦然。然而，在所述替代方案中，优选c-末端
“‑
oh”部分。
[0117]
术语“乙酰化”(也缩写为“ac”)是指通过肽的n-末端的乙酰化对n-末端部分的乙酰保护(肽的n-末端被乙酰化)。
[0118]
根据另一个实施方案，本发明提供含有可以被分离和/或纯化的肽或衍生物、前药、类似物、药学上可接受的盐、溶剂合物或盐的溶剂合物的化合物，所述肽包含式(i)、基本上由式(i)组成或由式(i)组成，其中
[0119]
x0为选自以下的化学基团：(1s，2s，4s)-双环[2.2.1]庚-5-烯-2-基乙酸、(2，4-二氧咪唑啉-1-基)乙酸、2-(硫代吗啉)乙酸((2-硫代吗啉)乙酰基)、2-(n-异丙基-n-甲基氨基)乙酸、(s)-3-甲基戊酸((s)-3-甲基戊酸)，(s)-3-甲基戊酸))、2-(3-吡啶基)乙酸、2-(环己基氨基)乙酸(2-(环己基氨基)乙酰基)、2-(二乙氨基)乙酸(2-(二乙氨基)乙酰基)、2-(吗啉)乙酸(2-(吗啉)乙酰基)、2-(n-甲基-n-环丙氨基)乙酸(2-(n-甲基-n-环丙氨基)乙酰基)、2-(哌啶)乙酸(2-(哌啶)乙酰基))、2-(吡咯烷)乙酸(2-(吡咯烷)乙酰基)、2-羟基乙酸(2-羟基乙酰基)、2-羟基异丁酸(2-羟基异丁酸)、3-(氨基甲基)苯甲酸、3-甲氧基丙酸、4-(氨基甲基)苯甲酸、4-甲基庚酸(4-甲基戊酸)、5-氯噻吩-羧酸、1-(氨基甲基)-环丙基-1-羧酸(acmp)、己二酸、(s)-氮杂环丁烷、苯甲酸(苯甲酸)、4-(3，5-二甲基-1，2-噁唑-4-基)-l-苯丙氨酸、环丁烷羧酸(环丁烷羧酸)、2-(环丁基)乙酸(环丁基乙酸)、环丁基乙酸(环丁基乙酸)、环己基乙酸(环己基乙酸)、环己烷羧酸(环乙烷羧酸)、环戊烷羧酸、环戊基乙酸(环戊基乙酸)、环丙烷羧酸(环丙烷羧酸)、环丙基羧酸、d-(+)生物素(boitin)、富马酸、3-苯基丙酸(3-苯丙酸)、异丁酸、异戊酸(异戊酸)、l-(+)-乳酸(l-(+)-lacticacid)((乳酸)(lactic))、苯乙酸、哌啶-4-基乙酸、新戊酸(三甲基乙酸)、辛二酸、叔丁基乙酸、四氢吡喃-4-乙酸、四氢-2h-吡喃-3-基乙酸和反式-2-(3-((叔丁氧基)羰基氨基)环己基)乙酸)，
[0120]
p代表整数0或1，
[0121]
x1代表选自a、f、g、h、i、k、l、p、r、s、t、v、w和y的天然氨基酸或选自以下的非天然氨基酸：n-甲基-丙氨酸(n-me)a、n-甲基-甘氨酸((n-me)g)、(1r，3s，4s)-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-3-羧酸、l-3-溴苯丙氨酸((3-溴)f)、ln，n-二甲基丙氨酸((n，n-dime)a)、n，n-二甲基甘氨酸((n，n-dime)g)、n-苯基甘氨酸((n-ph)g)、(r)-哌啶-3-羧酸、(s)-哌啶-3-羧酸、l-叔丁基丙氨酸((tbu)a)、l-2-吡啶丙氨酸(2-pal)、l-3-吡啶丙氨酸(3-pal)、l-4-吡啶丙氨酸(4-pal)、3-(氨基甲基)苯甲酸、3-氨基-2，2-二甲基丙酸、3-氨基-3-甲基丁酸、4-(氨基甲基)苯甲酸、l-2-氨基丁酸(abu)、1-氨基环丁烷-1-羧酸(acba)、6-氨基己酸(ahx)、2-氨基异丁酸(aib)、l-2-噻吩基丙氨酸(β-2-噻吩基丙氨酸)、β-丙氨酸(β-a)、β-脯氨酸(β-p)、l-瓜氨酸(cit)、l-2，4-二氨基丁酸(dab)、l-2，3-二氨基丙酸(dap)、γ-氨基丁酸(γ-abu)、l-3-甲基组氨酸(3-me)h)、l-二氢乳清酸(hoo)、l-正亮氨酸(nle)、n-甲基-l-脯氨酸((n-me)p)、l-正缬氨酸(nva)、l-鸟氨酸(orn)、l-哌啶酸(pip)、(2s)-2[(氨基)-2-(四氢-2h-吡喃-4-基)]乙酸和氨甲环酸(传明酸)，
[0122]
而每个l-立体构型的天然氨基酸和/或非天然氨基酸都可以被d-立体构型的立体异构体替代，
[0123]
q代表0至5的整数，
[0124]
x2代表天然氨基酸i或选自以下的非天然氨基酸：l-n-甲基异亮氨酸((n-me)i)、别-l-异亮氨酸(别-i)、l-环丁基丙氨酸(cba)、l-正缬氨酸(nva)、l-2-氨基丁酸(abu)、(2s，3s)-2-[(3r)-3-氨基-2-氧代吡咯烷-1-基]-3-甲基-庚酸、(2s，3s)-2-[2-氧代哌嗪-1-基]-3-甲基戊酸和(2s，3s)-2-[(3s)-2-氧代哌嗪-1-基]-3-甲基戊酸，
[0125]
而每个l-立体构型的天然氨基酸和/或非天然氨基酸都可以被d-立体构型的立体异构体替代，
[0126]
r代表整数0或1，
[0127]
x3代表天然氨基酸c或非天然氨基酸l-青霉胺(pen)，
[0128]
x4代表选自s、c、t、r和k的天然氨基酸，
[0129]
x5代表天然氨基酸r或非天然氨基酸n(5)-甲基-l-精氨酸((me)r)，
[0130]
x6代表天然氨基酸s，或选自别-l-苏氨酸(别-t)和l-2，3-二氨基丙酸(dap)的非天然氨基酸，
[0131]
x7代表选自l和n的天然氨基酸，或选自以下的非天然氨基酸：2，5-二氟-l-苯丙氨酸((2，5-二氟)f)、l-2-溴苯丙氨酸((2-溴)f)、2-氯-l-苯丙氨酸((2-氯)f)、l-4-溴苯丙氨酸((4-溴)f)、4-氟-l-亮氨酸((4-氟)l)、l-叔丁基丙氨酸((tbu)a)、l-叔丁基甘氨酸((tbu)g)、5，5，5-三氟-l-亮氨酸((三氟)l)、(s)-2-(氨基)-1，6-己二酸(aad)、(2s)-2-氨基-4，4，4-三氟丁酸、l-2-氨基-4-氰基丁酸(cnba)、(s)-(三氟甲基)-l-半胱氨酸、(2s)-2-氨基-3-(1-甲基环丙基)丙酸、(2s)-3-(2，3-二氟苯基)-2-氨基丙酸、2，3，3a，4，5，6，7，7a-八氢吲哚-2-羧酸(oic)、3-(三甲基甲硅烷基)-l-丙氨酸和2-氨基-7-(叔丁氧基)-7-氧代庚酸，
[0132]
x8代表天然氨基酸p，或选自以下的非天然氨基酸：(1s，2s，5r)-3-氮杂双环[3.1.0]己烷-2-羧酸、(1r，2s，5s)-3-氮杂双环[3.1.0]己烷-2-羧酸、反式-4-氟脯氨酸((反式-4-氟)p)、l-羟基脯氨酸(hyp)、(3s)-吗啉-3-羧酸(吗啉-3-羧酸)、l-高脯氨酸(pip)和(4ar，6ar，9s，11as)-11-氧代-2，3，4，4a，6a，7，8，9，11，11a-十氢-1h-吡啶并[3，2-e]吡咯并[1，2-a]氮杂-9-羧酸，
[0133]
x9代表天然氨基酸p，或选自以下的非天然氨基酸：2，3，3a，4，5，6，7，7a-八氢吲哚-2-羧酸(oic)、(6s)-5-氮杂螺[2.4]庚烷-6-羧酸、rel-(1r，3r，5r，6r)-6-(三氟甲基)-2-氮杂双环[3.1.0]己烷-3-羧酸，(2s，4s)-4-三氟甲基-吡咯烷-2-羧酸((4-cf3)p)、(2s，3as，6as)-八氢环戊二烯并[b]吡咯-2-羧酸、(1r，3s，5r)-2-氮杂双环[3.1.0]己烷-3-羧酸、(2s)-2-氨基-4，4，4-三氟丁酸，l-反式-3-羟基脯氨酸((3s-oh)p、反式-4-氟脯氨酸((反式-4-氟)p)、l-羟基脯氨酸(hyp)、(2s，4s)-4-氟脯氨酸((顺式-4-氟)p)、(3r，6r)-1，1-二氟-5-氮杂螺[2.4]庚烷-6-羧酸(对映异构体1)和(3r，6r)-1，1-二氟-5-氮杂螺[2.4]庚烷-6-羧酸(对映异构体2)，
[0134]
x
10
代表天然氨基酸i，或选自以下的非天然氨基酸：(2s)-2-(氨基)-2-[(1s，3r)-3-羟基环己基]乙酸、3-氯苯基甘氨酸((3-氯-ph)g)、(s)-2-氨基-3-乙基-庚酸、别-l-异亮氨酸(别-i)、l-环己基甘氨酸(chg)、l-环戊基甘氨酸(cpg)、l-环丁基甘氨酸和l-正缬氨酸(nva)，
[0135]
x
11
代表天然氨基酸c，或选自l-n-甲基半胱氨酸((n-me)c)和l-青霉胺(pen)的非天然氨基酸，
[0136]
x
12
代表天然氨基酸i，或选自以下的非天然氨基酸：2-[(1s，2s)-1-(氨基)-2-甲基丁基]-1，3-噁唑-4-羧酸、(s)-2-氨基-2-环丁基乙酸(cbg)、别-l-异亮氨酸(别-i)、l-苯基甘氨酸(phg)、2-甲基-d-别异亮氨酸和(2s，3s)-2-((氨基)甲基)-3-甲基戊酸，
[0137]
在u和t以及s都为0的情况下，x
12
的末端羧基为未取代的或酰胺化的，
[0138]
x
13
代表选自p、a和d的天然氨基酸或选自以下的非天然氨基酸：2-甲基-l-脯氨酸(2-me)p、n-甲基-甘氨酸((n-me)g)、反式-4-氟脯氨酸((反式-4-氟)p)、l-2-氨基丁酸(abu)、2-氨基异丁酸(aib)、羟基脯氨酸(hyp)和2，3，3a，4，5，6，7，7a-八氢吲哚-2-羧酸(oic)，
[0139]
而每个l-立体构型的天然氨基酸和/或非天然氨基酸都可以被d-立体构型的立体异构体替代，
[0140]
如果u和t均为0且s不为0，则x
13
的末端羧基未被取代或酰胺化，
[0141]
s代表0至3的整数，
[0142]
x
14
代表选自d、e、g、k、n、p和q的天然氨基酸或选自以下的非天然氨基酸：3-羧基苯丙氨酸((3-羧基)f)、(2s)-2-氨基-4-(苄基氨基)-4-氧代丁烷羧酸((n-苄基)d)、n-甲基-甘氨酸((n-me)g)、6-氨基己酸(ahx)、(2s)-吡咯烷-2-基乙酸(β-高-p)、l-2，3-二氨基丙酸(dap)、l-鸟氨酸(orn)和氨甲环酸(传明酸)，
[0143]
并且在u为0且t不为0的情况下，x
14
的末端羧基未被取代或酰胺化，
[0144]
而每个l-立体构型的天然氨基酸和/或非天然氨基酸都可以被d-立体构型的立体异构体替代，
[0145]
t代表0至4的整数，
[0146]
x
15
为选自以下的化学基团：(1r，3s)-3-(氨基)环戊烷羧酸、(1s，3r)-3-(氨基)环戊烷甲酸、(r)-4-氨基-6-甲基庚酸、(s)-(1-哌啶-3-基)-乙酸、(s)-3-(1-吡咯烷-2-基)-丙酸、(s)-3-(2h-四唑-5-基)丙酸、(s)-吡咯烷-3-羧酸、5-氮杂螺[2.4]庚烷-1-羧酸和(2s)-3-(三唑-1-基)-2-(氨基)丙酸，
[0147]
u代表整数0或1，
[0148]
条件为肽包含至少一种非天然氨基酸。
[0149]
根据另一个实施方案，本发明提供含有可以被分离和/或纯化的肽或衍生物、前药、类似物、药学上可接受的盐、溶剂合物或盐的溶剂合物的化合物，所述肽包含式(i)、基本上由式(i)组成或由式(i)组成，其中
[0150]
x0为选自以下的化学基团：(1r，3s，4s)-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-3-羧酸、(2-硫代吗啉)乙酸、(n-异丙基-n-甲氨基)乙酸、2-(3-吡啶基)乙酸、2-(环己基氨基)乙酸、2-(二乙氨基)乙酸、2-(吗啉)乙酸、2-(哌啶)乙酸、2-(吡咯烷)乙酸、3-(氨基甲基)苯甲酸、4-(氨基甲基)苯甲酸、1-(氨基甲基)-环丙基-1-羧酸(acmp)、氮杂环丁烷、苯甲酸、环丁基乙酸、环丙基乙酸、苯乙酸、哌啶-4-基乙酸、四氢-2h-吡喃-3-基乙酸、氨甲环酸和反式-2-(3-((叔丁氧基)羰基氨基)环己基)乙酸，
[0151]
p代表整数0或1，
[0152]
x1代表选自a、f、g、h、i、k、l、p、r、s、t、v、w和y的天然氨基酸或选自以下的非天然氨基酸：l-n，n-二甲基丙氨酸((n，n-dime)a)、n-甲基-丙氨酸(n-me)a、n-甲基-甘氨酸((n-me)g)、l-2-吡啶基丙氨酸(2-pal)、l-3-吡啶基丙氨酸(3-pal)、l-4-吡啶基丙氨酸(4-pal)、l-2-氨基丁酸(abu)、6-氨基己酸(ahx)、2-氨基异丁酸(aib)、3-(氨基甲基)苯甲酸、3-氨基-2，2-二甲基丙酸、3-氨基-3-甲基丁酸、4-(氨基甲基)苯甲酸、β-2-噻吩丙氨酸、(s)-吡咯烷-2-羧酸(β-p)、l-瓜氨酸(cit)、l-2，4-二氨基丁酸(dab)、l-2，3-二氨基丙酸(dap)、γ-氨基丁酸(γ-abu)、l-3-甲基组氨酸(h(3-me))、l-二氢乳清酸(hoo)、l-正亮氨
酸(nle)、l-正缬氨酸(nva)、l-鸟氨酸(orn)、l-高脯氨酸(pip)、n-甲基-l-脯氨酸((n-me)p)、氨甲环酸(传明酸)、(1r，3s，4s)-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-3-羧酸和(2s)-2[(氨基)-2-(四氢-2h-吡喃-4-基)]乙酸，
[0153]
而每个l-立体构型的天然氨基酸和/或非天然氨基酸都可以被d-立体构型的立体异构体替代，
[0154]
q表示0至5的整数，
[0155]
x2代表天然氨基酸i或选自l-n-甲基异亮氨酸((n-me)i)、l-环丁基丙氨酸(cba)、l-正缬氨酸(nva)和l-2-氨基丁酸的非天然氨基酸(abu)，
[0156]
而每个l-立体构型的天然氨基酸和/或非天然氨基酸都可以被d-立体构型的立体异构体替代，
[0157]
r代表整数0或1，
[0158]
x3代表天然氨基酸c或非天然氨基酸l-青霉胺(pen)，
[0159]
x4代表选自s和t的天然氨基酸，
[0160]
x5代表天然氨基酸r，
[0161]
x6代表天然氨基酸s或非天然氨基酸别-l-苏氨酸(别-t)，
[0162]
x7代表选自n和l的天然氨基酸，或选自以下的非天然氨基酸：2，5-二氟-l-苯丙氨酸((2，5-二氟)f)、l-2-溴苯丙氨酸((2-溴)f)、2-氯-l-苯丙氨酸((2-氯)f)、4-氟-l-亮氨酸((4-氟)l)、l-叔丁基丙氨酸((tbu)a)、(s)-(三氟甲基)-l-半胱氨酸、(2s)-2-氨基-3-(1-甲基环丙基)丙酸和2，3，3a，4，5，6，7，7a-八氢吲哚-2-羧酸(oic)、3-(三甲基甲硅烷基)-l-丙氨酸，
[0163]
x8代表天然氨基酸p，或选自(1s，2s，5r)-3-氮杂双环[3.1.0]己烷-2-羧酸和(4ar，6ar，9s，11as)酸)-11-氧代-2，3，4，4a，6a，7，8，9，11，11a-十氢-1h-吡啶并[3，2-e]吡咯并[1，2-a]氮杂-9-羧酸的非天然氨基酸，
[0164]
x9代表天然氨基酸p，或选自以下的非天然氨基酸：2，3，3a，4，5，6，7，7a-八氢吲哚-2-羧酸(oic)、(2s，4s)-4-三氟甲基-吡咯烷-2-羧酸((4-cf3)p)、(6s)-5-氮杂螺[2.4]庚烷-6-羧酸、rel-(1r，3r，5r，6r)-6-(三氟甲基)-2-氮杂双环[3.1.0]己烷-3-羧酸、(2s，3as，6as)-八氢环戊二烯并[b]吡咯-2-羧酸、rel-(3r，6r)-1，1-二氟-5-氮杂螺[2.4]庚烷-6-羧酸(对映异构体1)和rel-(3r，6r)-1，1-二氟-5-氮杂螺[2.4]庚烷-6-羧酸(对映异构体2)，
[0165]
x
10
代表天然氨基酸i，或选自(2s)-2-(氨基)-2-[(1s，3r)-3-羟基环己基]乙酸、(s)-2-氨基-3-乙基-戊酸、l-环己基甘氨酸(chg)和l-环戊基甘氨酸(cpg)的非天然氨基酸，
[0166]
x
11
代表天然氨基酸c，或选自l-n-甲基半胱氨酸((n-me)c)和l-青霉胺(pen)的非天然氨基酸，
[0167]
x
12
代表天然氨基酸i，或选自别-l-异亮氨酸(别-i)、(s)-2-氨基-2-环丁基乙酸(cbg)和2-[(1s，2s)-1-(氨基)-2-甲基丁基]-1，3-噁唑-4-羧酸的非天然氨基酸，
[0168]
在u和t以及s均为0的情况下，x
12
的末端羧基未被取代或酰胺化，
[0169]
x
13
代表选自p和d的天然氨基酸，或选自2-氨基异丁酸(aib)、2-甲基-l-脯氨酸(2-me)p和反式-4-氟脯氨酸((反式-4-氟)p)的非天然氨基酸，
[0170]
而每个l-立体构型的天然氨基酸和/或非天然氨基酸都可以被d-立体构型的立体异构体替代，
[0171]
如果u和t均为0且s不为0，则x
13
的末端羧基未被取代或酰胺化，
[0172]
s表示0至3的整数，
[0173]
x
14
代表选自d、q、n、e和p的天然氨基酸或选自以下的非天然氨基酸：3-羧基苯丙氨酸((3-羧基)f)、n-甲基-甘氨酸((n-me)g)、(2s)-吡咯烷-2-基乙酸(β-高-p)、l-2，3-二氨基丙酸(dap)、l-鸟氨酸(orn)和氨甲环酸(传明酸)，
[0174]
而每个l-立体构型的天然氨基酸和/或非天然氨基酸可以被d-立体构型的立体异构体替代，
[0175]
并且在u为0且t不为0的情况下，x
14
的末端羧基未被取代或酰胺化，
[0176]
t代表0至4的整数，
[0177]
x
15
为选自以下的化学基团：(1r，3s)-3-(氨基)环戊烷羧酸、(1s，3r)-3-(氨基)环戊烷羧酸、(r)-4-氨基-6-甲基庚烷酸、(s)-(1-高脯氨酸-3-基)-乙酸、(s)-3-(1-吡咯烷-2-基)-丙酸、(s)-3-(2h-四唑-5)-基)丙酸、(s)-吡咯烷-3-羧酸、5-氮杂螺[2.4]庚烷-1-羧酸和(2s)-3-(三唑-1-基)-2-(氨基)丙酸，
[0178]
u代表整数0或1，
[0179]
条件为肽包含至少一种非天然氨基酸。
[0180]
根据另一个实施方案，本发明提供含有可以被分离和/或纯化的肽或衍生物、前药、类似物、药学上可接受的盐、溶剂合物或盐的溶剂合物的化合物，所述肽包含式(i)、基本由式(i)组成或由式(i)组成，其中
[0181]
p代表整数0，
[0182]
x1代表选自a和g的天然氨基酸或选自以下的非天然氨基酸：n-甲基-l-丙氨酸(n-me)a、n-甲基-甘氨酸(n-me))g)、l-正亮氨酸(nle)、l-正缬氨酸(nva)和l-鸟氨酸(orn)，
[0183]
q代表整数0或1，
[0184]
x2代表天然氨基酸i，
[0185]
r代表整数0或1，
[0186]
x3代表天然氨基酸c或非天然氨基酸l-青霉胺(pen)，
[0187]
x4代表天然氨基酸s，
[0188]
x5代表天然氨基酸r或非天然氨基酸n(5)-甲基-l-精氨酸((me)r)，
[0189]
x6代表天然氨基酸s，
[0190]
x7代表天然氨基酸l或非天然氨基酸l-叔丁基丙氨酸((tbu)a)，
[0191]
x8代表天然氨基酸p，
[0192]
x9代表天然氨基酸p或非天然氨基酸2，3，3a，4，5，6，7，7a-八氢吲哚-2-羧酸(oic)，
[0193]
x
10
代表天然氨基酸i，
[0194]
x
11
代表天然氨基酸c，或选自l-n-甲基半胱氨酸((n-me)c)和l-青霉胺(pen)的非天然氨基酸，
[0195]
x
12
代表天然氨基酸i，
[0196]
如果u和t以及s均为0，则x
12
的末端羧基未被取代或酰胺化，
[0197]
x
13
代表天然氨基酸p，
[0198]
如果u和t均为0且s不为0，则x
13
的末端羧基未被取代或酰胺化，
[0199]
s代表整数0或1，
[0200]
x
14
代表选自d、q和e的天然氨基酸，
[0201]
并且在u为0且t不为0的情况下，x
14
的末端羧基未被取代或酰胺化，
[0202]
t代表整数0或1，
[0203]
u代表整数0，
[0204]
条件为肽包含至少一种非天然氨基酸。
[0205]
根据另一个实施方案，本发明提供了一种包含下式(ii)的肽或衍生物、前药、类似物、药学上可接受的盐、溶剂合物或盐的溶剂合物的化合物：
[0206]
(x1)q(x2)rx3x4x5x6x7x8x9x
10
x
11
x
12
(x
13
)s(x
14
)
t
ꢀꢀ
(ii)，
[0207]
其中
[0208]
x1代表选自a和g的天然氨基酸，或选自n-甲基-l-丙氨酸(n-me)a、n-甲基-甘氨酸((n-me)g)、l-正亮氨酸(nle)、l-正缬氨酸(nva)和l-鸟氨酸(orn)的非天然氨基酸，
[0209]
q代表整数0或1，
[0210]
x2代表天然氨基酸i，
[0211]
r代表整数0或1，
[0212]
x3代表天然氨基酸c或非天然氨基酸l-青霉胺(pen)，
[0213]
x4代表天然氨基酸s，
[0214]
x5代表天然氨基酸r或非天然氨基酸n(5)-甲基-l-精氨酸((me)r)，
[0215]
x6代表天然氨基酸s，
[0216]
x7代表天然氨基酸l或非天然氨基酸l-叔丁基丙氨酸((tbu)a)，
[0217]
x8代表天然氨基酸p或非天然氨基酸l-脯氨酸(3，4-2
h)，
[0218]
x9代表天然氨基酸p或非天然氨基酸2，3，3a，4，5，6，7，7a-八氢吲哚-2-羧酸(oic)，
[0219]
x
10
代表天然氨基酸i，
[0220]
x
11
代表选自l-n-甲基半胱氨酸((n-me)c)和l-青霉胺(pen)的非天然氨基酸，
[0221]
x
12
代表天然氨基酸i，
[0222]
x
13
代表天然氨基酸p，
[0223]
s表示整数0或1，
[0224]
x
14
代表选自d、q和e的天然氨基酸，
[0225]
t代表整数0或1，
[0226]
其中肽的n-末端未被取代、乙酰化或被c
1-c
20-烷基单取代或双取代，
[0227]
其中肽的c-末端未被取代或酰胺化，和
[0228]
其中肽通过连接x3和x
11
的键环化。
[0229]
根据另一个实施方案，本发明提供一种包含式(ii)的肽或衍生物、前药、类似物、药学上可接受的盐、溶剂合物或盐的溶剂合物的化合物，其中
[0230]
x1代表天然氨基酸或非天然氨基酸，
[0231]
q代表整数0或1，
[0232]
x2代表天然氨基酸i，
[0233]
r代表整数0或1，
[0234]
x3代表天然氨基酸c或非天然氨基酸l-青霉胺(pen)，
[0235]
x4代表天然氨基酸s，
[0236]
x5代表天然氨基酸r或非天然氨基酸n(5)-甲基-l-精氨酸((me)r)，
[0237]
x6代表天然氨基酸s，
[0238]
x7代表天然氨基酸l或非天然氨基酸l-叔丁基丙氨酸((tbu)a)，
[0239]
x8代表天然氨基酸p或非天然氨基酸l-脯氨酸(3，4-2
h)，
[0240]
x9代表非天然氨基酸2，3，3a，4，5，6，7，7a-八氢吲哚-2-羧酸(oic)，
[0241]
x
10
代表天然氨基酸i，
[0242]
x
11
代表天然氨基酸c，或选自l-n-甲基半胱氨酸((n-me)c)和l-青霉胺(pen)的非天然氨基酸，
[0243]
x
12
代表天然氨基酸i，
[0244]
x
13
代表天然氨基酸p，
[0245]
s代表整数0或1，
[0246]
x
14
代表选自d、q和e的天然氨基酸，
[0247]
t代表整数0或1，
[0248]
其中肽的n-末端未被取代、乙酰化或被c
1-c
20-烷基单取代或双取代，
[0249]
其中肽的c-末端未被取代或酰胺化，和
[0250]
其中肽通过连接x3和x
11
的键环化。
[0251]
根据另一个实施方案，本发明提供一种包含式(ii)的肽或衍生物、前药、类似物、药学上可接受的盐、溶剂合物或盐的溶剂合物的化合物，其中
[0252]
x1代表选自a和g的天然氨基酸，或选自n-甲基-l-丙氨酸(n-me)a、n-甲基-甘氨酸((n-me)g)、l-正亮氨酸(nle)、l-正缬氨酸(nva)和l-鸟氨酸(orn)的非天然氨基酸，
[0253]
q代表整数0或1，
[0254]
x2代表天然氨基酸i，
[0255]
r代表整数0或1，
[0256]
x3代表天然氨基酸c或非天然氨基酸l-青霉胺(pen)，
[0257]
x4代表天然氨基酸s，
[0258]
x5代表天然氨基酸r或非天然氨基酸n(5)-甲基-l-精氨酸((me)r)，
[0259]
x6代表天然氨基酸s，
[0260]
x7代表天然氨基酸l或非天然氨基酸l-叔丁基丙氨酸((tbu)a)，
[0261]
x8代表天然氨基酸p或非天然氨基酸l-脯氨酸(3，4-2
h)，
[0262]
x9代表非天然氨基酸2，3，3a，4，5，6，7，7a-八氢吲哚-2-羧酸(oic)，
[0263]
x
10
代表天然氨基酸i，
[0264]
x
11
代表天然氨基酸c，或选自l-n-甲基半胱氨酸((n-me)c)和l-青霉胺(pen)的非天然氨基酸，
[0265]
x
12
代表天然氨基酸i，
[0266]
x
13
代表天然氨基酸p，
[0267]
s表示整数0或1，
[0268]
x
14
代表选自d、q和e的天然氨基酸，
[0269]
t代表整数0或1，
[0270]
其中肽的n-末端未被取代或乙酰化，
[0271]
其中肽的c-末端未被取代或酰胺化，和
[0272]
其中肽通过连接x3和x
11
的键环化。
[0273]
特别地，本发明提供含有式(i)的肽的化合物或含有式(ii)的肽的化合物。
[0274]
根据本发明，x1至x
14
的以下定义适用于式(i)的肽和式(ii)的肽，位置x0和x
15
的定义适用于式(i)的肽。
[0275]
根据本发明，x0(如果存在)可以为不是根据本文定义的非氨基酸的化学基团。
[0276]
根据本发明的另一个实施方案，x0代表选自以下的化学基团：2-氰基苯甲酸、(1s，2s，4s)-双环[2.2.1]庚-5-烯-2-基乙酸、(2，4-二氧代咪唑啉-1-基)乙酸、2-(硫代吗啉)乙酸((2-硫代吗啉)乙酰基)、2-(n-异丙基-n-甲氨基)乙酸、(s)-3-甲基戊酸((s)-3-甲基戊酸)、2-(3-吡啶基)乙酸、2-(环己基氨基)乙酸(2-(环己基氨基)乙酰基)、2-(二乙氨基)乙酸(2-(二乙氨基)乙酰基)、2-(吗啉)乙酸(2-(吗啉)乙酰基)、2-(n-甲基-n-环丙氨基)乙酸(2-(n-甲基-n-环丙氨基)乙酰基)、2-(哌啶)乙酸(2-(哌啶)乙酰基)、2-(吡咯烷)乙酸(2-(吡咯烷)乙酰基)、2-羟基乙酸(2-羟基乙酰基)、2-羟基异丁酸(2-羟基异丁酸)、3-(氨基甲基)苯甲酸、3-甲氧基丙酸、4-(氨基甲基)苯甲酸、4-甲基戊酸(4-甲基戊酸)、5-氯噻吩羧酸、1-(氨基甲基)-环丙基-1-羧酸(acmp)、己二酸、(s)-氮杂环丁烷、苯甲酸(苯甲酸)、4-(3，5-二甲基-1，2-噁唑-4-基)-l-苯丙氨酸、环丁烷羧酸(环丁烷羧酸)、2-(环丁基)乙酸(环丁基乙酸)、环丁基乙酸(环丁基乙酸)、环己基乙酸(环己基乙酸)、环己烷羧酸(环己烷羧酸)、环戊烷羧酸、环戊基乙酸(环戊基乙酸)、环丙烷羧酸(环丙烷羧酸)、环丙基羧酸、d-(+)生物素、富马酸、3-苯基丙酸(苯丙酸)、异丁酸、异戊酸(异戊酸)、l-(+)-乳酸(乳酸)、苯乙酸、哌啶-4-基乙酸、新戊酸(三甲基乙酸)、辛二酸、叔丁基乙酸、四氢吡喃基-4-乙酸、四氢-2h-吡喃-3-基乙酸和反式-2-(3-((叔丁氧基)羰基氨基)环己基)乙酸)。
[0277]
根据本发明的另一个实施方案，x0代表选自以下的化学基团：2-氰基苯甲酸、(1r，3s，4s)-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-3-羧酸、(2-硫代吗啉)乙酸、(n-异丙基-n-甲基氨基)乙酸、2-(3-吡啶基)乙酸、2-(环己基氨基)乙酸、2-(二乙氨基)乙酸、2-(吗啉)乙酸、2-(哌啶)乙酸、2-(吡咯烷)乙酸、3-(氨基甲基)苯甲酸、4-(氨基甲基)苯甲酸、1-(氨基甲基)-环丙基-1-羧酸(acmp)、氮杂环丁烷、苯甲酸、环丁基乙酸、环丙基乙酸、苯乙酸、哌啶-4-基乙酸、四氢-2h-吡喃-3-基乙酸、氨甲环酸和反式-2-(3-((叔丁氧基)羰基氨基)环己基)乙酸。
[0278]
根据本发明的另一个实施方案，x0为选自如上定义的非天然氨基酸、2-氰基苯甲酸、取代的苯甲酸或苯乙酸的化学基团。
[0279]
根据本发明的另一个实施方案，x0是hoo、odd或ahx。
[0280]
根据本发明的另一个实施方案，p代表整数1。
[0281]
根据本发明的另一个实施方案，p代表整数0。
[0282]
根据另一个实施方案，本发明提供含有可以被分离和/或纯化的肽或衍生物、前药、类似物、药学上可接受的盐、溶剂合物或盐的溶剂合物的化合物，所述肽包含式(i)或式(ii)、基本上由式(i)或式(ii)组成或由式(i)或式(ii)组成，其中x1代表任何天然氨基酸
或非天然氨基酸，优选选自衰1中所列的非天然氨基酸，而每个l-立体构型的天然氨基酸和/或非天然氨基酸可以被d-立体构型的立体异构体替代。
[0283]
根据本发明的另一个实施方案，x1代表选自a、f、g、h、i、k、l、p、r、s、t、v、w和y的天然氨基酸，或选自以下的非天然氨基酸：n-甲基-丙氨酸(n-me)a、n-甲基-甘氨酸((n-me)g)、(1r，3s，4s)-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-3-羧酸、l-3-溴苯丙氨酸((3-溴)f)、l-n，n-二甲基丙氨酸((n，n-dime)a)、n，n-二甲基甘氨酸((n，n-dime)g)、n-苯基甘氨酸((n-ph)g)、(r)-哌啶-3-羧酸、(s)-哌啶-3-羧酸、l-叔丁基丙氨酸((tbu)a)、l-2-吡啶基丙氨酸(2-pal)、l-3-吡啶基丙氨酸(3-pal)、l-4-吡啶基丙氨酸(4-pal)、3-(氨基甲基)苯甲酸、3-氨基-2，2-二甲基丙酸、3-氨基-3-甲基丁酸、4-(氨基甲基)苯甲酸、l-2-氨基丁酸(abu)、1-氨基环丁烷-1-羧酸(acba)、6-氨基己酸(ahx)、2-氨基异丁酸(aib)、l-2-噻吩丙氨酸(β-2-噻吩丙氨酸)、β-丙氨酸(β-a)、β-脯氨酸(β-p)、l-瓜氨酸(cit))、l-2，4-二氨基丁酸(dab)、l-2，3-二氨基丙酸(dap)、γ-氨基丁酸(γ-abu)、l-3-甲基组氨酸(3-me)h)、l-二氢乳清酸(hoo)、l-正亮氨酸(nle)、n-甲基-l-脯氨酸((n-me)p)、l-正缬氨酸(nva)、l-鸟氨酸(orn)、l-高脯氨酸(pip)、(2s)-2[(氨基)-2-(四氢-2h-吡喃-4-基)]乙酸和氨甲环酸(传明酸)，而每种l-立体构型的天然氨基酸和/或非天然氨基酸可以被d-立体构型的立体异构体替代。
[0284]
根据本发明的另一个实施方案，x
l
代表选自a和g的天然氨基酸，或选自n-甲基-l-丙氨酸(n-me)a、n-甲基-甘氨酸((n-me)g)、l-正亮氨酸(nle)、l-正缬氨酸(nva)和l-鸟氨酸(orn)的非天然氨基酸，而每种l-立体构型的天然氨基酸和/或非天然氨基酸可以被d-立体构型的立体异构体替代。
[0285]
根据本发明的另一个实施方案，x
l
代表选自a和g的天然氨基酸，或选自n-甲基-l-丙氨酸(n-me)a、n-甲基-甘氨酸((n-me)g)、l-正亮氨酸(nle)、l-正缬氨酸(nva)和l-鸟氨酸(orn)的非天然氨基酸。
[0286]
根据本发明的另一个实施方案，x1代表天然氨基酸a或非天然氨基酸n-甲基-甘氨酸((n-me)g)。
[0287]
根据本发明的另一个实施方案，在p为0且q不为0的情况下，x1的末端氨基未被取代、乙酰化或被c
1-c
4-烷基单取代或双取代，优选被c
1-c
20-烷基单取代。
[0288]
根据本发明的另一个实施方案，x1被甲基化。
[0289]
根据本发明的另一个实施方案，x1被乙酰化。
[0290]
根据本发明的另一个实施方案，q代表整数0。
[0291]
根据本发明的另一个实施方案，q代表整数1。
[0292]
根据另一个实施方案，本发明提供含有可以被分离和/或纯化的肽或衍生物、前药、类似物、药学上可接受的盐、溶剂合物或盐的溶剂合物的化合物，所述肽包含式(i)或式(ii)、基本上由式(i)或式(ii)组成或由式(i)或式(ii)组成，其中x2代表选自i、l、m、v和a的天然氨基酸，或选自以下的非天然氨基酸：l-n-甲基异亮氨酸((n-me)i)、别-l-异亮氨酸(别-i)、l-环丁基丙氨酸(cba)、l-正缬氨酸(nva)、l-2-氨基丁酸(abu)、(2s，3s)-2-[(3r)-3-氨基-2-氧代吡咯烷-1-基]-3-甲基戊酸、(2s，3s)-2-[2-氧代哌嗪-1-基]-3-甲基戊酸、(2s，3s)-2-[(3s)-2-氧代哌嗪-1-基]-3-甲基戊酸、l-甲硫氨酸-l-亚砜、l-甲硫氨酸-砜和l-叔丁基甘氨酸，而每种l-立体构型的天然氨基酸和/或非天然氨基酸可以被d-立体构型的立体异构体替代。
[0293]
根据本发明的另一个实施方案，x2代表天然氨基酸i或选自以下的非天然氨基酸：l-n-甲基异亮氨酸((n-me)i)、别-l-异亮氨酸(别-i)、l-环丁基丙氨酸(cba)、l-正缬氨酸(nva)、l-2-氨基丁酸(abu)、(2s，3s)-2-[(3r)-3-氨基-2-氧代吡咯烷-1-基]-3-甲基戊酸、(2s，3s)-2-[2-氧代哌嗪-1-基]-3-甲基戊酸和(2s，3s)-2-[(3s)-2-氧代哌嗪-1-基]-3-甲基戊酸，而每个l-立体构型的天然氨基酸和/或非天然氨基酸都可以被d-立体构型的立体异构体替代。
[0294]
根据本发明的另一个实施方案，x2代表天然氨基酸i或选自l-n-甲基异亮氨酸((n-me)i)、l-环丁基丙氨酸(cba)、l-正缬氨酸(nva)和l-2-氨基丁酸(abu)的非天然氨基酸，而每个l-立体构型的天然氨基酸和/或非天然氨基酸都可以被d-立体构型的立体异构体替代。
[0295]
根据本发明的另一个实施方案，x2代表天然氨基酸i。
[0296]
根据本发明的另一个实施方案，在p和q均为0且r为1的情况下，x2的末端氨基未被取代、乙酰化或被c
1-c
20-烷基单取代或双取代，优选被c
1-c
4-烷基单取代。
[0297]
根据本发明的另一实施方案，r代表整数0。
[0298]
根据本发明的另一实施方案，r代表整数1。
[0299]
根据另一个实施方案，本发明提供含有可以被分离和/或纯化的肽或衍生物、前药、类似物、药学上可接受的盐、溶剂合物或盐的溶剂合物的化合物，所述肽包含式(i)或式(ii)、基本上由式(i)或式(ii)组成或由式(i)或式(ii)组成，其中x3代表天然氨基酸c，或选自l-青霉胺(pen)和l-n-甲基半胱氨酸((n-me)c)的非天然氨基酸。
[0300]
根据本发明的另一个实施方案，x3代表天然氨基酸c或非天然氨基酸l-青霉胺(pen)。
[0301]
根据本发明的另一个实施方案，x3代表天然氨基酸c。
[0302]
根据本发明的另一个实施方案，在p和q以及r均为0的情况下，x3的末端氨基未被取代、乙酰化或被c
1-c
4-烷基单取代或双取代，优选被c
1-c
20-烷基单取代。
[0303]
根据另一个实施方案，本发明提供含有可以被分离和/或纯化的肽或衍生物、前药、类似物、药学上可接受的盐、溶剂合物或盐的溶剂合物的化合物，所述肽包含式(i)或式(ii)、基本上由式(i)或式(ii)组成或由式(i)或式(ii)组成，其中x4代表选自s、c、t、r或k的天然氨基酸，或选自别-l-苏氨酸、l-高丝氨酸(hser)和l-鸟氨酸(orn)的非天然氨基酸(别-t)。
[0304]
根据本发明的另一个实施方案，x4代表选自s、c、t、r和k的天然氨基酸。
[0305]
根据本发明的另一个实施方案，x4代表选自s或t的天然氨基酸。
[0306]
根据本发明的另一个实施方案，x4代表天然氨基酸s。
[0307]
根据另一个实施方案，本发明提供含有可以被分离和/或纯化的肽或衍生物、前药、类似物、药学上可接受的盐、溶剂合物或盐的溶剂合物的化合物，所述肽包含式(i)或式(ii)、基本上由式(i)或式(ii)组成或由式(i)或式(ii)组成，其中x5代表天然氨基酸r或非天然氨基酸n(5)-甲基-l-精氨酸((me)r)。
[0308]
根据本发明的另一个实施方案，x5代表天然氨基酸r或非天然氨基酸n(5)-甲基-l-精氨酸((me)r)。
[0309]
根据本发明的另一个实施方案，x5代表天然氨基酸r。
[0310]
根据另一个实施方案，本发明提供含有可以被分离和/或纯化的肽或衍生物、前药、类似物、药学上可接受的盐、溶剂合物或盐的溶剂合物的化合物，所述肽包含式(i)或式(ii)、基本上由式(i)或式(ii)组成或由式(i)或式(ii)组成，其中x6代表选自s、c或t的天然氨基酸，或选自别-l-苏氨酸(别-t)和l-2，3-二氨基丙酸(dap)的非天然氨基酸。
[0311]
根据本发明的另一个实施方案，x6代表天然氨基酸s或选自别-l-苏氨酸(别-t)和l-2，3-二氨基丙酸(dap)的非天然氨基酸。
[0312]
根据本发明的另一个实施方案，x6代表天然氨基酸s或非天然氨基酸别-l-苏氨酸(别-t)。
[0313]
根据本发明的另一个实施方案，x6代表天然氨基酸s。
[0314]
根据另一个实施方案，本发明提供含有可以被分离和/或纯化的肽或衍生物、前药、类似物、药学上可接受的盐、溶剂合物或盐的溶剂合物的化合物，所述肽包含式(i)或式(ii)、基本上由式(i)或式(ii)组成或由式(i)或式(ii)组成，其中x7代表选自l、f或n的天然氨基酸或选自以下的非天然氨基酸2，3，3a，4，5，6，7，7a-八氢吲哚-2-羧酸(oic)、l-4-溴苯丙氨酸((4-溴)f)、2，5-二氟-l-苯丙氨酸((2，5-二氟)f)、l-叔丁基丙氨酸((tbu)a)、2-氯-l-苯丙氨酸((2-氯)f)、l-2-溴苯丙氨酸((2-溴)f)、(s)-2-(氨基)-1，6-己二酸(aad)、(2s)-2-氨基-4，4，4-三氟丁酸、l-2-氨基-4-氰基丁酸(cnba)、4-氟-亮氨酸((4-氟)l)、(s)-(三氟甲基)-l-半胱氨酸、(2s)-2-氨基-3-(1-甲基环丙基)丙酸、l-叔丁基甘氨酸((tbu)g)、3-(三甲基甲硅烷基)-l-丙氨酸、2，5-二氟-l-苯丙氨酸、2-氨基-7-(叔丁氧基)-7-氧代庚酸、5，5，5-三氟-l-亮氨酸((三氟)l)、2-甲基-l-苯丙氨酸((2-me)f)、l-环丁基丙氨酸(cba)、l-环戊基丙氨酸(cpa)、l-环丙基甲基丙氨酸、l-三氟甲基丙氨酸、l-二氟甲基丙氨酸、2-氟-l-苯丙氨酸((2-氟)f)、(2s)-3-(2，3-二氟苯基)-2-氨基丙酸、(2s)-3-(3-氰基苯基)-2-氨基丙酸、2-氨基-5，5，5-三氟-4-甲基-戊酸、(2s)-2-氨基-5-甲基-己酸和(2s)-3-(吲哚-4-基)-2-(氨基)丙酸。
[0315]
根据本发明的另一个实施方案，x7代表选自l和n的天然氨基酸，或选自以下的非天然氨基酸：2，5-二氟-l-苯丙氨酸((2，5-二氟)f)、l-2-溴苯丙氨酸((2-溴)f)、2-氯-l-苯丙氨酸((2-氯)f)、l-4-溴苯丙氨酸((4-溴)f)、4-氟-l-亮氨酸((4-氟)l)、l-叔丁基丙氨酸((tbu)a)、l-叔丁基甘氨酸((tbu)g)、5，5，5-三氟-l-亮氨酸((三氟)l)、(s)-2-(氨基)-1，6-己二酸(aad)、(2s)-2-氨基-4，4，4-三氟丁酸、l-2-氨基-4-氰基丁酸(cnba)、(s)-(三氟甲基)-l-半胱氨酸、(2s)-2-氨基-3-(1-甲基环丙基)丙酸、(2s)-3-(2，3-二氟苯基)-2-氨基丙酸、2，3，3a，4，5，6，7，7a-八氢吲哚-2-羧酸(oic)、3-(三甲基甲硅烷基)-l-丙氨酸和2-氨基-7-(叔丁氧基)-7-氧代庚酸。
[0316]
根据本发明的另一个实施方案，x7代表选自n或l的天然氨基酸，或选自以下的非天然氨基酸：2，5-二氟-l-苯丙氨酸((2，5-二氟)f)、l-2-溴苯丙氨酸((2-溴)f)、2-氯-l-苯丙氨酸((2-氯)f)、4-氟-l-亮氨酸((4-氟)l)、l-叔丁基丙氨酸((tbu)a)、(s)-(三氟甲基)-l-半胱氨酸、(2s)-2-氨基-3-(1-甲基环丙基)丙酸和2，3，3a，4，5，6，7，7a-八氢吲哚-2-羧酸(oic)、3-(三甲基甲硅烷基)-l-丙氨酸。
[0317]
根据本发明的另一个实施方案，x7代表天然氨基酸l或非天然氨基酸l-叔丁基丙氨酸((tbu)a)。
[0318]
根据本发明的另一个实施方案，x7代表非天然氨基酸l-叔丁基丙氨酸((tbu)a)。
[0319]
根据本发明的另一个实施方案，x7代表天然氨基酸l。
[0320]
根据另一个实施方案，本发明提供含有可以被分离和/或纯化的肽或衍生物、前药、类似物、药学上可接受的盐、溶剂合物或盐的溶剂合物的化合物，所述肽包含式(i)或式(ii)、基本上由式(i)或式(ii)组成或由式(i)或式(ii)组成，其中x8代表天然氨基酸p，或选自以下的非天然氨基酸：l-脯氨酸(3，4-2
h)、(1s，2s，5r)-3-氮杂双环[3.1.0]己烷-2-羧酸、(1r，2s，5s)-3-氮杂双环[3.1.0]己烷-2-羧酸、l-羟基脯氨酸(hyp)、(3s)-吗啉-3-羧酸(吗啉-3-羧酸)、l-高脯氨酸(pip)、(4ar，6ar，9s，11as)-11-氧代-2，3，4，4a，6a，7，8，9，11，11a-十氢-1h-吡啶并[3，2-e]吡咯并[1，2-a]氮杂-9-羧酸、反式-4-氟脯氨酸((反式-4-氟)p)和(1r)，2s，5s)-3-氮杂双环[3.1.0]己烷-2-羧酸。
[0321]
根据本发明的另一个实施方案，x8代表天然氨基酸p，或选自以下的非天然氨基酸：l-脯氨酸(3，4-2
h)、(1s，2s，5r)-3-氮杂双环[3.1.0]己烷-2-羧酸、反式-4-氟脯氨酸((顺式-4-氟)p)、l-羟基脯氨酸(hyp)、(3s)-吗啉-3-羧酸(吗啉-3-羧酸)、l-高脯氨酸(pip)和(4ar，6ar，9s，11as)-11-氧代-2，3，4，4a，6a，7，8，9，11，11a-十氢-1h-吡啶并[3，2-e]吡咯并[1，2-a]氮杂-9-羧酸。
[0322]
根据本发明的另一个实施方案，x8代表天然氨基酸p，或选自l-脯氨酸(3，4-2
h)、(1s，2s，5r)-3-氮杂双环[3.1.0]己烷-2-羧酸和(4ar，6ar，9s，11as)-11-氧代-2，3，4，4a，6a，7，8，9，11，11a-十氢-1h-吡啶并[3，2-e]吡咯并[1，2-a]氮杂-9-羧酸的非天然氨基酸。
[0323]
根据本发明的另一个实施方案，x8代表天然氨基酸p或非天然氨基酸l-脯氨酸(3，4-2
h)。
[0324]
根据本发明的另一个实施方案，x8代表天然氨基酸p。
[0325]
根据另一个实施方案，本发明提供含有可以被分离和/或纯化的肽或衍生物、前药、类似物、药学上可接受的盐、溶剂合物或盐的溶剂合物的化合物，所述肽包含式(i)或式(ii)、基本上由式(i)或式(ii)组成或由式(i)或式(ii)组成，其中x9代表天然氨基酸p，或选自以下的非天然氨基酸：2，3，3a，4，5，6，7，7a-八氢吲哚-2-羧酸(oic)、l-羟基脯氨酸(hyp)、(2s，4s)-4-三氟甲基-吡咯烷-2-羧酸((4-cf3)p)、(2s，4s)-4-氟脯氨酸((顺式-4-氟)p)、反式-4-氟脯氨酸((反式-4-氟)p)、(2s)-2-氨基-4，4，4-三氟丁酸、l-反式-3-羟脯氨酸((3s-oh)p、(1r，3s，5r)-2-氮杂双环[3.1.0]己烷-3-羧酸、(6s)-5-氮杂螺[2.4]庚烷-6-羧酸，rel-(1r，3r，5r，6r)-6-(三氟甲基)-2-氮杂双环[3.1.0]己烷-3-羧酸、(2s)-2-氨基-4，4，4-三氟丁酸、(2s，3as，6as)-八氢环戊二烯并[b]吡咯-2-羧酸、反式-4-氟脯氨酸((反式-4-氟)p)、(2s，4s)-4-氟脯氨酸((顺式-4-氟)p)、l-4，4-二氟脯氨酸((二氟)p)、rel-(3r，6r)-1，1-二氟-5-氮杂螺[2.4]庚烷-6-羧酸(对映异构体1)和rel-(3r，6r)-1，1-二氟-5-氮杂螺[2.4]庚烷-6-羧酸(对映异构体2)。
[0326]
根据本发明的另一个实施方案，x9代表天然氨基酸p，或选自以下的非天然氨基酸：2，3，3a，4，5，6，7，7a-八氢吲哚-2-羧酸(oic)、(6s)-5-氮杂螺[2.4]庚烷-6-羧酸、rel-(1r，3r，5r，6r)-6-(三氟甲基)-2-氮杂双环[3.1.0]己烷-3-羧酸、(2s，4s)-4-三氟甲基-吡咯烷-2-羧酸((4-cf3)p)、(2s，3as，6as)-八氢环戊二烯并[b]吡咯-2-羧酸、(1r，3s，5r)-2-氮杂双环[3.1.0]己烷-3-羧酸、(2s)-2-氨基-4，4，4-三氟丁酸、l-反式-3-羟脯氨酸((3s-oh)p、反式-4-氟脯氨酸((反式-4-氟)p)、l-羟基脯氨酸(hyp)、(2s，4s)-4-氟脯氨酸((顺式-4-氟)p)、(3r，6r)-1，1-二氟-5-氮杂螺[2.4]庚烷-6-羧酸(对映异构体1)和(3r，6r)-1，
1-二氟-5-氮杂螺[2.4]庚烷-6-羧酸(对映异构体2)。
[0327]
根据本发明的另一个实施方案，x9代表天然氨基酸p，或选自以下的非天然氨基酸：2，3，3a，4，5，6，7，7a-八氢吲哚-2-羧酸(oic)、(2s，4s)-4-三氟甲基-吡咯烷-2-羧酸((4-cf3)p)、(6s)-5-氮杂螺[2.4]庚烷-6-羧酸、rel-(1r)，3r，5r，6r)-6-(三氟甲基)-2-氮杂双环[3.1.0]己烷-3-羧酸、(2s，3as，6as)-八氢环戊二烯并[b]吡咯-2-羧酸、rel-(3r，6r)-1，1-二氟-5-氮杂螺[2.4]庚烷-6-羧酸(对映异构体1)和rel-(3r，6r)-1，1-二氟-5-氮杂螺[2.4]庚烷-6-羧酸(对映异构体2)。
[0328]
根据本发明的另一个实施方案，x9代表天然氨基酸p或非天然氨基酸2，3，3a，4，5，6，7，7a-八氢吲哚-2-羧酸(oic)o
[0329]
根据本发明的另一个实施方案，x9代表非天然氨基酸2，3，3a，4，5，6，7，7a-八氢吲哚-2-羧酸(oic)o
[0330]
根据另一个实施方案，本发明提供含有可以被分离和/或纯化的肽或衍生物、前药、类似物、药学上可接受的盐、溶剂合物或盐的溶剂合物的化合物，所述肽包含式(i)或式(ii)、基本上由式(i)或式(ii)组成或由式(i)或式(ii)组成，其中x
10
代表天然氨基酸i，或选自以下的非天然氨基酸：l-环戊基甘氨酸(cpg)、l-环己基甘氨酸(chg)、(s)-2-氨基-3-乙基-戊酸、3-氯苯基甘氨酸((3-氯-ph)g)、l-叔丁基甘氨酸、别-l-异亮氨酸(别-i)、l-环丁基甘氨酸、l-正缬氨酸(nva))和(2s)-2-(氨基)-2-[(1s，3r)-3-羟基环己基]乙酸。
[0331]
根据本发明的另一个实施方案，x
10
代表天然氨基酸i，或选自以下的非天然氨基酸：(2s)-2-(氨基)-2-[(1s，3r)-3-羟基环己基]乙酸、3-氯苯基甘氨酸((3-氯-ph)g)、(s)-2-氨基-3-乙基-庚酸、别-l-异亮氨酸(别-i)、l-环己基甘氨酸(chg)、l-环戊基甘氨酸(cpg)、l-环丁基甘氨酸和l-正缬氨酸(nva)。
[0332]
根据本发明的另一个实施方案，x
10
代表天然氨基酸i，或选自(2s)-2-(氨基)-2-[(1s，3r)-3-羟基环己基]乙酸、(s)-2-氨基-3-乙基-戊酸、l-环己基甘氨酸(chg)和l-环戊基甘氨酸(cpg)的非天然氨基酸。
[0333]
根据本发明的另一个实施方案，x
10
代表天然氨基酸i。
[0334]
根据另一个实施方案，本发明提供含有可以被分离和/或纯化的肽或衍生物、前药、类似物、药学上可接受的盐、溶剂合物或盐的溶剂合物的化合物，所述肽包含式(i)或式(ii)、基本上由式(i)或式(ii)组成或由式(i)或式(ii)组成，其中x
11
代表天然氨基酸c，或选自l-n-甲基半胱氨酸((n-me)c)和l-青霉胺(pen)的非天然氨基酸。
[0335]
根据本发明的另一个实施方案，x
11
代表天然氨基酸c，或选自l-n-甲基半胱氨酸((n-me)c)和l-青霉胺(pen)的非天然氨基酸。
[0336]
根据本发明的另一个实施方案，x
11
代表选自l-n-甲基半胱氨酸((n-me)c)和l-青霉胺(pen)的非天然氨基酸。
[0337]
根据本发明的另一个实施方案，x
11
代表非天然氨基酸l-青霉胺(pen)。
[0338]
根据另一个实施方案，本发明提供含有可以被分离和/或纯化的肽或衍生物、前药、类似物、药学上可接受的盐、溶剂合物或盐的溶剂合物的化合物，所述肽包含式(i)或式(ii)、基本上由式(i)或式(ii)组成或由式(i)或式(ii)组成，其中x9代表非天然氨基酸2，3，3a，4，5，6，7，7a-八氢吲哚-2-羧酸(oic)，并且x
11
代表非天然氨基酸ln-甲基半胱氨酸((n-me)c)或非天然氨基酸l-青霉胺(pen)。
[0339]
根据本发明的另一个实施方案，x9代表非天然氨基酸2，3，3a，4，5，6，7，7a-八氢吲哚-2-羧酸(oic)且x
11
代表非天然氨基酸l-青霉胺(pen)。
[0340]
根据本发明的另一个实施方案，x9代表非天然氨基酸2，3，3a，4，5，6，7，7a-八氢吲哚-2-羧酸(oic)并且x
11
代表选自l-n-甲基半胱氨酸((n-me)c)和l-青霉胺(pen)的非天然氨基酸。
[0341]
根据另一个实施方案，本发明提供含有可以被分离和/或纯化的肽或衍生物、前药、类似物、药学上可接受的盐、溶剂合物或盐的溶剂合物的化合物，所述肽包含式(i)或式(ii)、基本上由式(i)或式(ii)组成或由式(i)或式(ii)组成，其中x
12
代表天然氨基酸i，或选自以下的非天然氨基酸：别-l-异亮氨酸(别-i)、(s)-2-氨基-2-环丁基乙酸(cbg)、(2s，3s)-2-((氨基)甲基)-3-甲基庚酸、l-苯基甘氨酸(phg)、2-[(1s，2s)-1-(氨基)-2-甲基丁基]-1，3-噁唑-4-羧酸、2-甲基-d-异亮氨酸、l-正缬氨酸(nva)、l-2-氨基丁酸(abu)、l-叔丁基甘氨酸和氨基异丁酸(aib)。
[0342]
根据本发明的另一个实施方案，x
12
代表天然氨基酸i，或选自以下的非天然氨基酸：2-[(1s，2s)-1-(氨基)-2-甲基丁基]-1，3-噁唑-4-羧酸、(s)-2-氨基-2-环丁基乙酸(cbg)、别-l-异亮氨酸(别-i)、l-苯基甘氨酸(phg)、2-甲基-d-异亮氨酸和(2s，3s)-2-((氨基)甲基)-3-甲基戊酸。
[0343]
根据本发明的另一个实施方案，x
12
代表天然氨基酸i，或选自别-l-异亮氨酸(别-i)、(s)-2-氨基-2-环丁基乙酸(cbg)和2-[(1s，2s)-1-(氨基)-2-甲基丁基]-1，3-噁唑-4-羧酸的非天然氨基酸。
[0344]
根据本发明的另一个实施方案，x
12
代表天然氨基酸i。
[0345]
根据本发明的另一个实施方案，在u和t以及s均为0的情况下，x
12
的末端羧基未被取代或酰胺化。
[0346]
根据另一个实施方案，本发明提供本发明提供含有可以被分离和/或纯化的肽或衍生物、前药、类似物、药学上可接受的盐、溶剂合物或盐的溶剂合物的化合物，所述肽包含式(i)或式(ii)、基本上由式(i)或式(ii)组成或由式(i)或式(ii)组成，其中x
13
代表选自p、a、s、t、g、d、e、q或n的天然氨基酸或选自以下的非天然氨基酸：n-甲基-甘氨酸((n-me)g)、5-氮杂螺[2.4]庚烷-6-羧酸、l-2-氨基丁酸(abu)、2-氨基异丁酸(aib)、2-甲基-l-脯氨酸(2-me)p、羟脯氨酸(hyp)、2，3，3a，4，5，6，7，7a-八氢吲哚-2-羧酸(oic)、反式-4-氟脯氨酸((反式-4-氟)p)、(2s，4s)-4-氟脯氨酸((顺式-4-氟)p)、l-4，4-二氟脯氨酸((二氟)p)、l-环戊基甘氨酸(cpg)、(s)-2-氨基-2-环丁基乙酸(cbg)和(2s)-吡咯烷-2-基乙酸(β-高-p)，而每个l-立体构型的天然氨基酸和/或非天然氨基酸可以被d-立体构型的立体异构体替代。
[0347]
根据本发明的另一个实施方案，x
13
代表选自p、a和d的天然氨基酸或选自2-甲基-l-脯氨酸(2-me)p、n-甲基-甘氨酸((n-me)g)、反式-4-氟脯氨酸((反式-4-氟)p)、l-2-氨基丁酸(abu)、2-氨基异丁酸(aib)、羟基脯氨酸(hyp)和2，3，3a，4，5，6，7，7a-八氢吲哚-2-羧酸(oic)的非天然氨基酸，而l-立体构型的每个天然氨基酸和/或非天然氨基酸可以被d-立体构型的立体异构体替换。
[0348]
根据本发明的另一个实施方案，x
13
代表选自p或d的天然氨基酸或选自2-氨基异丁酸(aib)、2-甲基-l-脯氨酸(2-me)p和反式-4-氟脯氨酸((反式-4-氟)p)的非天然氨基酸，
而l-立体构型的每个天然氨基酸和/或非天然氨基酸可以被d-立体构型的立体异构体替换。
[0349]
根据本发明的另一个实施方案，x
13
代表天然氨基酸p。
[0350]
根据本发明的另一个实施方案，s代表整数0。
[0351]
根据本发明的另一个实施方案，s代表整数1。
[0352]
根据本发明的另一个实施方案，在u和t均为0且s不为0的情况下，x
13
的末端羧基是未取代的或酰胺化的。
[0353]
根据本发明的另一个实施方案，在t为0且s为1的情况下，x
13
的末端羧基未被取代或酰胺化。
[0354]
根据另一个实施方案，本发明提供含有可以被分离和/或纯化的肽或衍生物、前药、类似物、药学上可接受的盐、溶剂合物或盐的溶剂合物的化合物，所述肽包含式(i)或式(ii)、基本上由式(i)或式(ii)组成或由式(i)或式(ii)组成，其中x
14
代表任何天然氨基酸或非天然氨基酸，而任何天然氨基酸和/或非天然氨基酸可为d-或l-立体构型。
[0355]
根据本发明的另一个实施方案，x
14
代表选自d、e、g、k、n、p和q的天然氨基酸或选自以下的非天然氨基酸：3-羧基苯丙氨酸((3-羧基)f)、(2s)-2-氨基-4-(苄基氨基)-4-氧代丁烷羧酸((n-苄基)d)、n-甲基-甘氨酸((n-me)g)、6-氨基己酸(ahx)、(2s)-吡咯烷-2-基乙酸(β-高-p)、l-2，3-二氨基丙酸(dap)、l-鸟氨酸(orn)和氨甲环酸(传明酸)，而l-立体构型的每个天然氨基酸和/或非天然氨基酸可以被d-立体构型的立体异构体替换。
[0356]
根据本发明的另一个实施方案，x
14
代表选自d、q、n、e和p的天然氨基酸或选自以下的非天然氨基酸：3-羧基苯丙氨酸((3-羧基)f)、n-甲基-甘氨酸((n-me)g)、(2s)-吡咯烷-2-基乙酸(β-高-p)、l-2，3-二氨基丙酸(dap)、l-鸟氨酸(orn)和氨甲环酸(传明酸)，而每个l-立体构型天然氨基酸和/或非天然氨基酸都可以被d-立体构型的立体异构体替代。
[0357]
根据本发明的另一个实施方案，x
14
代表选自d、q或i的天然氨基酸。
[0358]
根据本发明的另一个实施方案，x
14
代表天然氨基酸d。
[0359]
根据本发明的另一个实施方案，x
14
处的c-末端
“‑
oh”部分被c-末端
“‑
nh
2”部分取代。
[0360]
根据本发明的另一个实施方案，q表示整数0。
[0361]
根据本发明的另一个实施方案，q表示整数1。
[0362]
根据本发明的另一个实施方案，在s和t表示整数1的情况下，x
14
的末端羧基未被取代或酰胺化。
[0363]
根据本发明的另一个实施方案，在s和t表示整数1的情况下，x
14
的末端羧基未被取代。
[0364]
根据本发明，x
15
(如果存在)可以为不是氨基酸的化学基团。
[0365]
根据本发明的另一个实施方案，x
15
是选自以下的化学基团：-nh2、-nh-c
1-c
6-烷基、(1r，3s)-3-(氨基)环戊烷羧酸、(1s，3r)-3-(氨基)环戊烷羧酸、(r)-4-氨基-6-甲基庚酸、(s)-(1-哌啶-3-基)-乙酸、(s)-3-(1)-吡咯烷-2-基)-丙酸、(s)-3-(2h-四唑-5-基)丙酸、(s)-吡咯烷-3-羧酸、5-氮杂螺[2.4]庚烷-1-羧酸和(2s)-3-(三唑-1-基)-2-(氨基)丙酸。
[0366]
根据本发明的另一个实施方案，x
15
为选自-nh2或-nh-c
1-c
6-烷基(优选-nh2)的化学基团。
[0367]
根据本发明的另一个实施方案，q表示整数0。
[0368]
根据本发明的另一个实施方案，q表示整数1。
[0369]
根据本发明的另一个实施方案，肽的n-末端未被取代、乙酰化或被c
1-c
20-烷基单取代或双取代。
[0370]
根据本发明的另一个实施方案，肽的n-末端未被取代、乙酰化或被c
1-c
4-烷基单取代或双取代。
[0371]
根据本发明的另一个实施方案，肽的n-末端未被取代或乙酰化。
[0372]
根据本发明的另一个实施方案，c-末端未被取代或酰胺化。
[0373]
根据本发明的另一个实施方案，n-末端和c-末端未被取代。
[0374]
根据另一个实施方案，本发明提供了含有可以被分离和/或纯化的肽或衍生物、前药、类似物、药学上可接受的盐、溶剂合物或盐的溶剂合物的化合物，所述肽包含式(i)或式(ii)、基本上由式(i)或式(ii)组成或由式(i)或式(ii)组成，它们选自实施例29、44、45、67、75、109、166、185、443和466或选自实施例29、44、45、67、75、109、166、185、443、466和499。
[0375]
式(i)或(ii)的肽可以是线性的或环化的。如本文所用，术语“环化”是指其中多肽分子(例如cys、(n-me)cys或pen)的一部分与多肽分子的另一部分(例如另一个cys，(n-me)cys或pen)连接以形成闭环的反应，例如通过形成二硫键(-s-s-)或其他类似的键，例如碳-硫键(例如(-ch
2-s-)或(-(-)ch2)
2-s-))、硫-碳键(例如(-s-ch
2-)或(-s-(ch2)
2-))、碳-硫-碳键(-ch
2-s-ch
2-)或碳-碳键(例如(-ch
2-ch
2-))。根据本发明，肽的x3和x
11
位置之间的连接为优选的。在本发明的肽的序列中，氨基酸后跟“+”是指环肽，其中氨基酸通过二硫键连接到另一个后跟“+”的氨基酸，形成闭环。或者，多肽分子的两个连接的化学基团可以用连接线表示。
[0376]
根据另一个实施方案，本发明提供了含有可以被分离和/或纯化的肽或衍生物、前药、类似物、药学上可接受的盐、溶剂合物或盐的溶剂合物的化合物，所述肽包含式(i)或式(ii)、基本上由式(i)或式(ii)组成或由式(i)或式(ii)组成，其中肽为环化的。
[0377]
根据本发明的另一个实施方案，式(i)或式(ii)的肽通过连接x3和x
11
的键环化。
[0378]
根据本发明的另一个实施方案，式(i)或式(ii)的肽通过连接x3和x
11
的键环化并且其中x3和x
11
通过式-s-s-、-ch
2-s-、-s-ch
2-、-ch
2-ch
2-、-s-(ch2)
2-、-(ch2)
2-s-或-ch
2-s-ch
2-的接头连接。
[0379]
根据本发明的另一个实施方案，式(i)或式(ii)的肽通过连接x3和x
11
的键环化并且其中x3和x
11
通过式-s-s-的二硫键连接。
[0380]
本发明的肽可以使用以重复单元为特征的合适的水溶性聚合物取代。合适的聚合物可选自聚烷氧基聚合物、透明质酸及其衍生物、聚乙烯醇、聚噁唑啉、聚酸酐、聚(原酸酯)、聚碳酸酯、聚氨酯、聚丙烯酸、聚丙烯酰胺、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚有机磷腈、聚硅氧烷、聚乙烯吡咯烷酮、聚氰基丙烯酸酯和聚酯。
[0381]
本发明的肽可以被至少一个聚乙烯基团(peg基团)取代。至少一个peg基团优选与n-末端和/或c-末端结合。peg基团可以结合至肽的化学基团和/或氨基酸的任何合适的官能团，例如羟基、羧基、氨基、硫醇基，优选氨基或羧基。优选地，本发明的肽含有与n-末端结合的一个peg基团或与c-末端结合的一个peg基团。更优选地，所述一个peg基团通过酰胺键
与n-末端或c-末端结合。
[0382]
肽的peg化可以通过降低肾清除率来提高它们的溶解度、降低免疫原性、提高稳定性和/或增加半衰期，这是20世纪80年代早期以来众所周知的概念(caliceti p.，veronese fm，adv.drug deliv.rev.2003，55，1261-1277)。这已成功用于几种药物，但在许多实例中，peg化降低了原料药的功效，以至于该概念不再适用(t.peleg-shulman等人，j.med.chem.，2004，47，4897-4904)。
[0383]
本发明的peg基团为包含至少两个环氧乙烷单元以形成环氧乙烷低聚物或聚合物的任何基团。peg基团与本发明的肽共价偶联(peg化)，其然后被称为peg化肽。通常，分子的这种类型的修饰为本领域众所周知的。
[0384]
peg基团可由互连部分、聚合物部分和端基组成。互连部分可由c
1-c
20
烷基组成，其任选地被杂原子或官能团间断或终止，所述杂原子或官能团选自-o-、-s-、n(r
x
)、c(o)、c(o)r
x
、c(o)n(r
x
)、n(r
x
)c(o)、一个或多个c
3-c
8-环烷基、c
3-c
7-杂环烷基、芳基或杂芳基，其中r
x
为氢或c
1-c
6-烷基，其任选地被一个或多个上述原子或基团间断或终止，其进一步具有氢作为末端原子。聚合物部分由至少两个环氧乙烷单元组成，任选地被一个或多个杂原子或官能团间断或终止，所述杂原子或官能团选自-o-、-s-、n(r
x
)、c(o)、c(o)r
x
、c(o)n(r
x
)、n(r
x
)c(o)、c
1-c
6-烷基、c
3-c
8-环烷基、c
3-c
7-杂环烷基、芳基或杂芳基，其中r
x
为氢或c
1-c
6-烷基。端基可由杂原子或官能团组成，其选自oh、sh、n(r
x
)2、c(o)r
x
、cor
x
、coor
x
、c(o)n(r
x
)、n(r
x
)c(o)nh2，其中r
x
是氢或c
1-c
6-烷基。优选的端基为cooh和c(o)nh2。
[0385]
本发明的peg间隔物的实例包括具有1个乙二醇单元(n＝1；10个原子)的peg1(10个原子)、具有2个乙二醇单元(n＝2；13个原子)的peg2(13个原子)、具有3个乙二醇单元(n＝3；16个原子)的peg3(16个原子)、具有4个乙二醇单元(n＝4；19个原子)的peg4(19个原子)、具有5个乙二醇单元(n＝5)；22个原子)的peg5(22个原子)、具有6个乙二醇单元(n＝6；25个原子)的peg6(25个原子)等。
[0386]
注意到，本文中所定义的peg基团可能会被商业供应商以不同的名称标示，但这不应排除与本发明具有不同名称的此类相同的化合物。
[0387]
根据另一个实施方案，本发明提供了含有可以被分离和/或纯化的肽或衍生物、前药、类似物、药学上可接受的盐、溶剂合物或盐的溶剂合物的化合物，所述肽包含式(i)或式(ii)、基本上由式(i)或式(ii)组成或由式(i)或式(ii)组成，其中肽被至少一个peg基团取代。
[0388]
根据本发明的另一实施方案，肽被一个peg基团取代。
[0389]
根据本发明的另一实施方案，肽被一个peg基团取代，其中peg基团与c-末端结合，优选通过酰胺键结合。
[0390]
根据本发明的另一实施方案，肽被至少一个peg基团取代，而至少一个或多个peg基团为式(iiia)的基团
[0391][0392]
其中
[0393]
＊标记与氮或氧原子的连接，
[0394]
d为c
1-c
4-亚烷基，
[0395]
y选自羟基、甲氧基、乙氧基、羧基、甲酰胺或氨基，并且
[0396]
n表示2至15的整数，
[0397]
或式(iiib)的基团，
[0398][0399]
其中
[0400]
＊标记与羰基的结合，
[0401]
d1为c
1-c
4-亚烷基，
[0402]
y1为选自羟基、甲氧基、乙氧基、羧基、甲酰胺或氨基，并且
[0403]
m代表2至15的整数，或ttds。
[0404]
根据本发明的另一个实施方案，肽被至少一个peg基团取代，而至少一个或多个peg基团选自peg1(10个原子)、peg2(13个原子)、peg3(16个原子)、peg4(19个原子)、peg4-ch2co2h(15个原子)、peg5(22个原子)、peg5-ch2co2h(18个原子)、peg7(25个原子)、peg8(28个原子)、peg9(31个原子)和ttds。
[0405]
本发明的肽可包含至少一种c
8-c
20
脂肪酸。通常，这种脂肪酸可为支链的或环状的。至少一种c
8-c
20
脂肪酸优选结合至n-末端和/或c-末端。c
8-c
20
脂肪酸可以结合至肽的化学基团和/或氨基酸的任何合适的官能团，例如羟基、羧基、氨基、硫醇基，优选氨基或羧基。优选地，本发明的肽含有与n-末端结合的c
8-c
20
脂肪酸或与c-末端结合的c
8-c
20
脂肪酸。更优选地，一个c
8-c
20
脂肪酸通过酰胺键与n-末端或c-末端结合。优选地，由x0或x
15
形成的脂肪酸侧链为＞c8的脂肪酸，更优选≥c
12
的脂肪酸，更优选≥c
14
的脂肪酸。进一步优选地，由x0或x
15
形成的脂肪酸侧链为c
12-c
18
脂肪酸，优选c
12-c
16
脂肪酸，或c
14-c
18
脂肪酸，或c
14-c
16
脂肪酸。最优选的是c
16
脂肪酸如棕榈酸(棕榈酰基，palm)和c
18
脂肪酸如1，18-十八烷二酸(odd)。
[0406]
还应理解，n-末端或c-末端的部分可以是键(例如共价键)，特别是在氨基末端或羧基末端与接头或另一化学部分结合的情况下。
[0407]
化学基团、非天然氨基酸或部分在本文中可缩写为如表3所示。
[0408]
表3：用于化学基团、非天然氨基酸或序列中其他部分的缩写/表述和术语
[0409]
[0410]
[0411]
[0412]
[0413]
[0414]
[0415]
[0416]
[0417][0418]
在根据本发明的式(i)或式(ii)的肽的几个部分的定义中与一些氨基酸一起使用的术语“模拟物(mimetic)”表示相应的氨基酸模拟物，例如精氨酸模拟物、异亮氨酸模拟物或脯氨酸模拟物。通常，“蛋白质模拟物”表示一种分子，例如肽、修饰的肽或在生物学上模拟某些其他蛋白质的功能或活性的任何其他分子。在使用与某种氨基酸相关的术语“模拟物”的上下文中，所述术语“模拟物”类似地表示在生物学上模拟该相应氨基酸的功能或活性的任何其他氨基酸、氨基酸类似物、氨基酸衍生物、氨基酸缀合物等。
[0419]
本发明的脯氨酸模拟物特别包含(1s，2s，5r)-3-氮杂双环-[3.1.0]己烷-2-羧酸、hyp、吗啉-3-羧酸、pip、(4ar，6ar，9s，11as)-11-氧代-2，3，4，4a，6a，7，8，9，11，11a-十氢-1h-吡啶并[3，2-e]吡咯并[1，2-a]氮杂-9-羧酸或(反式-4-氟)p、(1r，2s，5s)-3-氮杂双环
[3.1.0]己烷-2-羧酸、oic、hyp、(4-cf3)p、(顺式-4-氟)p、3，3-二甲基-1，3-氮杂硅酮-5-羧酸、(3s-oh)p、(1r，3s，5r)-2-氮杂双环[3.1.0]己烷-3-羧酸、(6s)-5-氮杂螺[2.4]庚烷-6-羧酸、rel-(1r，3r，5r，6r)-6-(三氟甲基)-2-氮杂双环[3.1.0]己烷-3-羧酸、(2s，3as，6as)-八氢环戊二烯并[b]吡咯-2-羧酸或二氟脯氨酸、(3r，6r)-1，1-二氟-5-氮杂螺[2.4]庚烷-6-羧酸(对映异构体1)、(3r，6r)-1，1-二氟-5-氮杂螺[2.4]庚烷-6-羧酸(对映异构体2)和取代的脯氨酸。
[0420]
本发明的异亮氨酸模拟物特别包含(n-甲基)-i、别-ile、cba、nva、abu、leu、cpg、环己基-gly、(s)-2-氨基-3-乙基-戊酸、3-氯-phg、别-ile、chg、环丁基甘氨酸、别-ile、cbg、(2s，3s)-2-((氨基)甲基)-3-甲基庚酸、phg、2-[(1s，2s))-1-(氨基)-2-甲基丁基]-1，3-噁唑-4-羧酸、2-甲基-d-别异亮氨酸、nva、abu或ala。
[0421]
本发明的亮氨酸模拟物特别包含(tbu)a、(2-氯)f、(2-溴)f、aad、(2s)-2-氨基-4，4，4-三氟丁酸、cnba、(4-氟)l、(s)-(三氟甲基)-l-半胱氨酸、(2s)-2-氨基-3-(1-甲基环丙基)丙酸、gly(tbu)、3-(三甲基甲硅烷基)-l-丙氨酸、2，5-二氟-l-苯丙氨酸、2-氨基-7-(叔丁氧基)-7-氧代庚酸、5，5，5-三氟-l-亮氨酸((三氟)l)、(2-me)f、cba、cpa、环丙基甲基丙氨酸、三氟甲基丙氨酸或二氟甲基丙氨酸、(2-氟)f、(2s)-3-(2，3-二氟苯基)-2-氨基丙酸、(2s)-3-(3-氰基苯基))-2-氨基丙酸、2-氨基-5，5，5-三氟-4-甲基-戊酸、(2s)-2-氨基-5-甲基-己酸或(2s)-3-(吲哚-4-基)-2-(氨基)丙酸。
[0422]
本发明还包括所述肽的类似物和衍生物。根据本发明的肽或氨基酸序列的术语“类似物”或“衍生物”特别包括与所述序列具有至少80％或至少85％，优选至少90％，更优选至少95％序列同一性，甚至更优选至少99％同一性的任何氨基酸序列，以及相同或相当的特性或活性。序列一致性可以通过常规技术，例如视觉比较或通过本领域通常使用的任何计算机工具类确定。实例包括使用默认参数的blast程序。
[0423]
本发明的肽或氨基酸序列的类似物或衍生物可由源自本发明的肽序列的突变或变异的变化产生，包括一个或多个氨基酸的缺失或插入或一个或多个氨基酸的置换，或甚至于选择性剪接。可以组合这些修饰中的几种。优选地，本发明的氨基酸序列的类似物包含相对于氨基酸序列的保守置换。
[0424]
如本文所用，术语“保守性置换”表示一个或多个氨基酸被另一个生物学相似的残基置换。实例包括置换具有相似特征的氨基酸残基，例如小氨基酸、酸性氨基酸、极性氨基酸、碱性氨基酸、疏水性氨基酸和芳族氨基酸。参见例如下表4中的方案，其中氨基酸的保守置换按理化性质分组。i：中性、亲水性；ii：酸和酰胺；iii：碱性；iv：疏水性；v：芳族、大体积氨基酸；vi：中性或疏水性；vii：酸性；viii：极性。
[0425]
表4：根据其理化性质分组的氨基酸
[0426]
iiiiiiivvviviiviiialaasnhismetphealaglumetseraspargleutyrleuaspserthrglulvsiletrpile thrprogln val pro cysgly
ꢀꢀ
cys gly asn
ꢀꢀꢀꢀꢀ
val gln
[0427]
肽类似物或衍生物还可以包含一个或多个其他修饰，例如与另一种化合物缀合以形成氨基酸缀合物。
[0428]
替代地或另外地，这类修饰可以由缀合至本发明的肽中的一个或多个氨基酸残基的侧链而产生，例如上文所定义的具有化学基团x0或聚合部分如peg基团的化学基团。这种修饰可以例如增加肽的体内(例如在血浆中)溶解度和/或半衰期和/或生物利用度，并且还已知降低治疗性蛋白质和肽的清除率(例如肾清除率)。合适的修饰是技术人员公知的，并且具体包括但不限于本发明的肽的一个或多个侧链的peg化。其中，“peg化”代表将聚乙二醇(peg)结构偶联(例如，共价)至本发明的肽的行为。技术人员非常了解用于与小肽的氨基酸侧链偶联以形成相应缀合物的可能的peg，例如，通过wo 2015/200916 a1，将其通过引用并入本文。
[0429]
除非另有说明，本发明的所有肽都是tfa盐。本发明还包括本文所定义的肽的药学上可接受的盐和无盐形式。其中，药学上可接受的盐代表本发明的肽或化合物的盐或两性离子形式，其为水溶性或油溶性或可分散的，其适用于治疗疾病而无过度毒性、刺激性和过敏反应；其与合理的收益/风险比相称，并且对其预期用途有效。盐可以在化合物的最终分离和纯化过程中制备，也可以通过使氨基与合适的酸反应单独制备。代表性的酸加成盐包括乙酸盐、己二酸盐、藻酸盐、柠檬酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、硫酸氢盐、丁酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、碳酸盐、二葡萄糖酸盐、甘油磷酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、甲酸盐、富马酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、2-羟基乙磺酸盐(羟乙基磺酸盐)、乳酸盐、马来酸盐、均三甲苯磺酸盐、甲磺酸盐、萘磺酸盐、烟酸盐、2-萘磺酸盐、草酸盐、双羟萘酸盐(pamoate)、果胶酸盐、过硫酸盐、3-苯丙酸盐、苦味酸盐(picrate)、新戊酸盐、丙酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐、酒石酸盐、三氯乙酸盐、三氯乙酸盐、三氟乙酸盐、磷酸盐、谷氨酸盐、碳酸氢盐、对甲苯磺酸盐和十一酸盐。优选的酸加成盐包括三氟乙酸盐、甲酸盐、盐酸盐和乙酸盐。
[0430]
此外，本发明化合物中的氨基可以被以下物质季铵化：甲基、乙基、丙基和丁基氯化物、溴化物和碘化物；二甲基、二乙基、二丁基和二戊基硫酸盐；癸基、月桂基、肉豆蔻基和甾基(steryl)氯化物、溴化物和碘化物；和苄基和苯乙基溴化物。可用于形成治疗上可接受的加成盐的酸的实例包括无机酸如盐酸、氢溴酸、硫酸和磷酸，以及有机酸如草酸、马来酸、琥珀酸和柠檬酸。药学上可接受的盐可以适当地为选自例如酸加成盐和碱性盐的盐。酸加成盐的实例包括氯化物盐、柠檬酸盐和乙酸盐。
[0431]
碱性盐的实例包括其中阳离子选自碱金属阳离子如钠离子或钾离子、碱土金属阳离子如钙离子或镁离子以及取代的铵离子如n(r1)(r2)(r3)(r4)
+
型离子的盐，其中r1、r2、r3和r4彼此独立地通常表示氢、任选取代的c
1-6-烷基或任选取代的c
2-6-烯基。相关的c
1-6-烷基的实例包括甲基、乙基、1-丙基和2-丙基。可能相关的c
2-6-烯基的实例包括乙烯基、1-丙烯基和2-丙烯基。其中，优选阳离子选自钠、钾和钙的盐。
[0432]
药学上可接受的盐的其他实例记载于“remington
′
s pharmaceutical sciences”，第17版，alfonso r.gennaro(编辑)，mark publishing company，easton，pa，美国，1985(及其更新的版本)中，记载于“encyclopaedia of pharmaceutical technology”，第3版，james swarbrick(编辑)，informa healthcare美国(inc.)，ny，美国，2007中。此外，关于合适的盐的综述，参见handbook of pharmaceutical salts：properties，selection，和use by stahl and wermuth(wiley-vch，2002)。其他合适的碱性盐由形成无毒盐的碱形
成。代表性的实例包括铝、精氨酸、苄星青霉素(benzathine)、钙、胆碱、二乙胺、二醇胺、甘氨酸、赖氨酸、镁、葡甲胺、醇胺、钾、钠、氨丁三醇和锌盐，优选胆碱。还可形成酸和碱的半盐，例如半硫酸盐和半钙盐。
[0433]
本发明还包括本文所定义的肽的溶剂合物。其中，术语“溶剂合物”是指在溶质(例如，本发明的肽或其药学上可接受的盐)和溶剂之间形成的具有确定化学计量的复合物。在该结合物中的溶剂可以是例如水、乙醇或另一种药学上可接受的、通常是小分子有机物质，例如但不限于乙酸或乳酸。当所讨论的溶剂为水时，这类溶剂合物通常被称为水合物。
[0434]
本发明的化合物具有有用的药理学特性并且可用于预防和治疗人和动物的病症。
[0435]
在本发明的上下文中，术语“治疗(treatment)”或“治疗(treat)”包括抑制、延迟、遏制、改善、减弱、限制、减少、阻止、逆转或治愈疾病、病况、病症、损伤或健康损害，此类状态和/或此类状态的症状的发展、过程或进展。此处，术语“治疗(therapy)”被理解为与术语“治疗(treatment)”同义。
[0436]
在本发明的上下文中，术语“预防(prevention)”、“预防(prophylaxis)”或“预防(precaution)”同义地使用，且是指避免或减少获得、感染、遭受或患有疾病、病况、病症、损伤或健康损害、此类状态或此类状态的症状的发展或进展的风险。
[0437]
治疗或预防疾病、病况、病症、损伤或健康损害可以部分地或完全地进行。
[0438]
本发明的化合物特别适用于治疗和/或预防心血管、心肺、肾、肺、纤维化、血栓栓塞和炎性病症。
[0439]
因此，本发明的化合物可用于用于以下用途的药物中：治疗和/或预防心血管和心肺病症及其后遗症，例如炎性心脏病、心肌炎、心内膜炎、心包炎、不累及和累及心脏风湿热、急性风湿性心包炎、急性风湿性心内膜炎、急性风湿性心肌炎、伴有或不伴有心内膜炎的慢性风湿性心脏病、瓣膜炎、心包炎、缺血性心脏病如不稳定型心绞痛和急性心肌梗塞、房性和室性心律失常以及传导障碍如i-iii级房室传导阻滞、室上性心动过速、心房颤动、心房扑动、心室颤动、心室扑动、室性快速型心律失常、尖端扭转型室性心动过速(torsade de pointes tachycardia)、心房和心室期外收缩、av-交界性期外收缩(av-junctional extrasystoles)、病态窦房结综合征(sick sinus syndrome)、由脑动脉的闭塞和狭窄引起的中风(例如血栓栓塞性、动脉粥样硬化性、感染性和炎症性血管病变后的脑梗塞)；治疗和/或预防因脑内或颅内出血引起的中风，因动脉、小动脉和毛细血管疾病(例如血栓栓塞性、动脉粥样硬化性、感染性和炎症性血管病变，变形性或闭塞性动脉内膜炎和动脉瘤夹层)引起的外周缺血性组织损伤(例如动脉粥样硬化性坏疽)，静脉炎和血栓性静脉炎；预防循环系统的术后病症，例如全身炎症反应综合征、手术后血管麻痹、心脏切开术后综合征、手术后低血压和心力衰竭；预防和治疗缺血再灌注损伤和器官功能障碍，例如溶栓治疗，经皮腔内血管成形术(pta)，经皮腔内冠状动脉成形术(ptca)，搭桥术手术和心、肺、肝、肾移植后；以及预防和治疗肾移植后移植物功能延迟。
[0440]
通过防止masp介导的终末器官损伤，本发明的化合物还适用于治疗休克，例如心源性休克、感染性休克和过敏性休克。
[0441]
此外，本发明的化合物具有抗炎作用，因此可以用作抗炎剂用于治疗和/或预防败血症(sirs)、多器官衰竭(mods、mof)、肾脏炎性病症、慢性肠道炎症(ibd、克罗恩病、uc)、胰腺炎、腹膜炎、类风湿病、炎性皮肤病和炎性眼病。
[0442]
借助于它们的活性特征，本发明的化合物特别适用于治疗和/或预防败血症和全身炎症反应综合征的心血管、肺、脑和肾后遗症。
[0443]
本发明的化合物特别适用于治疗和/或预防在复苏和手术干预(surgical interventions)例如但不限于搭桥手术、心脏瓣膜手术和主动脉瘤手术的情况下对心脏和肾脏以及其他器官的缺血和/或再灌注相关的损伤。
[0444]
本发明的化合物还可另外用于预防器官或组织的缺血和/或再灌注相关的损伤，并且还可以用作人类或动物来源的器官、器官部分、组织或组织部分的灌注和保存溶液的添加剂，特别是用于外科干预或移植医学领域。
[0445]
此外，本发明的化合物适用于治疗和/或预防血液和造血器官以及免疫系统的疾病，包括但不限于获得性溶血性贫血、溶血尿毒症综合征(haemolytic-uraemic syndrome)、阵发性睡眠性血红蛋白尿症[marchiafava-micheli]、凝血缺陷、紫癜和其他出血性疾病、弥散性血管内凝血[去纤维化综合征]、原发性(出血性)血小板增多症、暴发性紫癜、血栓性血小板减少性紫癜、过敏性紫癜、过敏性血管炎、淋巴细胞减少和粒细胞增多以及结节病。
[0446]
此外，本发明的化合物适用于治疗和/或预防糖尿病的后遗症，例如糖尿病的肾脏并发症、糖尿病肾病、毛细血管内肾小球性肾病(intracapillary glomerulonephrosis)、糖尿病的眼科并发症、糖尿病性视网膜病、神经系统并发症、糖尿病性多发性神经病和循环系统并发症如微血管病和坏疽。
[0447]
此外，本发明的化合物适用于治疗和/或预防神经系统的炎症性疾病，例如多发性硬化症、脑膜炎和脑炎、细菌性和病毒性脑膜炎和脑炎、免疫后脑炎、炎性多发性神经病以及感染性疾病和寄生虫病中的多发性神经病。
[0448]
本发明的化合物还适用于治疗和/或预防眼部及其附件的疾病，例如急性和亚急性虹膜睫状体炎、脉络膜变性、脉络膜视网膜炎症、传染性和寄生虫病中的脉络膜视网膜炎症、背景性视网膜病变和视网膜血管病变(background retinopathy and retinal vascular changes)、增殖性视网膜病变、黄斑和后极部变性、周边视网膜变性、年龄相关性黄斑变性(amd)(包括干性(非渗出性)和湿性(渗出性、新生血管)amd)、脉络膜新生血管(cnv)、脉络膜新生血管膜(cnvm)、黄斑囊样水肿(cme)、视网膜前膜(erm)和黄斑穿孔、近视相关脉络膜新生血管、血管样和血管条纹、视网膜脱离、糖尿病性视网膜病变、糖尿病性黄斑水肿(dme)、视网膜色素上皮萎缩性和肥厚性病变、视网膜静脉阻塞、脉络膜视网膜静脉阻塞、黄斑水肿、与视网膜静脉阻塞相关的黄斑水肿、眼部和附件的手术后病症如白内障手术后的角膜病变。
[0449]
此外，本发明的化合物适用于治疗和/或预防呼吸系统疾病，包括但不限于病毒性、细菌性和真菌性肺炎，放射性肺炎，尘肺，外源性变应性肺泡炎(allergic alveolitis)，由特定有机粉尘引起的气道疾病(例如农民肺(farmer lung))，支气管炎，由化学品、气体、烟雾和蒸气引起的肺炎和肺水肿，药物引起的间质性肺病，成人呼吸窘迫综合征(ards)和急性肺损伤(ali)，急性肺水肿，间质性肺病纤维化，类风湿性肺病，其他弥漫性结缔组织疾病中的呼吸系统疾病，例如与系统性红斑狼疮、硬皮病和韦格纳肉芽肿相关的疾病。
[0450]
此外，本发明的化合物适用于治疗和/或预防由病毒感染引起的微血管损伤、血栓
形成和连续血栓栓塞事件，例如但不限于流感病毒(例如由血清型h1n1、h5n1、h7n9引起的)和冠状病毒(例如sars-cov——严重急性呼吸综合征(sars)的病原体、mers-cov——中东呼吸综合征(mers)的病原体以及sars-cov-2——covid-19大流行的病原体)。
[0451]
此外，本发明的化合物适用于治疗和/或预防消化系统疾病，包括但不限于非感染性肠炎和结肠炎，例如克罗恩病和溃疡性结肠炎、胰腺炎(包括酒精和药物引起的急性胰腺炎)、胆囊炎、炎症性肝病、肝肾综合征、肝脏术后病症如肝脏手术后。
[0452]
由于它们的活性特征，本发明的化合物特别适用于治疗和/或预防泌尿生殖系统疾病，包括但不限于急性肾衰竭、急性肾损伤(aki)、手术相关aki、败血症相关aki、造影剂和化疗引起的aki、肾脏缺血和梗塞、并发症(如血液透析和血液透析滤过情况下的过敏症)、膀胱炎、放射性膀胱炎、前列腺炎症性疾病和子宫内膜异位症。
[0453]
本发明的化合物还适用于治疗和/或预防烧伤和损伤后遗症，包括但不限于外伤的早期并发症，外伤性无尿，挤压综合征，挤压后肾功能衰竭，肌肉外伤性缺血，脑外伤，暴露于电流、辐射和极端环境空气温度与压力后的器官损伤，暴露于烟雾、火和火焰后的器官损伤，与有毒动植物接触后的器官损伤。
[0454]
由于它们的活性特征，本发明的化合物还适用于治疗炎性皮肤病例如红斑狼疮，大疱性疾病和棘层松解皮肤病例如天疱疮亚型，丘疹鳞屑性病症例如银屑病、皮炎和湿疹、荨麻疹和红斑。
[0455]
根据另一个实施方案，本发明提供了一种含有可以被分离和/或纯化的肽或其衍生物、前药、类似物或药学上可接受的盐或溶剂合物的化合物用于预防和/或治疗疾病，所述肽包含式(i)或式(ii)、基本上由式(i)或式(ii)组成或由式(i)或式(ii)组成，。
[0456]
根据另一个实施方案，本发明提供了一种含有可以被分离和/或纯化的肽或其衍生物、前药、类似物或药学上可接受的盐或溶剂合物的化合物用于预防和/或治疗masp相关的疾病，所述肽包含式(i)或式(ii)、基本上由式(i)或式(ii)组成或由式(i)或式(ii)组成。
[0457]
根据另一个实施方案，本发明提供了一种含有可以被分离和/或纯化的肽的或其衍生物、前药、类似物或药学上可接受的盐或溶剂合物的化合物用于预防和/或治疗masp相关的疾病，所述肽包含式(i)或式(ii)、基本上由式(i)或式(ii)组成或由式(i)或式(ii)组成，所述化合物用作masp-1和/或masp-2抑制剂和/或抑制c3沉积。
[0458]
根据另一个实施方案，本发明提供了一种含有可以被分离和/或纯化的肽或其衍生物、前药、类似物或药学上可接受的盐或溶剂合物的化合物，所述肽包含式(i)或式(ii)、基本上由式(i)或式(ii)组成或由式(i)或式(ii)组成，所述化合物用于预防和/或治疗心血管疾病和心肺疾病，休克，炎症性疾病，败血症的心血管、肺、脑和肾后遗症，缺血和/或再灌注相关的损伤，急性肾损伤，移植保护和延迟移植功能，血液和造血器官和免疫系统的疾病，糖尿病后遗症，神经系统炎症疾病，眼部疾病，皮肤疾病，呼吸系统疾病，消化系统疾病或泌尿生殖系统以及烧伤和损伤后遗症。
[0459]
根据另一个实施方案，本发明提供了一种含有可以被分离和/或纯化的肽或其衍生物、前药、类似物或药学上可接受的盐或溶剂合物的化合物，所述肽包含式(i)或式(ii)、基本上由式(i)或式(ii)组成或由式(i)或式(ii)组成，所述化合物用于预防和/或治疗泌尿生殖系统疾病，包括但不限于急性肾衰竭、急性肾损伤(aki)、手术相关的aki、败血症相
关的aki、造影剂和化疗引起的aki、肾脏缺血和梗塞、并发症(如血液透析和血液透析滤过情况下的过敏症)、膀胱炎、放射性膀胱炎、前列腺炎症性疾病和子宫内膜异位症。
[0460]
本发明进一步涉及一种治疗或改善受试者或患者的如上所定义的与masp相关的病症的方法，该方法通过将至少一种如本文所定义的肽、衍生物或类似物或如上所定义的其药学上可接受的盐或溶剂合物、复合物或药物组合物给予有需要的所述受试者或患者。
[0461]
如本文所用，术语“患者”、“受试者”或“个体”可互换使用并且指人或非人动物。这些术语包括哺乳动物，例如人类、灵长类动物、家畜动物(例如牛科动物、猪)、宠物(例如犬科动物、猫科动物)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)。术语“哺乳动物”是指任何哺乳动物物种，例如人、小鼠、大鼠、狗、猫、仓鼠、豚鼠、兔、家畜等。
[0462]
根据本发明，将至少一种如本文定义的肽、衍生物或类似物或其药学上可接受的盐或溶剂合物，或如上定义的复合物以治疗有效量给予患者或受试者，其中本发明的化合物的“治疗有效量”意在描述足以治疗如本文定义的masp相关病症的本发明的化合物的量。在特定的实施方案中，治疗有效量将实现适用于任何医学治疗的期望收益/风险比。
[0463]
本发明特别包括以下实施方案，其中如下定义的式(i)或式(ii)的肽的取代基或部分可以独立地具有如下所述的含义。
[0464]
肽或含有如本文定义的肽或其衍生物或类似物或其药学上可接受的盐或溶剂合物或复合物或药物组合物(如下定义)的化合物在下文中通常也称为“本发明的masp抑制肽”。
[0465]
在一些实施方案中，本发明的masp抑制肽结合masp-1和/或masp-2，例如人masp-1和/或masp-2。在某些实施方案中，本发明的masp抑制肽特异性结合人masp-1和/或masp-2。如本文所用，“特异性结合”是指特异性结合剂与给定配体的相互作用优于样品中的其他试剂。例如，特异性结合给定配体的特异性结合剂在合适条件下以可观察到的超过样品中其他组分的任何非特异性相互作用的量或程度结合给定配体。合适的条件是允许给定特异性结合剂和给定配体之间相互作用的那些。这些条件包括ph、温度、浓度、溶剂、孵育时间等，并且在给定的特异性结合剂和配体对之间可能不同，但是本领域技术人员可以容易地确定。在一些实施方案中，本发明的masp抑制肽以比masp抑制肽参考化合物(例如本文提供的任何一种masp抑制肽参考化合物)更高的特异性结合masp-1和/或masp-2。
[0466]
因此，本发明进一步涉及包含至少一种如本文所定义的与masp-1或masp-2结合的肽或包含肽的化合物、衍生物或类似物的复合物。
[0467]
在一些实施方案中，本发明的masp抑制肽表现出与masp-1和/或masp-2(尤其是人masp-1和/或masp-2)的特异性结合，即比选定的masp抑制剂肽参考化合物至少高约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％、500％、700％、1000％或10000％。
[0468]
在一些实施方案中，本发明的masp抑制肽表现出与masp-1和/或masp-2(尤其是人masp-1和/或masp-2)的特异性结合，即比选定的masp抑制肽参考化合物至少高约1、2、3、4、5倍，或至少高约10、20、50或100倍。
[0469]
在一些实施方案中，本发明的masp抑制肽对masp-1和/或masp-2的结合亲和力比选定的masp抑制肽参考化合物至少高约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％、500％、700％、1000％或10000％。
[0470]
在一些实施方案中，本发明的masp抑制肽对masp-1和/或masp-2的结合亲和力比选定的masp抑制肽参考化合物至少高约1、2、3、4、5倍，或至少高约10、20、50、100或1000倍。
[0471]
在一些实施方案中，本发明的masp抑制肽表现出对masp-1和/或masp-2(例如，大鼠或人masp-1和/或masp-2)活性的抑制。在一些实施例中，该活性是体外或体内活性，例如本文所述的体外或体内活性。在一些实施方案中，本发明的masp抑制肽抑制由选定的masp抑制肽参考化合物所抑制的masp-1和/或masp-2的活性的至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％、500％、700％、1000％或10000％。
[0472]
在某些实施方案中，本发明的masp抑制肽表现出对masp-1和/或masp-2的抑制比选定的masp抑制肽参考化合物大1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180或200倍。
[0473]
在另一个特定的实施方案中，本发明的masp抑制肽对masp-1和/或masp-2的抑制活性通过测量它们对masp-1和/或masp-2(例如，大鼠人masp-1和/或masp-2)的ic
50
确定。对masp-1和/或masp-2的ic
50
可以通过本文所示的生化测定来完成。特别优选的是，本发明的masp抑制肽对masp-1和/或masp-2表现出ic
50
＜1,000nm，优选≤500nm，更优选≤300nm，更优选≤250nm，更优选≤200nm，更优选≤150nm，更优选≤100nm，更优选≤75nm，更优选≤50nm，更优选≤45nm，更优选≤40nm，更优选≤35nm，更优选≤30nm。
[0474]
在一些实施方案中，本发明的masp抑制肽与选定的masp抑制肽参考化合物相比对masp-1和/或masp-2(例如，大鼠或人masp-1和/或masp-2)具有较低的ic
50
(即较高的结合亲和力)。在一些实施方案中，本发明的masp抑制肽在masp-1和/或masp-2竞争性结合测定中的ic
50
比选定的masp抑制肽参考化合物的ic
50
低至少约5％、10％、20％、30％、40％、低50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％、500％、700％、1000％或10000％。
[0475]
在一些实施方案中，本发明的masp抑制肽对人masp-1和/或masp-2活性的体外抑制表现出比所选的masp抑制肽参考化合物至少高约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、97％、98％、99％或大于99％、100％、200％、300％、400％、500％、700％、1000％或10000％。
[0476]
在一些实施方案中，本发明的masp抑制肽对人masp-1和/或masp-2活性的体内抑制表现出比所选的masp抑制肽参考化合物至少高约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、97％、98％、99％或大于99％、100％、200％、300％、400％、500％、700％、1000％或10000％。
[0477]
如本文所用，在某些实施方案中，具有“masp-1和/或masp-2抑制活性”的masp抑制肽意指该化合物在体外或在受试者(例如小鼠或人)中当以剂量依赖性和时间依赖性的方式向其给药(例如通过肠胃外途径，例如通过注射，或通过肺、鼻、舌下、舌、颊、皮肤、透皮、结膜、眼部途径或作为植入物或支架口服给药)时，具有抑制c3沉积的能力。
[0478]
在一些实施方案中，本发明的masp抑制肽表现出抑制c3沉积(例如人c3沉积)。在一些实施方案中，c3沉积的抑制由体外或体内抑制确定。在一些实施方案中，本发明的masp抑制肽抑制选定的masp抑制肽参考化合物所抑制的c3沉积的至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％、500％、700％、1000％或10000％。
[0479]
在某些实施方案中，本发明的masp抑制肽对c3沉积的抑制比选定的masp抑制肽参
考化合物高1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180或200倍。
[0480]
在另一个特定的实施方案中，本发明的masp抑制肽的masp-1和/或masp-2抑制活性通过测量它们在体外或在受试者(例如小鼠或人)中抑制c3沉积的ic
50
来确定。c3沉积的ic
50
测定可用本文所示的c3人类沉积测定来完成。特别优选的是，本发明的masp抑制肽的c3沉积的ic
50
为＜1,000nm，优选≤500nm，更优选≤300nm，更优选≤250nm，更优选≤200nm，更优选≤150nm，更优选≤100nm，更优选≤75nm，更优选≤50nm，更优选≤45nm，更优选≤40nm，更优选≤35nm，更优选≤30nm。
[0481]
在一些实施方案中，本发明的masp抑制肽的体外c3-沉积抑制比选定的masp抑制肽参考化合物高至少约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、97％、98％、99％或大于99％、100％、200％、300％、400％、500％、700％、1000％或10000％。
[0482]
在一些实施方案中，本发明的masp抑制肽的体内c3-沉积抑制比选定的masp抑制肽参考化合物高至少约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、97％、98％、99％或大于99％、100％、200％300％、400％、500％、700％、1000％或10000％。
[0483]
特别优选的是，本发明的肽作为masp抑制肽，其活性根据本发明实施例的具体测定和/或体内研究的至少一种确定。
[0484]
由于它们的上述masp-1和/或masp-2抑制活性和c3-沉积抑制活性，含有本发明的肽的化合物或本发明的肽(包括其类似物、衍生物和药学上可接受的盐或溶剂合物以及上述复合物)适用于预防和/或治疗与masp-1和/或masp-2相关的病症。
[0485]
根据另一个实施方案，本发明提供了一种含有可以被分离和/或纯化的肽或衍生物、前药、类似物、药学上可接受的盐、溶剂合物或盐的溶剂合物的化合物，其作为masp-1和/或masp-2抑制剂和/或抑制c3沉积，所述肽包含式(i)或式(ii)、基本上由式(i)或式(ii)组成或由式(i)或式(ii)组成。
[0486]
如果需要，本发明的化合物可以单独使用或与其他活性化合物结合使用。本发明还涉及含有至少一种本发明的化合物和一种或多种其他活性化合物的药物，特别是用于治疗和/或预防上述疾病的药物。作为合适的结合活性化合物，我们可以举例并优选提及：
[0487]
·
抑制环磷酸鸟苷(cgmp)和/或环磷酸腺苷(camp)降解的化合物，例如磷酸二酯酶(pde)1、2、3、4和/或5的抑制剂，特别是pde 4抑制剂(例如罗氟司特(roflumilast)或瑞米斯特(revamilast))和pde 5抑制剂(例如西地那非(sildenafil)、伐地那非(vardenafil)、他达拉非(tadalafil)、乌地那非(udenafil)、达生他非(dasantafil)、阿伐那非(avanafil)、米罗那非(mirodenafil)或洛地那非(lodenafil))；
[0488]
·
鸟苷酸环化酶的no-非依赖性但血红素-依赖性刺激剂，特别是利奥西呱(riociguat)、奈罗昔夸(nelociguat)、维利西呱(vericiguat)和wo 00/06568、wo 00/06569、wo 02/42301、wo 03/095451、wo 2011/147809、wo 2012/004258、wo 2012/028647和wo 2012/059549中记载的化合物；
[0489]
·
鸟苷酸环化酶的no-非依赖性和血红素-依赖性活化剂，特别是runcaciguat、bi703704和wo 2012/139888、wo 2001/019780以及wo 2014/012934中记载的化合物；
[0490]
·
前列环素类似物和ip受体激动剂，例如并且优选伊洛前列素(iloprost)、贝前列素(beraprost)、曲前列素(treprostinil)、依前列醇(epoprostenol)、ns-304、西里帕格
(selexipag)或ralinepag；
[0491]
·
内皮素受体拮抗剂，例如并且优选波生坦(bosentan)、达鲁生坦(darusentan)、安立生坦(ambrisentan)、马西腾坦(macicentan)或西他生坦(sitaxsentan)；
[0492]
·
加压素受体拮抗剂，例如托伐普坦(tolvaptan)、考尼伐坦(conivaptan)、瑞考伐普坦(relcovaptan)；
[0493]
·
人中性粒细胞弹性蛋白酶(hne)抑制剂，例如并且优选西维来司他(sivelestat)或dx-890(reltran)；
[0494]
·
抑制信号转导级联的化合物，特别是来自酪氨酸激酶抑制剂的化合物，例如并优选达沙替尼(dasatinib)、尼洛替尼(nilotinib)、博舒替尼(bosutinib)、瑞戈非尼(regorafenib)、索拉非尼(sorafenib，)、舒尼替尼(sunitinib)、西地尼布(cediranib)、阿昔替尼(axitinib)、特拉替尼(telatinib)、伊马替尼(imatinib)、布立尼布(brivanib)、帕佐帕尼(pazopanib)、瓦他拉尼(vatalanib)、吉非替尼(gefltinib)、厄洛替尼(erlotinib)、拉帕替尼(lapatinib)、卡奈替尼(canertinib)、来他替尼(lestaurtinib)、佩利替尼(pelitinib)、塞马沙尼(semaxanib)、马赛替尼(masitinib)或坦度替尼(tandutinib)；
[0495]
·
来自ask1激酶抑制剂的信号转导调节剂，例如司隆色替(selonsertib)；
[0496]
·
rho激酶抑制剂，例如并优选法舒地尔(fasudil)、y-27632、slx-2119、bf-66851、bf-66852、bf-66853、ki-23095或ba-1049；
[0497]
·
降低血管壁通透性(水肿形成)的活性成分，例如并优选alk1-smad1/5信号通路抑制剂、vegf和/或pdgf信号通路抑制剂、环氧合酶抑制剂、激肽释放酶-激肽系统抑制剂或1-磷酸鞘氨醇信号通路抑制剂；
[0498]
·
皮质类固醇，例如可的松(cortisone)、皮质醇、泼尼松龙(prednisolone)、甲基泼尼龙、曲安奈德(triamcinolone)或地塞米松(dexamethasone)；
[0499]
·
减少氧化应激下器官损伤的活性成分，例如并优选补体系统抑制剂，特别是补体c5a受体拮抗剂、抗c5抗体或5-ht1a受体激动剂；
[0500]
·
转录因子nrf2的调节剂、刺激剂和增强剂，例如cxa-10、奥替普拉(oltipraz)、富马酸二甲酯或巴多索隆(bardoxolone)；
[0501]
·
肾上腺髓质素和肾上腺髓质素衍生物(例如聚乙二醇化肾上腺髓质素)以及肾上腺髓质素稳定剂(例如阿德瑞珠单抗(adrecizumab))；
[0502]
·
抑制缺氧诱导因子脯氨酰羟化酶(hif-ph抑制剂)的化合物，例如莫立斯他(molidustat)、伐度司他(vadadustat)、洛度司他(roxadustat)、达度司他(daprodustat)或desidustat；
[0503]
·
抑制诱导细胞死亡和凋亡途径的化合物，例如qpi-1002；
[0504]
·
c-met激动剂和肝细胞生长因子模拟物，例如refanalin；
[0505]
·
碱性磷酸酶和重组碱性磷酸酶；
[0506]
·
抑制炎症反应和t细胞增殖的化合物，例如cd28拮抗剂化合物，如瑞替莫德(reltecimod)；
[0507]
·
调节th17 t细胞活化的化合物，例如rorc/ror-γ转录因子调节剂；
[0508]
·
拮抗th17 t细胞反应的化合物，例如抗il-17抗体和抗il-23抗体，例如艾塞吉
珠单抗(ixekizumab)、苏金单抗(secukinumab)、布达鲁单抗(brodalumab)、优特吉努单抗(ustekinumab)、谷瑟库单抗(guselkumab)或ptg-200；
[0509]
·
抗血栓剂，例如并优选血小板聚集抑制剂、抗凝剂或原纤维蛋白溶解物质；
[0510]
·
在本发明的一个优选实施方案中，本发明的化合物与血小板聚集抑制剂(例如并优选阿司匹林、氯吡格雷(clopidogrel)、噻氯匹定(ticlopidine)或双嘧达莫(dipyridamole))联合给药。
[0511]
·
在本发明的一个优选实施方案中，本发明的化合物与凝血酶抑制剂(例如并优选希美加群(ximelagatran)、美拉加群(melagatran)、达比加群(melagatran)、比伐卢定(dabigatran)或克赛(clexane))联合给药。
[0512]
·
在本发明的一个优选实施方案中，本发明的化合物与gpiib/iiia拮抗剂(例如并优选替罗非班(tirofiban)或阿昔单抗(abciximab))联合给药。
[0513]
·
在本发明的一个优选实施方案中，本发明的化合物与xa因子抑制剂联合给药，例如并优选利伐沙班(rivaroxaban)、阿哌沙班(apixaban)、非迪沙班(fidexaban)、雷扎沙班(razaxaban)、磺达肝素(fondaparinux)、依达肝素(idraparinux)、du-176b、pmd-3112、ym-150、kfa-1982、emd-503982、mcm-17、mln-1021、dx 9065a、dpc 906、jtv 803、ssr-126512或ssr-128428。
[0514]
·
在本发明的一个优选实施方案中，本发明的化合物与肝素或低分子量(lmw)肝素衍生物联合给药。
[0515]
·
在本发明的一个优选实施方案中，本发明的化合物与凝血因子
ⅺ
的直接抑制剂、凝血因子xi表达的抑制剂和抗凝血因子xi抗体(例如xisomab 3g3)联合给药；
[0516]
·
在本发明的一个优选实施方案中，本发明的化合物与盐皮质激素-受体拮抗剂(例如且优选螺内酯(spironolactone)、依普利酮(eplerenone)或非奈利酮(finerenone))联合给药。
[0517]
·
在本发明的一个优选实施方案中，本发明的化合物与利尿剂联合给药，例如并优选呋塞米(furosemide)、布美他尼(bumetanide)、托拉塞米(torsemide)、苄氟噻嗪(bendroflumethiazide)、氯噻嗪、氢氯噻嗪、氢氟噻嗪、甲氯噻嗪、多噻嗪、三氯噻嗪、氯噻酮(chlorthalidone)、吲达帕胺(indapamide)、美托拉宗(metolazone)、喹噻酮(quinethazone)、乙酰唑胺(acetazolamide)、二氯苯磺胺(dichlorphenamide)、甲唑胺(methazolamide)、甘油、异山梨醇、甘露醇、阿米洛利(amiloride)或氨苯蝶啶(triamterene)。
[0518]
·
在本发明的一个优选实施方案中，本发明的化合物与ppar-γ激动剂联合给药，例如并优选比格列酮(pioglitazone)或罗格列酮(rosiglitazone)。
[0519]
·
在本发明的一个优选实施方案中，本发明的化合物与ppar-δ激动剂联合给药，例如并优选gw 501516或bay 68-5042。
[0520]
根据另一个实施方案，本发明提供了一种药物组合物，其包含至少一种含有肽(其可以被分离和/或纯化)或衍生物、前药、类似物、药学上可接受的盐、溶剂合物或盐的溶剂合物的化合物，结合一种或多种其他活性成分，所述肽包含式(i)或式(ii)、基本上由式(i)或式(ii)组成或由式(i)或式(ii)组成，所述其他活性成分选自以下：磷酸二酯酶抑制剂、鸟苷酸环化酶刺激剂或活化剂、ip受体激动剂、盐皮质激素受体拮抗剂、利尿剂、ppar-γ激
动剂、ppar-δ激动剂、皮质类固醇、减少氧化应激下器官损伤的活性成分、抑制诱导细胞死亡和凋亡途径的化合物、抑制炎症反应和t细胞增殖的化合物、抗血栓制剂、血小板聚集抑制剂、凝血酶抑制剂、gpiib/iiia拮抗剂、因子xa抑制剂、肝素或低分子量(lmw)肝素衍生物和凝血因子xi抑制剂。
[0521]
本发明还涉及包含至少一种如本文所定义的肽、衍生物或类似物或其药学上可接受的盐或溶剂合物，如上所定义的复合物或药物组合物，以及至少一种选自试剂、医疗器械、说明书或其任意组合的成套试剂盒结合物。
[0522]
本发明还涉及包含至少一种如本文定义的肽、衍生物或类似物或其药学上可接受的盐或溶剂合物，如上所定义的复合物或药物组合物的医疗装置，用于递送所述肽、其衍生物、类似物或复合物或药物组合物给受试者。
[0523]
如上定义的药物组合物、成套试剂盒结合物或医疗装置特别用于预防和/或治疗如本文定义的病症或疾病。
[0524]
本发明的masp抑制肽可能具有全身和/或局部活性。为此目的，它们可以以合适的方式给药，例如通过口服、肠胃外、肺、鼻、舌下、舌、颊、直肠、阴道、皮肤、透皮、结膜、耳部途径或作为植入物或支架。
[0525]
对于这些给药途径，本发明的化合物可以以合适的给药形式给药。
[0526]
对于口服给药，可以将本发明的化合物配制成本领域已知的剂型，其快速和/或以修饰的方式递送本发明的化合物，例如片剂(未包衣或包衣片剂，例如具有延迟溶解或不溶性的肠溶或控释包衣)、口腔崩解片、膜剂/薄片剂、膜剂/冻干物、胶囊剂(例如硬或软明胶胶囊)、糖衣片剂、颗粒剂、丸剂、粉末剂、乳液、悬浮剂、气雾剂或溶液。可以将本发明的化合物以结晶和/或无定型和/或溶解形式的掺入所述剂型中。
[0527]
肠胃外给药可以通过避免吸收步骤(例如静脉内、动脉内、心内、脊柱内或腰椎内)或包括吸收(例如肌肉内、皮下、皮内、经皮或腹膜内、眼内)来实现。适合肠胃外给药的给药形式特别为溶液、悬浮剂、乳液、冻干物或无菌粉末剂形式的注射和输注制剂。
[0528]
适用于其他给药途径的实例为用于吸入的药物形式[尤其是粉末吸入剂、雾化剂]、滴鼻剂、鼻溶液、鼻喷雾剂；用于舌、舌下或口腔给药的片剂/膜剂/薄片剂/胶囊剂；栓剂；滴眼液、眼药膏、洗眼液、眼部插入物、滴耳液、喷耳剂、耳粉、洗耳液、耳塞；阴道胶囊剂、局部涂药剂、水性悬浮液(洗剂、混合剂)、亲脂性悬浮剂、乳液、软膏、乳膏、透皮治疗系统(例如膏药)、乳剂、糊剂、泡沫剂、粉剂、植入物或支架。
[0529]
根据另一个实施方案，本发明提供了一种药物组合物，其包含至少一种含有肽(其可以被分离和/或纯化)或衍生物、前药、类似物、药学上可接受的盐、溶剂合物或盐的溶剂合物的化合物，结合一种或多种惰性、无毒、药学上合适的赋形剂，所述肽包含式(i)或式(ii)、基本上由式(i)或式(ii)组成或由式(i)或式(ii)组成。
[0530]
本发明的化合物可以加入至所述的给药形式中。这可以以本身已知的方式通过与药学上合适的赋形剂混合实现。药学上合适的赋形剂尤其包括：
[0531]
·
填料和载体(例如纤维素、微晶纤维素(例如)、乳糖、甘露醇、淀粉、磷酸钙(例如))，
[0532]
·
软膏基质(例如凡士林、石蜡、甘油三酯、蜡、羊毛蜡、羊毛蜡醇、羊毛脂、亲水性
软膏、聚乙二醇)，
[0533]
·
栓剂基质(例如聚乙二醇、可可脂、硬脂)，
[0534]
·
溶剂(例如水、乙醇、异丙醇、甘油、丙二醇、中链甘油三酯脂肪油、液态聚乙二醇、石蜡)，
[0535]
·
表面活性剂、乳化剂、分散剂或润湿剂(例如十二烷基硫酸钠)、卵磷脂、磷脂、脂肪醇(例如)、脱水山梨糖醇脂肪酸酯(例如)、聚氧乙烯脱水山梨糖醇脂肪酸酯(例如)、聚氧乙烯脂肪酸甘油酯(例如)、聚氧乙烯脂肪酸酯、聚氧乙烯脂肪醇醚、甘油脂肪酸酯、泊洛沙姆(例如，)，
[0536]
·
缓冲剂、酸和碱(例如磷酸盐、碳酸盐、柠檬酸、乙酸、盐酸、氢氧化钠溶液、碳酸铵、氨基丁三醇、三乙醇胺)，
[0537]
·
等渗剂(例如葡萄糖、氯化钠)，
[0538]
·
吸附剂(例如高分散二氧化硅)，
[0539]
·
增粘剂、凝胶形成剂、增稠剂和/或粘合剂(例如聚乙烯吡咯烷酮、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟丙基纤维素、羧甲基纤维素钠、淀粉、卡波姆、聚丙烯酸(例如，)；藻酸盐、明胶)，
[0540]
·
崩解剂(例如改性淀粉、羧甲基纤维素钠、羟基乙酸淀粉钠(例如，)、交联聚乙烯吡咯烷酮、交联羧甲基纤维素钠(例如，))，
[0541]
·
流动调节剂、润滑剂、助流剂和脱模剂(例如硬脂酸镁、硬脂酸、滑石粉、高分散二氧化硅(例如))，
[0542]
·
包衣材料(例如糖、虫胶)和用于膜或扩散膜的成膜剂——其快速溶解或以修饰的方式溶解(例如聚乙烯吡咯烷酮(例如，)、聚乙烯醇、羟丙基甲基纤维素、羟丙基纤维素、乙基纤维素、邻苯二甲酸羟丙基甲基纤维素酯、乙酸纤维素、乙酸邻苯二甲酸纤维素、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯，例如))，
[0543]
·
胶囊材料(例如明胶、羟丙基甲基纤维素)，
[0544]
·
合成聚合物(例如聚丙交酯、聚乙交酯、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯(例如)、聚乙烯吡咯烷酮(例如)、聚乙烯醇、聚乙酸乙烯酯、聚环氧乙烷、聚乙二醇及其共聚物和嵌段共聚物)，
[0545]
·
增塑剂(例如聚乙二醇、丙二醇、甘油、三乙酸甘油酯、柠檬酸三乙酰、邻苯二甲酸二丁酯)，
[0546]
·
渗透促进剂，
[0547]
·
稳定剂(例如抗氧化剂，例如抗坏血酸、抗坏血酸棕榈酸酯、抗坏血酸钠、丁基羟基苯甲醚、丁基羟基甲苯、没食子酸丙酯)，
[0548]
·
防腐剂(例如对羟基苯甲酸酯、山梨酸、硫柳汞(thiomersal)、苯扎氯铵、乙酸洗必泰(chlorhexidine acetate)、苯甲酸钠)，
[0549]
·
着色剂(例如无机颜料，例如氧化铁、二氧化钛)，
[0550]
·
调味剂、甜味剂、矫味剂和/或气味遮蔽剂。
[0551]
本发明还涉及包含至少一种如本文定义的肽、衍生物或类似物或其药学上可接受的盐或溶剂合物或如上定义的复合物的药物组合物。
[0552]
特别地，本发明涉及一种药物组合物，其包含至少一种如本文所定义的肽、衍生物或类似物或其药学上可接受的盐或溶剂合物或如上所定义的复合物，通常连同一种或多种药学上合适的赋形剂，以及它们根据本发明的用途。
[0553]
本发明的药物组合物可包含至少一种其他活性成分，例如优选地在预防和/或治疗如本文所定义的病症或疾病中具有活性的其他活性成分。
[0554]
至少一种如本文所定义的肽、衍生物或类似物或其药学上可接受的盐或溶剂合物或如上所定义的复合物或药物组合物可以肠内或肠胃外(包括静脉内、肌肉内、腹膜内、胸骨内、皮下、皮内和关节内注射和输注)、口服、阴道内、腹膜内、直肠内、局部或口腔给予。用于相应给药途径的合适的制剂为技术人员公知的并且包括但不限于：丸剂、片剂、肠溶片、膜片、层片、用于口服给药的缓释或延长释放制剂、膏药、局部缓释制剂、糖衣丸、子宫托(pessaries)、凝胶剂、软膏、糖浆、颗粒剂、栓剂、乳剂、分散剂、微胶囊、微制剂、纳米制剂、脂质体制剂、胶囊剂、肠溶胶囊剂、粉剂、吸入粉剂、微晶制剂、吸入性喷雾剂、粉剂、滴剂、滴鼻剂、鼻腔喷雾剂、气雾剂、安瓿、溶液、液体(juice)、悬浮剂、输注溶液或注射溶液等。
[0555]
根据另一个实施方案，本发明提供了一种药物组合物，其包含至少一种含有肽(其可以被分离和/或纯化)或衍生物、前药、类似物、药学上可接受的盐、溶剂合物或盐的溶剂合物的化合物，结合一种或多种惰性、无毒、药学上合适的赋形剂，所述肽包含式(i)或式(ii)、基本上由式(i)或式(ii)组成或由式(i)或式(ii)组成，所述药物组合物用于预防和/或治疗心血管和心肺疾病，休克，炎症性疾病，败血症的心血管，肺，脑和肾后遗症，缺血和/或再灌注相关的损伤，急性肾损伤，移植保护和移植物功能延迟，血液和造血器官和免疫系统的疾病，糖尿病后遗症，神经系统炎症性疾病，眼部疾病，皮肤疾病，呼吸系统疾病，消化系统疾病或泌尿生殖系统疾病以及烧伤后遗症和损伤后遗症。
[0556]
根据另一个实施方案，本发明提供一种药物组合物，其包含至少一种含有可以被分离和/或纯化的肽或衍生物、前药、类似物、药学上可接受的盐、溶剂合物或盐的溶剂合物的化合物，结合一种或多种其他活性成分，所述肽包含式(i)或式(ii)、基本上由式(i)或式(ii)组成或由式(i)或式(ii)组成，所述其他活性成分选自：磷酸二酯酶抑制剂、鸟苷酸环化酶刺激剂或活化剂、ip受体激动剂、盐皮质激素受体拮抗剂、利尿剂、ppar-γ激动剂、ppar-δ激动剂、皮质类固醇、减少氧化应激下器官损伤的活性成分、抑制诱导细胞死亡和凋亡途径的化合物、抑制炎症反应和t细胞增殖的化合物、抗血栓制剂、血小板聚集抑制剂、凝血酶抑制剂、gpiib/iiia拮抗剂、因子xa抑制剂、肝素或低分子量(lmw)肝素衍生物和凝血因子xi抑制剂，用于预防和/或治疗心血管和心肺疾病，休克，炎症性疾病，败血症的心血管、肺、脑和肾后遗症，缺血和/或再灌注相关损伤，急性肾损伤，移植保护和移植功能延迟，血液和造血器官和免疫系统的疾病，糖尿病后遗症，神经系统炎症疾病，眼部疾病，皮肤疾病，呼吸系统疾病，消化系统疾病或泌尿生殖系统疾病以及烧伤和损伤的后遗症。
[0557]
根据另一个实施方案，本发明提供了一种通过给予有效量的药物组合物用于治疗和/或预防人和动物中的以下疾病的方法：心血管和心肺疾病，休克，炎症性疾病，败血症的
心血管、肺、脑和肾后遗症，缺血和/或再灌注相关的损伤，急性肾损伤，移植保护和移植功能延迟，血液和造血器官和免疫系统的疾病，糖尿病后遗症，神经系统炎症疾病，眼部疾病，皮肤疾病，呼吸系统疾病，消化系统疾病或泌尿生殖系统疾病烧伤和损伤的后遗症，所述药物组合物包含至少一种含有可以被分离和/或纯化的肽或衍生物、前药、类似物、药学上可接受的盐、溶剂合物或盐的溶剂合物的化合物，所述肽包含式(i)或式(ii)、基本上由式(i)或式(ii)组成或由式(i)或式(ii)组成，或所述药物组合物包含至少一种含有可以被分离和/或纯化的肽或衍生物、前药、类似物、药学上可接受的盐、溶剂合物或盐的溶剂合物的化合物，结合一种或多种惰性、无毒、药学上合适的赋形剂和/或一种或多种其他活性成分，所述肽包含式(i)或式(ii)、基本上由式(i)或式(ii)组成或由式(i)或式(ii)。
[0558]
本发明的masp抑制肽的合适剂量可由主治医师在合理的医学判断范围内决定。任何特定受试者的特定治疗有效剂量水平将取决于多种因素，包括：a)所治疗的病症以及病症的严重程度；b)所用特定化合物的活性；c)所用的具体组合物，患者的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食；d)给药时间、给药途径和所用的特定铁调素类似物的排泄率；e)治疗的持续时间；f)与所使用的masp抑制肽联合使用或同时使用的药物，以及医学领域众所周知的类似因素。
[0559]
在特定的实施方案中，以单次或分次剂量给予受试者或患者的本发明的masp抑制肽的总日剂量可以是例如每日0.0001至300mg/kg体重或每日1至300mg/kg体重或每日约0.0001至约100mg/kg体重，例如每日约0.0005至约50mg/kg体重，例如每日约0.001至约10mg/kg体重，例如每日约0.01至约1mg/kg体重的量，以一剂或多剂给药，例如一至三剂。通常，本发明的masp抑制肽可以连续给予(例如通过静脉内给药或通过另一种连续给药方法)，或可以间隔地、通常以固定的时间间隔给予受试者，这取决于所需的剂量和由熟练从业者为特定受试者选择的药物组合物。固定给药的给药间隔包括例如每日一次、每日两次、每两日、三日、四日、五日或六日一次、每周一次或两次、每月一次或两次等。
[0560]
本发明还包括如本文所述的masp抑制肽用于制备药物，特别是用于制备用于预防和/或治疗如本文定义的病症或疾病的药物中的用途。
[0561]
本发明还包括制备本发明的肽、其衍生物或类似物或药学上可接受的盐或溶剂合物或复合物(各自如本文所述)的方法。其制造方法包括本发明的实施例中所示的步骤。
[0562]
通常，本发明的masp抑制肽可以合成或半重组制备。
[0563]
根据另一个实施方案，本发明提供一种通过使用固相多肽合成制备含有可被分离和/或纯化的肽或其衍生物、前药、类似物或药学上可接受的盐或溶剂合物的化合物的方法，所述肽包含式(i)或式(ii)、基本上由式(i)或式(ii)组成或由式(i)或式(ii)组成。
[0564]
根据另一个实施方案，本发明提供一种制备含有可被分离和/或纯化的肽或衍生物、前药、类似物、药学上可接受的盐、溶剂合物或盐的溶剂合物的化合物的方法，所述肽包含式(i)或式(ii)、基本上由式(i)或式(ii)组成或由式(i)或式(ii)组成，所述方法包括以下步骤：
[0565]
1.使用装载量为0.2-1.0mmol/g的2-氯三苯甲基-型树脂或装载量为0.2-1.0mmol/g的王-型树脂(wang-type resin)，
[0566]
2.将序列的c-末端氨基酸加载在树脂上，
[0567]
3.用在dmf或nmp中的15-25％哌啶溶液去除fmoc保护，
[0568]
4.使用3-8当量的化学计量将序列中的下一个氨基酸与偶联试剂(例如hbtu、hatu或dicc/oxyma)偶联，
[0569]
5.重复步骤3和4，直到序列完成，
[0570]
6.使用包含tfa和硫醇清除剂(thiol scavenger)的裂解混合物将肽从固体载体上裂解，
[0571]
7.在氧化条件下(空气或i2)环化序列中的两个半胱氨酸，
[0572]
8.使用反相hplc纯化切割的肽。
[0573]
根据另一个实施方案，本发明提供一种制备含有可被分离和/或纯化的肽或衍生物、前药、类似物、药学上可接受的盐、溶剂合物或盐的溶剂合物的化合物的方法，所述肽包含式(i)或式(ii)、基本上由式(i)或式(ii)组成或由式(i)或式(ii)组成，所述方法包括以下步骤：
[0574]
1.使用装载量为0.2-1.0mmol/g的2-氯三苯甲基-型树脂或装载量为0.2-1.0mmol/g的王-型树脂，
[0575]
2.将序列的c-末端氨基酸加载在树脂上，
[0576]
3.用在dmf或nmp中的15-25％哌啶溶液去除fmoc保护，
[0577]
4.使用3-8当量的化学计量将序列中的下一个氨基酸与偶联试剂(例如hbtu、hatu或dic/oxyma)偶联，
[0578]
5.重复步骤3和4，直到序列完成，
[0579]
6.使用包含tfa和硫醇清除剂的裂解混合物将肽从固体载体上裂解，
[0580]
7.在氧化条件下(空气或i2)环化序列中的两个半胱氨酸，
[0581]
8.使用反相hplc纯化切割的肽，
[0582]
9.转化为hcl盐。
[0583]
至少一种如本文所定义的肽、衍生物或类似物或其药学上可接受的盐或溶剂合物或如本文所定义的复合物也可在测量对masp抑制剂的反应性的生化测定中(例如在诊断测定中)或在任何基于masp抑制剂结合的生化测定中用作生化试剂。
[0584]
本发明还包括包含编码本发明的masp抑制肽的序列的多核苷酸以及包含多核苷酸的载体，所述载体包含编码本发明的masp抑制肽的序列。
[0585]
通过以下实施例进一步说明本发明，这些实施例涉及本发明的某些具体实施方案。除非另有说明，否则实施例是使用本领域技术人员在常规范围内公知的标准技术进行的。以下实施例仅用于说明的目的，并不旨在完全确定本发明的条件或范围。因此，它们不应以任何方式解释为限制本发明的范围。
具体实施方案
[0586]
实验部分中使用的缩写列表：
[0587]
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
埃
[0588]
aq.
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
含水的、水溶液
[0589]
bar
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
压力单位
[0590]
bpr
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
背压调节器
[0591]
conc
ꢀꢀꢀꢀꢀ
浓缩的
[0592]dꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
双重峰(nmr)
[0593]
dd
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
双二重峰(nmr)
[0594]
dcm
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
二氯甲烷
[0595]
dea
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
二乙胺
[0596]
二pea
ꢀꢀꢀꢀ
n，n，-二异丙基乙胺(h
ü
nig碱)
[0597]
dmap
ꢀꢀꢀꢀꢀ
4-二甲氨基吡啶
[0598]
dmf
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
n，n-二甲基甲酰胺
[0599]
dmso
ꢀꢀꢀꢀꢀ
二甲基亚砜
[0600]
dt
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
双三重峰(nmr)
[0601]
ea
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
乙酸乙酯
[0602]
ee
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
对映异构体过量
[0603]
ent
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
对映异构体
[0604]
eq
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
等价物
[0605]
equiv
ꢀꢀꢀꢀ
等价物(离子色谱法)
[0606]
esi
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
电喷雾电离(质谱)
[0607]
fmoc-osu 1-{[(9h-芴-9-基甲氧基)羰基]氧基}吡咯烷-2，5-二酮
[0608]
gc-ms
ꢀꢀꢀꢀ
气相色谱与质谱联用
[0609]hꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
小时
[0610]
hatu
ꢀꢀꢀꢀꢀ
o-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-n，n，n
′
，n
′‑
四甲基脲-六氟磷酸盐
[0611]
hplc
ꢀꢀꢀꢀꢀ
高压液相色谱
[0612]
ic
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
离子色谱
[0613]
id
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
内径
[0614]
l
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
升
[0615]
lc-ms
ꢀꢀꢀꢀ
液相色谱与质谱联用
[0616]
lihmds
ꢀꢀꢀ
双(三甲基甲硅烷基)酰胺锂
[0617]
lit.
ꢀꢀꢀꢀꢀ
文献
[0618]mꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
多重峰(nmr)
[0619]
mal二
ꢀꢀꢀꢀ
基质辅助激光解吸/电离(质谱)
[0620]
me
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
甲基
[0621]
min
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
分钟
[0622]
mm
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
毫米
[0623]
μm
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
微米(micrometer)(微米(micron))
[0624]mꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
摩尔
[0625]
mplc
ꢀꢀꢀꢀꢀ
中压液相色谱
[0626]
ms
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
质谱
[0627]
mtbe
ꢀꢀꢀꢀꢀ
叔丁基甲基醚
[0628]
mtp
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
微量滴定板
[0629]
m/z
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
质荷比(质谱)
[0630]
nm
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
纳米
[0631]
nmp
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
n-甲基-2-吡咯烷酮
[0632]
nmr
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
核磁共振波谱
[0633]
pbs
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
磷酸盐缓冲盐水
[0634]
pe
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
石油醚
[0635]
peg
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
聚乙二醇
[0636]
pos
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
阳性
[0637]
ppm
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
每百万的份数
[0638]
pr
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
丙基
[0639]
psi
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
每平方英寸的磅数(压力)
[0640]
q/quart
ꢀꢀ
四重峰(核磁共振)
[0641]
qd
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
四二重峰(nmr)
[0642]
quint
ꢀꢀꢀꢀ
五重峰(nmr)
[0643]
rac
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
外消旋的
[0644]
rf
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
保留因子(tlc)
[0645]
rp
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
反相(用于液相色谱)
[0646]
rt
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
保留时间(色谱法)
[0647]sꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
单峰(nmr)
[0648]sꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
秒(时间)
[0649]
spps
ꢀꢀꢀꢀꢀ
固相多肽合成
[0650]
t
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
三重峰(nmr)
[0651]
tbtu
ꢀꢀꢀꢀꢀ
o(苯并三唑-1-基)-n，n，n
′
，n
′‑
四甲基脲四氟硼酸盐
[0652]
tbu
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
叔丁基
[0653]
tea
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
三乙胺
[0654]
thf
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
四氢呋喃
[0655]
tlc
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
薄层色谱
[0656]
uplc
ꢀꢀꢀꢀꢀ
超高效液相色谱
[0657]
uv
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
紫外线
[0658]
其他缩写可在表2和表3中找到。
[0659]
lc-ms分析法
[0660]
方法1
[0661]
设备类型ms：thermofisherscientific ltq-orbitrap-xl；设备类型hplc：agilent 1200sl；柱：agilent，poroshell 120，3x150mm，sb-c182.7μm；洗脱液a：1l水+0.1％三氟乙酸；洗脱液b：1l乙腈+0.1％三氟乙酸；梯度：0.0min 2％b
→
1.5min 2％b
→
15.5min 98％b
→
18.0min 98％b；烘箱：40℃；流速：0.75ml/min；uv-检测：210nm。
[0662]
方法2
[0663]
设备类型ms：thermofisherscientific ltq-orbitrap-xl；设备类型hplc：agilent 1200sl；柱：agilent，poroshell 120；3x150mm，sb-c182.7μm；洗脱液a：1l水+0.1％三氟乙酸；洗脱液b：1l乙腈+0.1％三氟乙酸；梯度：0.0min 5％b
→
0.3min5％b
→
7.0min 98％b
→
10min98％b；烘箱：40℃；流速：0.75ml/min；uv-检测：210nm。
[0664]
方法3
[0665]
设备类型ms：waters tof仪器；设备类型uplc：waters acquity i-class；柱：ymc，triart c18，75x1mm，3.0μm x 12nm；洗脱液a：1l水+0.01％甲酸；洗脱液b：1l乙腈+0.01％甲酸；梯度：0.0min1％b
→
2.0min 1％b
→
8.0min 95％b
→
10.0min 95％b；烘箱：50℃；流速：0.63ml/min；uv-检测：210nm。
[0666]
方法4
[0667]
设备类型ms：waters tof仪器；设备类型uplc：waters acquity i-class；柱：ymc，triart c18，75x1mm，3.0μm x 12nm；洗脱液a：1l水+0.01％甲酸；洗脱液b：1l乙腈+0.01％甲酸；梯度：0.0min1％b
→
1.0min 1％b
→
15.0min 50％b
→
18.0min 95％b；烘箱：50℃；流速：0.63ml/min；uv-检测：210nm。
[0668]
方法5
[0669]
设备类型ms：waters tof仪器；设备类型uplc：waters acquity i-class；柱：waters，hsst3，2.1x50mm，c18 1.8μm；洗脱液a：1l水+0.01％甲酸；洗脱液b：1l乙腈+0.01％甲酸；梯度：0.0min 2％b
→
0.5min 2％b
→
7.5min 95％b
→
10.0min 95％b；烘箱：50℃；流速：1.00ml/min；uv-检测：210nm。
[0670]
方法6
[0671]
设备类型ms：waters synapt g2s；设备类型uplc：waters acquity i-class；柱：waters，beh300，2.1x150mm，c181.7μm；洗脱液a：1l水+0.01％甲酸；洗脱液b：1l乙腈+0.01％甲酸；梯度：0.0min 2％b
→
1.5min 2％b
→
8.5min 95％b
→
10.0min 95％b；烘箱：50℃；流速：0.50ml/min；uv-检测：220nm。
[0672]
方法7
[0673]
仪器类型ms：agilent 6410triple quad；仪器类型hplc：agilent1200；柱：gemini-nx c18 5μm150x4.6mm；洗脱液a：0.1％tfa的水溶液；洗脱液b：0.1％tfa的乙腈溶液；梯度：0.0min 20％b
→
20min 50％b
→
20.1min 90％b
→
23min 90％b；烘箱温度：50℃；流速：1.0ml/min；uv-检测：220nm。
[0674]
方法8
[0675]
仪器类型ms：agilent 6410triple quad；仪器类型hplc：agilent1200；柱：discovery bio wide pore c185μmx4.6mm；洗脱液a：0.1％tfa的水溶液；洗脱液b：0.1％tfa的乙腈溶液；梯度：0.0min 10％b
→
20min 80％b
→
20.1min 90％b
→
23min 90％b；烘箱温度：50℃；流速：1.0ml/min；uv-检测：220nm。
[0676]
方法9
[0677]
仪器：waters acquity sqd uplc系统；柱：waters acquity uplc hss t3 1.8μm 50x1mm；洗脱液a：1l水+0.25ml 99％甲酸，洗脱液b：1l乙腈+0.25ml 99％甲酸；梯度：0.0min 90％a
→
1.2min 5％a
→
2.0min 5％a；烘箱：50℃；流量：0.40ml/min；uv-检测：210nm。
[0678]
方法10
[0679]
仪器ms：thermo scientific ft-ms；仪器uhplc：thermo scientific ultimate 3000；柱：waters，hsst3，2.1x75mm，c181.8μm；洗脱液a：1l水+0.01％甲酸；洗脱液b：1l乙腈
+0.01％甲酸；梯度：0.0min 10％b
→
2.5min 95％b
→
3.5min 95％b；烘箱：50℃；流速：0.90ml/min；uv-检测：210nm/最佳积分路径210-300nm。
[0680]
方法11
[0681]
ms仪器：agilent ms quad6150；hplc：agilent 1290；柱：waters acquity uplc hss t3 1.8μm 50x2.1mm；洗脱液a：1l水+0.25ml甲酸，洗脱液b：1l乙腈+0.25ml甲酸；梯度：0.0min 90％a
→
0.3min 90％a
→
1.7min 5％a
→
3.0min 5％a；烘箱：50℃；流速：1.20ml/min；uv-检测：205-305nm。
[0682]
方法12
[0683]
仪器：waters acquity sqd uplc系统；柱：waters acquity uplc hss t3 1.8μm 50x1mm；洗脱液a：1l水+0.25ml99％甲酸，洗脱液b：1l乙腈+0.25ml99％甲酸；梯度：0.0min 95％a
→
6.0min 5％a
→
7.5min 5％a；烘箱：50℃；流速：0.35ml/min；uv-检测：210nm。
[0684]
方法13
[0685]
仪器：waters single quad ms系统；仪器waters uplc acquity；柱：waters beh c18 1.7μm 50x2.1mm；洗脱液a：1l水+1.0ml(25％氨水)/l，洗脱液b：1l乙腈；梯度：0.0min 92％a
→
0.1min 92％a
→
1.8min 5％a
→
3.5min 5％a；烘箱：50℃；流速：0.45；ml/min；uv-检测：210nm。
[0686]
方法14
[0687]
系统ms：waters tof仪器；uplc系统：waters acquity i-class；柱：waters acquity uplc peptide beh c181.7μm 150x2.1mm；洗脱液a：1l水+0.100ml 99％甲酸，洗脱液b：1l乙腈+0.100ml 99％甲酸；梯度：0.0min 90％a
→
0.25min 90％a
→
8.0min 45％a
→
10.0min 2％
→
12.0min 2％a；烘箱：50℃；流量：0.475ml/min；uv-检测：210nmo
[0688]
方法15
[0689]
ms仪器类型：agilent g6110a；hplc类型：agilent 1200 series lc；uv dad；柱：chromolith rp-18e 25x2.0mm；流动相a：0.0375％tfa的水溶液(v/v)，流动相b：0.01875％tfa的乙腈溶液(v/v)；梯度：0.01min 5％b
→
0.80min 95％b
→
1.20min 95％b
→
1.21min 5％b
→
1.5min 5％b；流速：1.50ml/min；烘箱温度：50℃；uv
‑‑
检测：220nm和254nm。
[0690]
maldi方法
[0691]
使用matrix assisted laser desorption/ionization(maldi)质谱法在bruker autoflex max lrf maldi ms time-of-flight(tof-ms)系统上对选定的肽进行精确质量测量。使用α-氰基-4-羟基肉桂酸(cas 28166-41-8)作为基质，在bruker maldi靶板(target plate)上制备样品。制备样品肽0.1至1.0mg于1.0ml乙腈-水(50/50或30/70)中的溶液和基质(10mg/ml)在50％的乙腈于含0.05％三氟乙酸的水中的原液。将1.0ul的各溶液置于maldi靶板上并使其干燥。然后将样品准备好进行分析。推荐的maldi靶板的样品制备可以在bruker提供的文献中找到。
[0692]
离子色谱分析法
[0693]
方法：ic-定量
[0694]
使用外标对阳离子和阴离子进行定量测量；仪器：thermo scientific ics 5000+；毛细管ic柱：ionpac as11-hc和ionpac cs16；洗脱液：梯度洗脱液[h]+[oh]-；检测器：电导检测；可能的常规阴离子：乙酸根、溴离子、柠檬酸根、氯离子、氟离子、甲酸根、乳酸根、甲
technology ltd、suzhou highfine biotech co.，ltd、wuxi apptec，或通过其他中国供应商采购。内部合成了一些特殊的fmoc-保护的氨基酸，本文描述了这些合成方法。一些内部合成的fmoc氨基酸也可商购获得。在某些情况下，fmoc-保护的氨基酸不是市售的，但boc-保护的(叔丁基氧羰基＝boc)非天然氨基酸是市售的，fmoc-保护的氨基酸是从boc保护的氨基酸通过脱保护和使用本领域常用的方法重新保护而制备。在大多数情况下，用于合成本发明肽的市售非天然氨基酸的cas号已包含在表5中。在购买外消旋氨基酸(fmoc或boc)的情况下，本领域技术人员应该认识到可以使用手性色谱分离对映异构体，实际上有时这样做是为了在肽合成之前选择对映异构纯氨基酸。
[0705]
以下非天然氨基酸已用于制备本发明的肽。fmoc-或boc-保护的氨基酸要么通过商业来源获得(cas号可用)，要么通过本文所述的方法内部合成。表5显示了用于肽合成的化学基团/氨基酸的cas号(右列)和肽中存在的相应化学基团/氨基酸(左列)。
[0706]
表5：本发明的非天然氨基酸和化学基团的可用性
[0707]
[0708]
[0709]
[0710]
[0711]
[0712]
[0713]
[0714]
[0715]
[0716][0717]
固相树脂购自novabiochem、bachem、irisbiotech、pcasbiomatrix、glbiochem(shanghai)ltd、cem或protein technologies。树脂装载量为0.3-1.0mmol/g。根据所需的c-末端，在2-氯三苯甲基树脂、王树脂或rink酰胺型树脂上合成肽。芴基甲氧基羰基(fmoc)保护基的裂解在室温下使用20％哌啶的二甲基甲酰胺溶液来实现。各fmoc裂解步骤进行两次。使用8当量的fmoc-氨基酸与8当量的dic(二异丙基碳二亚胺)(0.5m的dmf溶液)和8当量的oxyma(氰基羟基亚氨基乙酸乙酯)(0.5m的dmf溶液)在自动合成仪(symphonyx)上偶联氨基酸。当使用symphony x时，氨基酸偶联在室温和氮气气氛下进行。当使用昂贵或自行制备的fmoc-氨基酸时，使用3当量的fmoc-氨基酸与3当量的dic(0.5m的dmf溶液)和3当量oxyma(0.5m的dmf溶液)手动进行偶联。每个氨基酸偶联步骤进行两次(双偶联)。或者，使用3当量的fmoc-氨基酸、2.85当量的hbtu((2-(1h-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸盐，六氟磷酸盐苯并三唑四甲基脲(hexafluorophosphate benzotriazole tetramethyl uronium)(0.5m的dmf溶液))和6当量的dipea(0.5m的dmf溶液)通过spps手动制备。使用茚三酮测试监测偶联反应。
[0718]
使用三氟乙酸(tfa)/苯甲硫醚(ta)/1，2-乙二硫醇(edt)(90∶7∶3)或92.5％tfa/2.5％edt/2.5％tis(三异丙基硅烷)/2.5％水将肽完全脱保护。对于含有甲硫氨酸的肽，在室温下用1.6％edt和1.2％三甲基甲硅烷基溴的tfa溶液处理肽2小时以还原氧化的甲硫氨酸。
[0719]
二硫环化：
[0720]
二硫键通过在0.1m碳酸氢铵缓冲液(ph 7.83)中振荡浓度为0.5mg/ml的肽过夜而形成。然后将该溶液冻干。或者，通过将肽在用浓度为1-3mg/ml的固体碳酸氢铵缓冲液调节至ph 9.0的乙腈/水(通常为3∶7)混合物中振荡过夜来形成二硫键。或者，二硫键通过以下步骤制备：在20℃下用碘(i2)(0.1m的甲醇溶液)在乙腈/水(1∶1)中氧化浓度为1-1.3mg/ml的肽2分钟，然后用硫代硫酸钠(0.1m的水溶液)处理，然后冷冻干燥。
[0721]
任选的乙酰化：
[0722]
使用10当量的乙酸酐的dmf(2ml)溶液和2.5当量的dipea通过在室温下在定轨摇床(orbital shaker)上振荡悬浮液1小时来进行n-末端乙酰化。去除溶剂并用dmf(5x)和
si bai，meng wu，xia wang，bernd riedl，elisabeth pook，carsten alt，marion erny，yi-ming li，donald bierer，jing shi，ge-min fang chem.commun.，2019，55，2821-2824；(8)shuai-shuai sun，junyou chen，rui zhao，donald bierer，jun wang，ge-min fang，yi-ming li tetrahedron letters 2019，60，1197-1201；(9)c.m.b.k.kourra and n.cramer chem.sci.，2016，7，7007-7012。
[0730]
除非另有说明，本发明的所有肽均为tfa盐。
[0731]
用于masp肽自动spps的通用方法(方法a)
[0732]
((n-me)g)-ic+srslp-(oic)-i-(pen)+ipd-nh2(实施例165)的合成为代表性的。
[0733]
该肽使用标准fmoc化学合成。
[0734]
自动spps在symphony x肽合成仪(protein technologies)上进行。chem-matrix rink酰胺树脂通常以0.1mmol规模使用(装载量为0.5mmol/g)。将树脂置入反应容器中并置于仪器上。在合成过程中制备并使用了以下溶液：
[0735]
1)fmoc氨基酸：0.2m(8eq)
[0736]
2)活化剂1：0.5m dic的dmf溶液(7.5eq)
[0737]
3)活化剂2：0.5m oxyma的dmf溶液(7.5eq)
[0738]
4)fmoc脱保护：20％哌啶的dmf溶液
[0739]
5)乙酸酐(10当量)于2ml dmf中
[0740]
通常对每个氨基酸进行双偶联。对于昂贵的非天然fmoc或boc氨基酸、内部合成的fmoc氨基酸或n-甲基化氨基酸，序列被中断并手动偶联该氨基酸(双偶联，但通常使用较少的试剂(3-5当量))。该偶联完成后，合成通常在合成仪上继续进行。如果将n-甲基氨基酸添加至序列中，通常也手动偶联下一个氨基酸。所有步骤均在室温、氮气下进行。fmoc-pen和fmoc-oic通常使用自动spps偶联。fmoc(n-me)g通常手动偶联。ahx总是手动偶联。
[0741]
将树脂溶胀并用dmf(3x3ml，10分钟)洗涤。如果树脂含有fmoc，则用20％哌啶溶液(2x3ml，10分钟)去除fmoc。用dmf(6x3ml，30秒)洗涤树脂。
[0742]
偶联：
[0743]
加入fmoc-asp(t-bu)(4.0ml)。加入活化剂1溶液(dic，1.5ml)和活化剂2溶液(oxyma，1.5ml)并使偶联在氮气鼓泡下进行2小时。排干溶液并用dmf(1x3ml，30秒)洗涤。重复偶联步骤。加入fmoc-asp(ot-bu)(4.0ml)。添加活化剂1溶液(dic，1.5ml)和活化剂2溶液(oxyma，1.5ml)并使偶联在氮气鼓泡下进行2小时。排干溶液并用dmf(6x3ml，30秒)洗涤。
[0744]
fmoc裂解：
[0745]
通过添加20％哌啶溶液(2x3ml，10min)去除fmoc保护基团。用dmf(6x3ml，30秒)洗涤树脂。
[0746]
偶联：
[0747]
加入fmoc-pro(4.0ml)。加入活化剂1溶液(dic，1.5ml)和活化剂2溶液(oxyma，1.5ml)并使偶联在氮气鼓泡下进行2小时。排干溶液并用dmf(1x3ml，30秒)洗涤。重复偶联步骤。加入fmoc-pro(4.0ml)。加入活化剂1溶液(dic，1.5ml)和活化剂2溶液(oxyma，1.5ml)并使偶联在氮气鼓泡下进行2小时。排干溶液并用dmf(6x3ml，30秒)洗涤。
[0748]
fmoc裂解：
[0749]
通过加入20％哌啶溶液(2x3ml，10min)去除fmoc保护基团。用dmf(6x3ml，30秒)洗
涤树脂。
[0750]
偶联：
[0751]
加入fmoc-ile(4.0ml)。加入活化剂1溶液(dic，1.5ml)和活化剂2溶液(oxyma，1.5ml)并使偶联在氮气鼓泡下进行2小时。排干溶液并用dmf(1x3ml，30秒)洗涤。重复偶联步骤。加入fmoc-ile(4.0ml)。加入活化剂1溶液(dic，1.5ml)和活化剂2溶液(oxyma，1.5ml)并使偶联在氮气鼓泡下进行2小时。排干溶液并用dmf(6x3ml，30秒)洗涤。
[0752]
fmoc裂解：
[0753]
通过加入20％哌啶溶液(2x3ml，10min)去除fmoc保护基团。用dmf(6x3ml，30秒)洗涤树脂。
[0754]
偶联：
[0755]
加入fmoc-pen(trt)(4.0ml)。加入活化剂1溶液(dic，1.5ml)和活化剂2溶液(oxyma，1.5ml)并使偶联在氮气鼓泡下进行2小时。排干溶液并用dmf(1x3ml，30秒)洗涤。重复偶联步骤。加入fmoc-pen(trt)(4.0ml)。加入活化剂1溶液(dic，1.5ml)和活化剂2溶液(oxyma，1.5ml)并使偶联在氮气鼓泡下进行2小时。排干溶液并用dmf(6x3ml，30秒)洗涤。
[0756]
fmoc裂解：
[0757]
通过加入20％哌啶溶液(2x3ml，10min)去除fmoc保护基团。用dmf(6x3ml，30秒)洗涤树脂。
[0758]
偶联：
[0759]
加入fmoc-ile(4.0ml)。加入活化剂1溶液(dic，1.5ml)和活化剂2溶液(oxyma，1.5ml)并使偶联在氮气鼓泡下进行2小时。排干溶液并用dmf(1x3ml，30秒)洗涤。重复偶联步骤。加入fmoc-ile(4.0ml)。加入活化剂1溶液(dic，1.5ml)和活化剂2溶液(oxyma，1.5ml)并使偶联在氮气鼓泡下进行2小时。排干溶液并用dmf(6x3ml，30秒)洗涤。
[0760]
fmoc裂解：
[0761]
通过加入20％哌啶溶液(2x3ml，10min)去除fmoc保护基团。用dmf(6x3ml，30秒)洗涤树脂。
[0762]
偶联：
[0763]
加入fmoc-oic(4.0ml)。加入活化剂1溶液(dic，1.5ml)和活化剂2溶液(oxyma，1.5ml)并使偶联在氮气鼓泡下进行2小时。排干溶液并用dmf(1x3ml，30秒)洗涤。重复偶联步骤。加入fmoc-oic(4.0ml)。加入活化剂1溶液(dic，1.5ml)和活化剂2溶液(oxyma，1.5ml)并使偶联在氮气鼓泡下进行2小时。排干溶液并用dmf(6x3ml，30秒)洗涤。
[0764]
fmoc裂解：
[0765]
通过加入20％哌啶溶液(2x3ml，10min)去除fmoc保护基团。用dmf(6x3ml，30秒)洗涤树脂。
[0766]
偶联：
[0767]
加入fmoc-pro(4.0ml)。加入活化剂1溶液(dic，1.5ml)和活化剂2溶液(oxyma，1.5ml)并使偶联在氮气鼓泡下进行2小时。排干溶液并用dmf(1x3ml，30秒)洗涤。重复偶联步骤。加入fmoc-pro(4.0ml)。加入活化剂1溶液(dic，1.5ml)和活化剂2溶液(oxyma，1.5ml)并使偶联在氮气鼓泡下进行2小时。排干溶液并用dmf(6x3ml，30秒)洗涤。
[0768]
fmoc裂解：
[0769]
通过加入20％哌啶溶液(2x3ml，10min)去除fmoc保护基团。用dmf(6x3ml，30秒)洗涤树脂。
[0770]
偶联：
[0771]
加入fmoc-leu(4.0ml)。加入活化剂1溶液(dic，1.5ml)和活化剂2溶液(oxyma，1.5ml)并使偶联在氮气鼓泡下进行2小时。排干溶液并用dmf(1x3ml，30秒)洗涤。重复偶联步骤。加入fmoc-leu(4.0ml)。加入活化剂1溶液(dic，1.5ml)和活化剂2溶液(oxyma，1.5ml)并使偶联在氮气鼓泡下进行2小时。排干溶液并用dmf(6
×
3ml，30秒)洗涤。
[0772]
fmoc裂解：
[0773]
通过加入20％哌啶溶液(2x3ml，10min)去除fmoc保护基团。用dmf(6x3ml，30秒)洗涤树脂。
[0774]
偶联：
[0775]
加入fmoc-ser(t-bu)(4.0ml)。加入活化剂1溶液(dic，1.5ml)和活化剂2溶液(oxyma，1.5ml)并使偶联在氮气鼓泡下进行2小时。排干溶液并用dmf(1x3ml，30秒)洗涤。重复偶联步骤。加入fmoc-ser(t-bu)(4.0ml)。加入活化剂1溶液(dic，1.5ml)和活化剂2溶液(oxyma，1.5ml)并使偶联在氮气鼓泡下进行2小时。排干溶液并用dmf(6x3ml，30秒)洗涤。
[0776]
fmoc裂解：
[0777]
通过加入20％哌啶溶液(2x3ml，10min)去除fmoc保护基团。用dmf(6x3ml，30秒)洗涤树脂。
[0778]
偶联：
[0779]
加入fmoc-arg(pbf)(4.0ml)。加入活化剂12溶液(dic，1.5ml)和活化剂2溶液(oxyma，1.5ml)并使偶联在氮气鼓泡下进行2小时。排干溶液并用dmf(1x3ml，30秒)洗涤。重复偶联步骤。加入fmoc-arg(pbf)(4.0ml)。加入活化剂1溶液(dic，1.5ml)和活化剂2溶液(oxyma，1.5ml)并使偶联在氮气鼓泡下进行2小时。排干溶液并用dmf(6x3ml，30秒)洗涤。
[0780]
fmoc裂解：
[0781]
通过加入20％哌啶溶液(2x3ml，10min)去除fmoc保护基团。用dmf(6x3ml，30秒)洗涤树脂。
[0782]
偶联：
[0783]
加入fmoc-ser(t-bu)(4.0ml)。加入活化剂1溶液(dic，1.5ml)和活化剂2溶液(oxyma，1.5ml)并使偶联在氮气鼓泡下进行2小时。排干溶液并用dmf(1x3ml，30秒)洗涤。重复偶联步骤。加入fmoc-ser(t-bu)(4.0ml)。加入活化剂1溶液(dic，1.5ml)和活化剂2溶液(oxyma，1.5ml)并使偶联在氮气鼓泡下进行2小时。排干溶液并用dmf(6x3ml，30秒)洗涤。
[0784]
fmoc裂解：
[0785]
通过加入20％哌啶溶液(2x3ml，10min)去除fmoc保护基团。用dmf(6x3ml，30秒)洗涤树脂。
[0786]
偶联：
[0787]
加入fmoc-cys(trt)(4.0ml)。加入活化剂1溶液(dic，1.5ml)和活化剂2溶液(oxyma，1.5ml)并使偶联在氮气鼓泡下进行2小时。排干溶液并用dmf(1x3ml，30秒)洗涤。重复偶联步骤。加入fmoc-cys(trt)(4.0ml)。加入活化剂1溶液(dic，1.5ml)和活化剂2溶液(oxyma，1.5ml)并使偶联在氮气鼓泡下进行2小时。排干溶液并用dmf(6x3ml，30秒)洗涤。
[0788]
fmoc裂解：
[0789]
通过加入20％哌啶溶液(2x3ml，10min)去除fmoc保护基团。用dmf(6x3ml，30秒)洗涤树脂。
[0790]
偶联：
[0791]
加入fmoc-ile(4.0ml)。加入活化剂1溶液(dic，1.5ml)和活化剂2溶液(oxyma，1.5ml)并使偶联在氮气鼓泡下进行2小时。排干溶液并用dmf(1x3ml，30秒)洗涤。重复偶联步骤。加入fmoc-ile(4.0ml)。加入活化剂1溶液(dic，1.5ml)和活化剂2溶液(oxyma，1.5ml)并使偶联在氮气鼓泡下进行2小时。排干溶液并用dmf(6x3ml，30秒)洗涤。
[0792]
fmoc：
[0793]
通过加入20％哌啶溶液(2x3ml，10min)去除fmoc保护基团。用dmf(6x3ml，30秒)洗涤树脂。
[0794]
自动spps期间的手动偶联：
[0795]
将fmoc-(n-me)g(0.2m的dmf溶液，5当量)加入到树脂中。加入活化剂1溶液(dic，1.5ml)和活化剂2溶液(oxyma，1.5ml)，并在振荡(热混合仪(thermomixer)，室温)下偶联2小时。过滤溶液并用dmf(1x3ml，30秒)洗涤。重复偶联步骤。加入fmoc-(n-me)g(0.2m的dmf溶液，5当量)。加入活化剂1溶液(dic，1.5ml)和活化剂2溶液(oxyma，1.5ml)并在振荡(热混合仪，室温)下偶联2小时。过滤溶液并用dmf(6x3ml，30秒)洗涤。
[0796]
fmoc裂解：
[0797]
通过加入20％哌啶溶液(2x3ml，10min)去除fmoc保护基团。用dmf(6x3ml，30秒)洗涤树脂。
[0798]
如果序列中存在其他氨基酸，则使用上述步骤将它们偶联。
[0799]
裂解试验：
[0800]
当进行手动偶联时，通常进行裂解试验以监测反应。试验裂解混合物为tfa/edt/茴香硫醚(90∶3∶7)；在室温、750rpm下在热混合仪上振荡1.5小时。使用上述方法之一通过lc-ms进行分析。
[0801]
全裂解(full cleavage)：
[0802]
将含有肽的树脂置入注射器中，并将3.0ml裂解缓冲液tfa/edt/茴香硫醚(90∶3∶7)加入到树脂中。混合物在室温下振荡2.5小时。过滤收集溶液，加入冷乙醚(-20℃)沉淀肽。在氮气气氛下，在falcon管(60ml)中离心(3000rpm)溶液。倾析出乙醚并用冷乙醚反复洗涤固体残余物(5x10ml)。然后干燥固体残余物。
[0803]
二硫环化：
[0804]
将粗肽以1mg/2ml的浓度溶于0.1m碳酸氢铵(ph 7.8-8.2)中。使溶液在与空气连通的圆底烧瓶中在定轨摇床上振荡过夜。然后将该溶液冻干以获得白色粉末。
[0805]
用于hplc纯化的柱筛选：
[0806]
将肽溶于5％ch3cn和95％水中。对每种肽进行柱筛选以确定用于纯化的制备型hplc方法。筛选了以下分析柱。
[0807]
两种方法可用于柱筛选：
[0808]
1)5-60％acn_8min_1ml/min_25℃
[0809]
2)30-85％acn_8min_1ml/min_25℃
[0810]
可用柱(50mm x id 4，6mm)(也可用作制备柱)：
[0811]
1)aeris c18(phenomenex)
[0812]
2)x-bridge c18(waters)
[0813]
3)kinetex c18(coreshell material)(phenomenex)
[0814]
4)ymc triart c18(可用100％水洗脱)
[0815]
5)kinetix biphenyl(phenomenex)
[0816]
6)x-select c18(正电荷)
[0817]
7)jupiter proteo c18(phenomenex)
[0818]
8)luna c18(phenomenex)
[0819]
对于本发明的肽，使用以下5个制备柱之一：
[0820]
1)柱：phenomenex，aeris peptide 5μ xb-c18，axia packed，21，2x250mm+cartridge 5μ
[0821]
2)柱：phenomenex，kinetex c18 5μ 21，5x250mm+cartridge 5μ
[0822]
3)柱：phenomenex，kinetex 5μ biphenyl 100a，axia packed，21，2x250mm+cartridge 5μ
[0823]
4)柱：ymc actus triart prep.c1812nm，s-10μm 250x20mm+cartridge 3μm(10x4mm)
[0824]
5)柱：waters，xbridge prep.c18 5μ obd 19x250mm+cartridge 10μ
[0825]
选择色谱柱后，使用以下方法之一：
[0826]
1)方法：梯度5-60％acn水溶液(0，10％tfa)
[0827]
2)方法：梯度30-85％acn水溶液(0，10％tfa)
[0828]
3)基于柱筛选结果的富集梯度(focused gradient)。
[0829]
流速20ml/min
[0830]
将合并的级分通过hplc(5-95在8分钟内，chromolith speedrod&ymc c18 5-95在18分钟内)并使用上述lc-ms方法之一进行分析。
[0831]
对于实施例165，将粗肽溶于ch3cn/水(1∶1)中并在phenomenex kinetex柱c18 5μ，21.5x250mm+5μcartridge上纯化，流速：20ml/min，方法：5-60％acn水溶液(各包含0.10％tfa)经48分钟。将合并的级分冻干以提供39mg(95％纯度)实施例165。
[0832]
表6：所用材料及条件说明
[0833][0834]
用于masd肽自动spps的通用方法(方法b)
[0835]
((n-me)g)-ic+srslp-(oic)-i-(pen)+i-((5-氮杂螺[2.4]庚烷-1-羧酸)-oh(实施例164)的合成为代表性的。
[0836]
该肽使用标准fmoc化学合成。
[0837]
如果可能，使用预装载(preloaded)第一个氨基酸的王树脂(例如预装载fmoc-asp(t-bu)-oh、fmoc-pro-oh等)，典型装载量为0.55-0.7mmol/g。当第一个氨基酸不可用时，将其手动加入。
[0838]
当第一个氨基酸不能作为预装载树脂时，将其手动加入并使用氯三苯甲基树脂进行合成。
[0839]
在2-氯三苯甲基树脂上装载第一个氨基酸：
[0840]
将2-氯三苯甲基树脂(500mg，0.775mmol)在50ml falcon管中用10ml dcm溶胀15分钟，将5-[(9h-芴-9-基甲氧基)羰基]-5-氮杂螺[2.4]庚烷-1-羧酸(281mg，0.775mmol)溶于dcm中，加入diea(6当量，0.81ml)，并将溶液加入树脂中。溶液用氩气吹扫并在室温下振荡过夜。过滤混合物并用dmf(3x5ml)和dcm(3x5ml)洗涤。加入甲醇(5ml)，将混合物振荡30分钟，然后过滤。用dmf(3x5ml)和dcm(3x5ml)洗涤树脂。再次加入甲醇(5ml)，将混合物振荡30分钟，然后过滤。用dmf(3x5ml)和dcm(3x5ml)洗涤树脂。基于下述装载程序的确定，确定装载量为0.42mmol/g。
[0841]
然后将该树脂用于在来自protein technologies的symphony x合成仪上以0.1mmol规模进行自动化spps。
[0842]
测定树脂装载量：
[0843]
为了测定树脂的装载量，将fmoc保护基团从确定量的树脂上裂解下来，然后通过光度测定法在301nm处测量上清裂解溶液中所得芴基化合物的浓度。这与装载在树脂上的
氨基酸的量直接相关。
[0844]
1)称取1-3mg树脂放入2ml eppendorf管或类似管中(注意精确量)
[0845]
2)加入1000μl 20％哌啶的dmf溶液。
[0846]
3)搅拌混合物30分钟以裂解fmoc基团。
[0847]
4)然后将100μl上清液转移到石英玻璃比色皿中，并用900μl 20％哌啶/dmf稀释
[0848]
5)在第二个比色皿中制备1000μl哌啶/dmf的空白样品。
[0849]
6)确定对照样品的空白值后，然后在uv-vis光度计(thermo scientific evolution 201)中测量测试样品在λ＝301nm处的消光。
[0850]
7)为了更高的准确度，可以制作多个测试样品(通常为两个)；然后使用测得的消光的算术平均值进行计算。
[0851]
计算树脂装载量：
[0852]
以mmol/g计的树脂装载量l
301
由下式计算：
[0853][0854]
e＝消旋
[0855]
ε＝301nm波长处的消光系数(7800l/mol＊cm)
[0856]
m＝使用的树脂量(g)
[0857]
v＝样品体积(l)
[0858]
d＝比色皿的层厚(cm)
[0859]
vf＝稀释系数(＝10)
[0860]
fmoc裂解：
[0861]
通过加入20％哌啶溶液(2x3ml，10min)去除fmoc保护基团。用dmf(6x3ml，30秒)洗涤树脂。
[0862]
随后fmoc氨基酸的偶联如方法a中所述进行。
[0863]
在合成过程中制备并使用以下溶液：
[0864]
1)fmoc氨基酸：0.2m(8eq)
[0865]
2)活化剂1：0.5m dic的dmf溶液(7.5eq)
[0866]
3)活化剂2：0.5m oxyma的dmf溶液(7.5eq)
[0867]
4)fmoc脱保护剂：20％哌啶的dmf溶液
[0868]
5)乙酸酐于2ml dmf中(10当量)
[0869]
通常对每个氨基酸进行双偶联。对于昂贵的非天然fmoc或boc氨基酸、内部合成的fmoc氨基酸或n-甲基化氨基酸，序列被中断并手动偶联该氨基酸(双偶联，但通常使用较少的试剂(3-5当量)。该偶联完成后，合成通常在合成仪上继续进行。如果将n-甲基氨基酸加入到序列中，通常也手动偶联下一个氨基酸。所有步骤均在室温、氮气下进行。fmoc-pen和fmoc-oic通常使用自动spps偶联。fmoc(n-me)g通常手动偶联。ahx总是手动偶联。
[0870]
fmoc裂解：
[0871]
将树脂溶胀并用dmf(3x3ml，10分钟)洗涤。如果树脂含有fmoc，则用20％哌啶溶液(2x3ml，10分钟)去除fmoc。用dmf(6x3ml，30秒)洗涤树脂。
[0872]
偶联：
[0873]
加入fmoc-ile(4.0ml)。加入活化剂1溶液(dic，1.5ml)和活化剂2溶液(oxyma，1.5ml)并使偶联在氮气鼓泡下进行2小时。排干溶液并用dmf(1x3ml，30秒)洗涤。重复偶联步骤。加入fmoc-ile(4.0ml)。加入活化剂1溶液(dic，1.5ml)和活化剂2溶液(oxyma，1.5ml)并使偶联在氮气鼓泡下进行2小时。排干溶液并用dmf(6x3ml，30秒)洗涤。
[0874]
fmoc裂解：
[0875]
通过加入20％哌啶溶液(2x3ml，10min)去除fmoc保护基团。用dmf(6x3ml，30秒)洗涤树脂。
[0876]
偶联：
[0877]
加入fmoc-pen(trt)(4.0ml)。加入活化剂1溶液(dic，1.5ml)和活化剂2溶液(oxyma，1.5ml)并在氮气鼓泡下偶联2小时。排干溶液并用dmf(1x3ml，30秒)洗涤。重复偶联步骤。加入fmoc-pen(trt)(4.0ml)。加入活化剂1溶液(dic，1.5ml)和活化剂2溶液(oxyma，1.5ml)并在氮气鼓泡下偶联2小时。排干溶液并用dmf(6x3ml，30秒)洗涤。
[0878]
fmoc裂解：
[0879]
通过加入20％哌啶溶液(2x3ml，10min)去除fmoc保护基团。用dmf(6x3ml，30秒)洗涤树脂。
[0880]
偶联：
[0881]
加入fmoc-ile(4.0ml)。加入活化剂1溶液(dic，1.5ml)和活化剂2溶液(oxyma，1.5ml)并在氮气鼓泡下偶联2小时。排干溶液并用dmf(1x3ml，30秒)洗涤。重复偶联步骤。加入fmoc-ile(4.0ml)。加入活化剂1溶液(dic，1.5ml)和活化剂2溶液(oxyma，1.5ml)并在氮气鼓泡下偶联2小时。排干溶液并用dmf(6x3ml，30秒)洗涤。
[0882]
fmoc裂解：
[0883]
通过加入20％哌啶溶液(2x3ml，10min)去除fmoc保护基团。用dmf(6x3ml，30秒)洗涤树脂。
[0884]
偶联：
[0885]
加入fmoc-oic(4.0ml)。加入活化剂1溶液(dic，1.5ml)和活化剂2溶液(oxyma，1.5ml)并使偶联在氮气鼓泡下进行2小时。排干溶液并用dmf(1x3ml，30秒)洗涤。重复偶联步骤。加入fmoc-oic(4.0ml)。加入活化剂1溶液(dic，1.5ml)和活化剂2溶液(oxyma，1.5ml)并使偶联在氮气鼓泡下进行2小时。排干溶液并用dmf(6x3ml，30秒)洗涤。
[0886]
fmoc裂解：
[0887]
通过加入20％哌啶溶液(2x3ml，10min)去除fmoc保护基团。用dmf(6x3ml，30秒)洗涤树脂。
[0888]
偶联：
[0889]
加入fmoc-pro(4.0ml)。加入活化剂1溶液(dic，1.5ml)和活化剂2溶液(oxyma，1.5ml)并使偶联在氮气鼓泡下进行2小时。排干溶液并用dmf(1x3ml，30秒)洗涤。重复偶联步骤。加入fmoc-pro(4.0ml)。加入活化剂1溶液(dic，1.5ml)和活化剂2溶液(oxyma，1.5ml)并使偶联在氮气鼓泡下进行2小时。排干溶液并用dmf(6x3ml，30秒)洗涤。
[0890]
fmoc裂解：
[0891]
通过加入20％哌啶溶液(2x3ml，10分钟)去除fmoc保护基团。用dmf(6x3ml，30秒)洗涤树脂。
[0892]
偶联：
[0893]
加入fmoc-leu(4.0ml)。加入活化剂1溶液(dic，1.5ml)和活化剂2溶液(oxyma，1.5ml)并使偶联在氮气鼓泡下进行2小时。排干溶液并用dmf(1x3ml，30秒)洗涤。重复偶联步骤。加入fmoc-leu(4.0ml)。加入活化剂1溶液(dic，1.5ml)和活化剂2溶液(oxyma，1.5ml)并使偶联在氮气鼓泡下进行2小时。排干溶液并用dmf(6x3ml，30秒)洗涤。
[0894]
fmoc裂解：
[0895]
通过加入20％哌啶溶液(2x3ml，10min)去除fmoc保护基团。用dmf(6x3ml，30秒)洗涤树脂。
[0896]
偶联：
[0897]
加入fmoc-ser(t-bu)(4.0ml)。加入活化剂1溶液(dic，1.5ml)和活化剂2溶液(oxyma，1.5ml)并使偶联在氮气鼓泡下进行2小时。排干溶液并用dmf(1x3ml，30秒)洗涤。重复偶联步骤。加入fmoc-ser(t-bu)(4.0ml)。加入活化剂1溶液(dic，1.5ml)和活化剂2溶液(oxyma，1.5ml)并使偶联在氮气鼓泡下进行2小时。排干溶液并用dmf(6x3ml，30秒)洗涤。
[0898]
fmoc裂解：
[0899]
通过加入20％哌啶溶液(2x3ml，10min)去除fmoc保护基团。用dmf(6x3ml，30秒)洗涤树脂。
[0900]
偶联：
[0901]
加入fmoc-arg(pbf)(4.0ml)。加入活化剂1溶液(dic，1.5ml)和活化剂2溶液(oxyma，1.5ml)并使偶联在氮气鼓泡下进行2小时。排干溶液并用dmf(1x3ml，30秒)洗涤。重复偶联步骤。加入fmoc-arg(pbf)(4.0ml)。加入活化剂1溶液(dic，1.5ml)和活化剂2溶液(oxyma，1.5ml)并使偶联在氮气鼓泡下进行2小时。排干溶液并用dmf(6x3ml，30秒)洗涤。
[0902]
fmoc裂解：
[0903]
通过加入20％哌啶溶液(2x3ml，10min)去除fmoc保护基团。用dmf(6x3ml，30秒)洗涤树脂。
[0904]
偶联：
[0905]
加入fmoc-ser(t-bu)(4.0ml)。加入活化剂1溶液(dic，1.5ml)和活化剂2溶液(oxyma，1.5ml)并使偶联在氮气鼓泡下进行2小时。排干溶液并用dmf(1x3ml，30秒)洗涤。重复偶联步骤。加入fmoc-ser(t-bu)(4.0ml)。加入活化剂1溶液(dic，1.5ml)和活化剂2溶液(oxyma，1.5ml)并使偶联在氮气鼓泡下进行2小时。排干溶液并用dmf(6x3ml，30秒)洗涤。
[0906]
fmoc裂解：
[0907]
通过加入20％哌啶溶液(2x3ml，10min)去除fmoc保护基团。用dmf(6x3ml，30秒)洗涤树脂。
[0908]
偶联：
[0909]
加入fmoc-cys(trt)(4.0ml)。加入活化剂1溶液(dic，1.5ml)和活化剂2溶液(oxyma，1.5ml)并使偶联在氮气鼓泡下进行2小时。排干溶液并用dmf(1x3ml，30秒)洗涤。重复偶联步骤。加入fmoc-cys(trt)(4.0ml)。加入活化剂1溶液(dic，1.5ml)和活化剂2溶液(oxyma，1.5ml)并使偶联在氮气鼓泡下进行2小时。排干溶液并用dmf(6x3ml，30秒)洗涤。
[0910]
fmoc裂解：
[0911]
通过加入20％哌啶溶液(2x3ml，10min)去除fmoc保护基团。用dmf(6x3ml，30秒)洗
涤树脂。
[0912]
偶联：
[0913]
加入fmoc-ile(4.0ml)。加入活化剂1溶液(dic，1.5ml)和活化剂2溶液(oxyma，1.5ml)并使偶联在氮气鼓泡下进行2小时。排干溶液并用dmf(1x3ml，30秒)洗涤。重复偶联步骤。加入fmoc-ile(4.0ml)。加入活化剂1溶液(dic，1.5ml)和活化剂2溶液(oxyma，1.5ml)并使偶联在氮气鼓泡下进行2小时。排干溶液并用dmf(6x3ml，30秒)洗涤。
[0914]
fmoc裂解：
[0915]
通过加入20％哌啶溶液(2x3ml，10min)去除fmoc保护基团。用dmf(6x3ml，30秒)洗涤树脂。
[0916]
自动spps期间的手动偶联：
[0917]
将fmoc-(n-me)g(0.2m的dmf溶液，5当量)加入到树脂中。加入活化剂1溶液(dic，1.5ml)和活化剂2溶液(oxyma，1.5ml)并使偶联在振荡(热混合仪，室温)下进行2小时。过滤溶液并用dmf(1x3ml，30秒)洗涤。重复偶联步骤。加入fmoc-(n-me)g(0.2m的dmf溶液，5当量)。加入活化剂1溶液(dic，1.5ml)和活化剂2溶液(oxyma，1.5ml)并使偶联在振荡(热混合仪，室温)下进行2小时。过滤溶液并用dmf(6x3ml，30秒)洗涤。
[0918]
fmoc裂解：
[0919]
通过加入20％哌啶溶液(2x3ml，10min)去除fmoc保护基团。用dmf(6x3ml，30秒)洗涤树脂。
[0920]
如果序列中存在其他氨基酸，则使用上述步骤将它们偶联。
[0921]
裂解试验：
[0922]
当进行手动偶联时，通常进行裂解试验以监测反应。试验裂解混合物为tfa/edt/茴香硫醚(90∶3∶7)；在室温和750rpm下在热混合仪上振荡1.5小时。通过lc-ms使用上述方法之一进行分析。
[0923]
全裂解：
[0924]
将含有肽的树脂置入注射器中，并将3.0ml裂解缓冲液tfa/edt/茴香硫醚(90∶3∶7)加入到树脂中。混合物在室温下振荡2.5小时。过滤收集溶液，加入冷乙醚(-20℃)沉淀肽。在氮气气氛下，将溶液在falcon管(60ml)中离心(3000rpm)。倾析出乙醚并用冷乙醚反复洗涤固体残余物(5x10ml)。然后干燥固体残余物。
[0925]
二硫环化：
[0926]
将粗肽以1mg/2ml的浓度溶于0.1m碳酸氢铵(ph 7.8-8.2)中。使溶液在与空气连通的圆底烧瓶中在定轨摇床上振荡过夜。然后将该溶液冻干以获得白色粉末。
[0927]
用于hplc纯化的柱筛选：
[0928]
将肽溶于5％ch3cn和95％水中。对每种肽进行柱筛选以确定用于纯化的制备型hplc方法。筛选了以下分析柱。
[0929]
两种方法可用于柱筛选：
[0930]
1)5-60％acn_8min_1ml/min_25℃
[0931]
2)30-85％acn_8min_1ml/min_25℃
[0932]
可用柱(50mm x id 4，6mm)(也可用作制备柱)：
[0933]
1)aeris c18(phenomenex)
[0934]
2)x-bridge c18(waters)
[0935]
3)kinetex c18(coreshell material)(phenomenex)
[0936]
4)ymc triart c18(可用100％水洗脱)
[0937]
5)kinetix biphenyl(phenomenex)
[0938]
6)x-select c18(正电荷)
[0939]
7)jupiter proteo c18(phenomenex)
[0940]
8)luna c18(phenomenex)
[0941]
对于本发明的肽，使用以下5个制备柱之一：
[0942]
1)柱：phenomenex，aeris peptide 5μ xb-c18，axia packed，21，2x250mm+cartridge 5μ
[0943]
2)柱：phenomenex，kinetex c18 5μ 21，5x250mm+cartridge 5μ
[0944]
3)柱：phenomenex，kinetex 5μ biphenyl 100a，axia packed，21，2x250mm+cartridge 5μ
[0945]
4)柱：ymc actus triart prep.c18 12nm，s-10μm 250x20mm+cartridge 3μm(10x4mm)
[0946]
5)柱：waters，xbridge prep.c18 5μ obd 19x250mm+cartridge 10μ。
[0947]
选择了柱后，使用以下方法之一：
[0948]
1)方法：梯度5-60％acn水溶液(0，10％tfa)
[0949]
2)方法：梯度30-85％acn水溶液(0，10％tfa)
[0950]
3)基于柱筛选结果的富集梯度。
[0951]
流速20ml/min
[0952]
通过hplc(5-95在8分钟内，chromolith speedrod&ymc c18 5-95在18分钟内)并使用上述lc-ms方法之一分析合并的级分。
[0953]
对于实施例164，将粗肽溶于ch3cn/水(1∶1)中并在phenomenex kinetex色谱柱c18 5μ，21.5x250mm+5μcartridge上纯化，流速：20ml/min，方法：5-60％acn水溶液(各自含有0.10％tfa)经48分钟。将合并的级分冻干以提供29.8mg(98.3％纯度)实施例164。
[0954]
表7：所用材料及条件说明
[0955][0956]
用于masp肽手动spps的通用方法(方法c)
[0957]
序列aic+srslp-(oic)-i-(pen)+ipn-oh(实施例418)的合成具有代表性。
[0958]
合成肽：
[0959]
该肽使用标准fmoc化学合成。
[0960]
1)制备树脂：向氯三苯甲基树脂(ctc resin)(0.3mmol，0.3g，1.0mmol/g)中加入fmoc-asn(trt)-oh(0.3mmol，0.18g，1.0eq)和diea(0.21ml，1.2mmol，4.0eq)的dcm(6.0ml)溶液。将混合物在20℃下用n2搅拌2小时，然后加入meoh(0.3ml)，并用n2再搅拌30分钟。用dmf(6.0ml x 3)洗涤树脂。然后加入20％哌啶的dmf(6.0ml)溶液并将混合物在20℃下用n2搅拌20分钟。然后将混合物过滤以得到树脂。用dmf(6.0mlx3)洗涤树脂并过滤以得到树脂。
[0961]
2)偶联：将fmoc-pro-oh(0.30g，0.9mmol，3.0eq)、hbtu(0.32g，0.85mmol，2.85eq)和diea(1.80mmol，0.32ml，6.00eq)的dmf(3.0ml)溶液加入树脂中并在20℃下用n2搅拌30分钟。然后用dmf(6.0ml x 5)洗涤树脂。
[0962]
3)脱保护：将20％哌啶的dmf溶液(6.0ml)加入树脂中，并将混合物在20℃下用n2搅拌20分钟。
[0963]
4)对所有其他氨基酸重复步骤2至3：
[0964]
表8：所用材料及条件说明
[0965]
#材料偶联试剂偶联时间1fmoc-asn(trt)-oh(1.0eq)diea(4.0eq)2.0小时2fmoc-pro-oh(3.0eq)hbtu(2.85eq)diea(6.0eq)30分钟3fmoc-ile-oh(3.0eq)hbtu(2.85eq)diea(6.0eq)30分钟4fmoc-pen(trt)-oh(3.0eq)hbtu(2.85eq)diea(6.0eq)30分钟5fmoc-ile-oh(3.0eq)hbtu(2.85eq)diea(6.0eq)30分钟
6fmoc-oic-oh(3.0eq)hbtu(2.85eq)diea(6.0eq)30分钟7fmoc-pro-oh(3.0eq)hbtu(2.85eq)diea(6.0eq)30分钟8fmoc-leu-oh(3.0eq)hbtu(2.85eq)diea(6.0eq)30分钟9fmoc-ser(tbu)-oh(3.0eq)hbtu(2.85eq)diea(6.0eq)30分钟10fmoc-arg(pbf)-oh(3.0eq)hbtu(2.85eq)diea(6.0eq)30分钟11fmoc-ser(tbu)-oh(3.0eq)hbtu(2.85eq)diea(6.0eq)30分钟12fmoc-cys(trt)-oh(3.0eq)hbtu(2.85eq)diea(6.0eq)30分钟13fmoc-ile-oh(3.0eq)hbtu(2.85eq)diea(6.0eq)30分钟14fmoc-ala-oh(3.0eq)hbtu(2.85eq)diea(6.0eq)30分钟
[0966]
将20％哌啶的dmf溶液用于fmoc脱保护30分钟。偶联反应通过茚三酮(除pr0外的所有氨基酸)和氯苯醌测试(pro)进行监测，用dmf(5.0ml)洗涤树脂5次。
[0967]
肽裂解和纯化：
[0968]
1)用甲醇(6.0ml x 5)洗涤树脂并真空干燥以得到0.62g肽树脂。然后在20℃下将6.0ml裂解缓冲液(92.5％tfa/2.5％edt/2.5％tis/2.5％h2o)加入至含有侧链保护的肽树脂的烧瓶中，并将混合物搅拌2.5小时。
[0969]
2)用冷的叔丁基甲基醚(50ml)沉淀肽，并离心(3分钟，3000rpm)，得到固体粗品。用叔丁基甲基醚洗涤粗肽沉淀两次以上(20.0ml x 3)。将粗肽真空干燥2.0小时，得到0.4g粗肽。
[0970]
3)将粗品(0.4g)溶于ch3cn(150ml)和水(150ml)中。在20℃下加入碘(i2)(0.1m的甲醇溶液，1.5ml)直至黄色持续。然后将混合物在20℃下搅拌2分钟。然后滴加硫代硫酸钠(0.1m水溶液，0.05ml)直至黄色消失。将混合物冻干得到粗粉末(0.41g)
[0971]
4)通过制备型-hplc纯化粗肽(条件：a：0.075％tfa水溶液b：ch3cn)并冻干以得到为白色固体和tfa盐的所需肽(实施例418)(108.1mg，23.0％产率，通过方法w1纯度为97.3％；通过方法7纯度为97.4％)。纯化条件：将肽溶于tfa/h2o(7∶3)中；流速20ml/min；60分钟内梯度为12-42％；保留时间＝42分钟；通过luna 25x200mm，c18 10μm，10μm，柱纯化，然后再次通过gemini 150x30mm，c18 5μm，柱纯化，以达到所需的纯度。
[0972]
如果根据该方法制备c-末端酰胺，则合成开始于rink amide mbha树脂(装载量通常约为0.4-0.6mmol/g)，同上述步骤。
[0973]
用于masp肽手动spps的通用方法(方法d)
[0974]
如果制备了c-末端酰胺，合成开始于rink amide mbha树脂(装载量通常约为0.4-0.6mmol/g)。序列pic+srs-((tbu)a)-ppi-(pen)+ipd-nh2(实施例9)的合成是代表性的。
[0975]
如果制备了c-末端酸，合成开始于2-氯三苯甲基树脂，根据方法c中所述的方法加入第一个fmoc氨基酸。
[0976]
合成肽：
[0977]
该肽使用标准fmoc化学合成。
[0978]
1)制备树脂：将在dmf(10.0ml)中的rink amide mbha树脂(0.66g，0.30mmol，装载量＝0.45mmol/g)在20℃下用n2搅拌0.5小时。然后加入20％哌啶的dmf(10ml)溶液并将混合物在20℃下用n2搅拌20分钟。然后过滤混合物以得到树脂。用dmf(10x5ml)洗涤树脂并过
滤以得到树脂。
[0979]
2)偶联：将fmoc-asn(trt)-oh(0.9mmol，0.37g，3.0eq)、hbtu(0.32g，0.85mmol，2.95eq)和diea(1.80mmol，0.32ml，6.00eq)的dmf(3.0ml)溶液加入树脂中，并在20℃用n2搅拌30分钟。然后用dmf(10.0ml x 3)洗涤树脂。
[0980]
3)脱保护：将20％哌啶的dmf(10.0ml)溶液加入树脂中，并将混合物在20℃下用n2搅拌30分钟。
[0981]
4)对所有其他氨基酸重复步骤2至3。
[0982]
表9：所用材料及条件说明
[0983]
#材料偶联试剂偶联时间1fmoc-asn(trt)-oh(1.0eq)hbtu(2.85eq)diea(6.0eq)30分钟2fmoc-pro-oh(3.0eq)hbtu(2.85eq)diea(6.0eq)30分钟3fmoc-ile-oh(3.0eq)hbtu(2.85eq)diea(6.0eq)30分钟4fmoc-pen(trt)-oh(3.0eq)hbtu(2.85eq)diea(6.0eq)30分钟5fmoc-ile-oh(3.0eq)hbtu(2.85eq)diea(6.0eq)30分钟6fmoc-pro-oh(3.0eq)hbtu(2.85eq)diea(6.0eq)30分钟7fmoc-pro-oh(3.0eq)hbtu(2.85eq)diea(6.0eq)30分钟8fmoc-ala(t-bu)-oh(3.0eq)hbtu(2.85eq)diea(6.0eq)30分钟9fmoc-ser(tbu)-oh(3.0eq)hbtu(2.85eq)diea(6.0eq)30分钟10fmoc-arg(pbf)-oh(3.0eq)hbtu(2.85eq)diea(6.0eq)30分钟11fmoc-ser(tbu)-oh(3.0eq)hbtu(2.85eq)diea(6.0eq)30分钟12fmoc-cys(trt)-oh(3.0eq)hbtu(2.85eq)diea(6.0eq)30分钟13fmoc-ile-oh(3.0eq)hbtu(2.85eq)diea(6.0eq)30分钟14fmoc-pro-oh(3.0eq)hbtu(2.85eq)diea(6.0eq)30分钟
[0984]
20％哌啶的dmf溶液用于fmoc脱保护30分钟。偶联反应通过茚三酮(除pro外的所有氨基酸)和氯苯醌测试(pro)监测，用dmf(5.0ml)洗涤树脂5次。
[0985]
肽裂解和纯化：
[0986]
1)用meoh(6.0ml x 5)洗涤树脂并真空干燥，得到0.66g肽树脂。然后在20℃下将6.0ml裂解缓冲液(90％tfa/5％edt/2.5％tis/2.5％h2o)加入至含有侧链保护的肽树脂的烧瓶中，并将混合物搅拌2.5小时。
[0987]
2)用冷叔丁基甲基醚(50ml)沉淀肽并离心(3分钟，3000rpm)，得到固体粗品。用叔丁基甲基醚再洗涤粗肽沉淀3次(20.0ml x 3)。真空干燥粗肽2.0h，得到0.4g粗肽。
[0988]
3)将粗品(0.4g)溶于ch3cn(15ml)和水(15ml)中，使其浓度达到0.1mm。加入nh4hco3溶液(1m)以调节ph至约8-9。使溶液在室温下振荡约8小时。通过hplc监测反应。反应完成后，将反应用乙酸淬灭以调节ph至约6。然后将反应混合物冻干并通过反相hplc纯化所得固体。
[0989]
4)通过制备型hplc纯化粗肽(条件：a：0.075％tfa水溶液b：ch3cn)并冻干，得到为白色固体和tfa盐的所需肽(实施例9)(202.40mg，产率41.4.0％，通过方法w1纯度为93.7％；通过方法7纯度为95.1％)。纯化条件：将肽溶于tfa/h2o(7∶3)中；流速20ml/min；60
分钟内梯度为12-42％；保留时间＝42分钟；在luna 25x200mm，c1810μm，c1810μm，柱上纯化。
[0990]
用于masp肽手动spps的替代通用方法(方法e)
[0991]
序列((2s)-2[(氨基)-2-(四氢-2h-吡喃-4-基)]乙酸)-ic+srslp-(oic)-ic+i-oh的合成(实施例184)为代表性的。
[0992]
肽合成：
[0993]
该肽使用标准fmoc化学合成。
[0994]
下文化学结构中的黑球表示用于固相多肽合成(spps)的固体聚合物载体，例如2-氯三苯甲基树脂、rink酰胺树脂等。
[0995]
实施例1a
[0996]
(2s)-({[(9h-芴-9-基)甲氧基]羰基}氨基)(氧杂-4-基)乙酸(单一立体异构体)
[0997][0998]
将碳酸氢钠(5.01g，59.7mmol)和1-({[(9h-芴-9-基)甲氧基]羰基}氧基)吡咯烷-2，5-二酮(2.11g，6.27mmol)加入至在丙酮/水(15ml/10ml)中的(2s)-氨基(氧杂-4-基)乙酸(950mg，5.97mmol)中。将混合物在室温下搅拌过周末。用水处理悬浮液并用mbte萃取两次以上。用1m盐酸水溶液酸化水相，再用二氯甲烷萃取3次以上。有机相用饱和氯化钠水溶液洗涤，用硫酸镁干燥，过滤并蒸发。通过硅胶色谱法(isolera；50g snap ultra；梯度：环己烷50％/乙酸乙酯50％+1％乙酸至环己烷20％/乙酸乙酯80％+1％乙酸)纯化残余物。合并合适的级分并蒸发。将残余物溶于甲苯并蒸发两次以上，然后将残余物真空干燥，得到1.08g(纯度100％，产率47％)的目标化合物。
[0999]
lc-ms(方法9)：r
t
＝0.90min；ms(esipos)：m/z＝382[m+h]
+
[1000]1h-nmr(400mhz，dmso-d6)δ[ppm]：-0.150(0.43)，-0.008(4.33)，0.008(3.74)，0.146(0.43)，1.280(1.03)，1.300(2.26)，1.309(2.36)，1.331(2.75)，1.341(2.92)，1.371(2.77)，1.401(2.54)，1.411(2.32)，1.430(1.49)，1.464(6.34)，1.496(3.49)，1.932(1.76)，1.942(2.14)，1.951(1.93)，1.960(2.08)，2.327(0.64)，2.366(0.64)，2.670(0.64)，2.710(0.65)，3.169(2.11)，3.212(2.67)，3.237(6.32)，3.265(6.90)，3.704(0.49)，3.715(0.49)，3.840(4.66)，3.854(5.62)，3.867(4.30)，3.879(6.28)，3.899(5.14)，3.918(3.56)，4.201(2.11)，4.218(5.83)，4.237(9.07)，4.263(8.42)，4.274(9.80)，4.293(5.14)，4.318(1.05)，7.309(6.35)，7.328(15.12)，7.347(9.86)，7.400(9.65)，7.419(15.88)，7.437(7.02)，7.652(5.77)，7.674(5.52)，7.735(8.21)，7.740(8.28)，7.754(7.63)，7.883(16.00)，7.902(14.80)，12.609(0.56).
[1001]
实施例2a
[1002][1003]
反应在氩气气氛下进行。向在53ml二氯甲烷中的n-{[(9h-芴-9-基)甲氧基]羰基}-l-异亮氨酸(9.40g，26.6mmol)中加入n，n-二异丙基乙胺(19ml，110mmol)和2-氯三苯甲基氯树脂(10.0g，13.3mmol)。反应混合物在室温下振荡过夜。过滤收集沉淀并用dmf洗涤3次。收集的树脂用二氯甲烷/甲醇1∶1振荡30分钟。过滤收集树脂并用甲醇和二氯甲烷旋转洗涤3次。真空干燥收集的树脂用于下一步。
[1004]
实施例3a
[1005][1006]
将在200ml dmf/哌啶4∶1中的实施例2a(15.2g，6.82mmol)在室温下振荡15分钟。过滤收集树脂并用dmf洗涤3次。重复这两个步骤并用200ml甲醇和200ml二氯甲烷旋转洗涤3次。真空干燥收集的树脂用于下一步。
[1007]
实施例4a
[1008][1009]
将实施例3a(11.4g，5.13mmol)在100ml dmf中在室温下溶胀5分钟。加入在50ml dmf中的n-{[(9h-芴-9-基)甲氧基]羰基}-s-(三苯甲基)-l-半胱氨酸(6.01g，10.3mmol)、dic(1.5ml，10mmol)和oxyma(1.42g，10.0mmol)的混合物，并将反应混合物在室温下振荡2小时。过滤收集树脂并用dmf洗涤3次。偶联步骤重复过夜。过滤收集树脂并用150mldmf洗涤3次，然后用150ml甲醇和150ml二氯甲烷旋转洗涤3次以上。真空干燥收集的树脂用于下一步。
[1010]
实施例5a
[1011][1012]
将在200ml dmf/哌啶4∶1中的实施例4a(18.9g，8.51mmol)在室温下振荡15分钟。过滤收集树脂并用dmf洗涤3次。重复这两个步骤，并将收集的树脂用200ml甲醇和200ml二氯甲烷旋转洗涤3次。真空干燥收集的树脂用于下一步。
[1013]
实施例6a
[1014][1015]
在室温下将实施例5a(16.3g，7.32mmol)在150ml dmf中溶胀5分钟。加入在50ml dmf中的n-{[(9h-芴-9-基)甲氧基]羰基}-l-异亮氨酸(5.18g，14.6mmol)、dic(2.2ml，14mmol)和oxyma(2.03g，加入14.3mmol)的混合物，并将反应混合物在室温下振荡2小时。过滤收集树脂并用dmf洗涤3次。重复偶联步骤过夜。过滤收集树脂并用200ml dmf洗涤3次，然后用200ml甲醇和200ml二氯甲烷旋转洗涤3次以上。真空干燥收集的树脂用于下一步。
[1016]
实施例7a
[1017][1018]
将在200ml dmf/哌啶4∶1中的实施例6a(20.0g，8.98mmol)在室温下振荡15分钟。过滤收集树脂并用dmf洗涤3次。重复这两个步骤，并将收集的树脂用200ml甲醇和200ml二
氯甲烷旋转洗涤3次。真空干燥收集的树脂用于下一步。
[1019]
实施例8a
[1020][1021]
将实施例7a(17.8g，7.99mmol)在150ml dmf中在室温下溶胀5分钟。加入在50ml dmf中的(2s，3as，7as)-1-{[(9h-芴-9-基)甲氧基]羰基}八氢-1h-吲哚-2-羧酸(6.25g，16.0mmol)、dic(2.4ml，16mmol)和oxyma(2.21g，15.6mmol)的混合物，并将该反应混合物在室温下振荡2小时。过滤收集树脂并用dmf洗涤3次。重复偶联步骤过周末。过滤收集树脂并用200ml dmf洗涤3次，然后用200ml甲醇和200ml二氯甲烷旋转洗涤3次以上。真空干燥收集的树脂用于下一步。
[1022]
实施例9a
[1023][1024]
将在200ml dmf/哌啶4∶1中的实施例8a(21.5g，9.68mmol)在室温下振荡30分钟。过滤收集树脂，用dmf洗涤3次，然后用200ml甲醇和200ml二氯甲烷旋转洗涤3次以上。向收集的树脂中加入200ml dmf/哌啶4∶1，并在室温下振荡1小时。过滤收集树脂，用dmf洗涤3次，然后用200ml甲醇和200ml二氯甲烷旋转洗涤3次以上。真空干燥收集的树脂用于下一步。
[1025]
实施例10a
[1026][1027]
将实施例9a(18.1g，8.13mmol)在150ml dmf中在室温下溶胀5分钟。加入在50ml dmf中的1-{[(9h-芴-9-基)甲氧基]羰基}-l-脯氨酸(11.0g，32.5mmol)、dic(4.9ml，32mmol)和oxyma(4.51g，加入31.7mmol)的混合物，并将反应混合物在室温下振荡过周末。过滤收集树脂，用200ml dmf洗涤3次，然后用200ml甲醇和200ml二氯甲烷旋转洗涤3次以上。真空干燥收集的树脂用于下一步。
[1028]
实施例11a
[1029][1030]
将在150ml dmf/哌啶4∶1中的实施例10a(20.4g，9.16mmol)在室温下振荡30分钟。过滤收集树脂并用dmf洗涤3次。重复这两个步骤，并将收集的树脂用200ml甲醇和200ml二氯甲烷旋转洗涤3次。真空干燥收集的树脂用于下一步。
[1031]
实施例12a
[1032][1033]
将实施例11a(18.2g，8.18mmol)在150ml dmf中在室温下溶胀5分钟。加入在50ml dmf中的n-{[(9h-芴-9-基)甲氧基]羰基}-l-亮氨酸(11.6g，32.7mmol)、dic(4.9ml，32mmol)和oxyma(4.53g，31.9mmol)的混合物，并将该反应混合物在室温下振荡过夜。过滤收集树脂，用200ml dmf洗涤3次，然后用200ml甲醇和200ml二氯甲烷旋转洗涤3次以上。真空干燥收集的树脂用于下一步。
[1034]
实施例13a
[1035][1036]
将在150ml dmf/哌啶4∶1中的实施例12a(20.9g，9.42mmol)在室温下振荡30分钟。过滤收集树脂并用dmf洗涤3次。重复这两个步骤，并将收集的树脂用200ml甲醇和200ml二氯甲烷旋转洗涤3次。真空干燥收集的树脂用于下一步。
[1037]
实施例14a
[1038][1039]
将实施例13a(18.0g，8.11mmol)在150ml dmf中在室温下溶胀5分钟。加入在50ml dmf中的o-叔丁基-n-{[(9h-芴-9-基)甲氧基]羰基}-l-丝氨酸(12.4g，32.4mmol)、dic(4.9ml，32mmol)和oxyma(4.49g，31.6mmol)的混合物，并将该反应混合物在室温下振荡过夜。过滤收集树脂，用200ml dmf洗涤3次，然后用200ml甲醇和200ml二氯甲烷旋转洗涤3次以上。真空干燥收集的树脂用于下一步。
[1040]
实施例15a
[1041][1042]
将在200ml dmf/哌啶4∶1中的实施例14a(21.4g，9.64mmol)在室温下振荡30分钟。过滤收集树脂并用dmf洗涤3次。重复这两个步骤，并将收集的树脂用200ml甲醇和200ml二氯甲烷旋转洗涤3次。真空干燥收集的树脂用于下一步。
[1043]
实施例16a
[1044][1045]
将实施例15a(18.9g，8.51mmol)在150ml dmf中在室温下溶胀5分钟。加入在50ml dmf中的n
2-{[(9h-芴-9-基)甲氧基]羰基}-n
5-[n-(2，2，4，6，7-五甲基-2，3-二氢-1-苯并呋喃-5-磺酰基)甲脒基(carbamimidoyl)]-l-鸟氨酸(22.1g，34.0mmod、dic(5.1ml，33mmol)和oxyma(4.72g，33.2mmol)的混合物，并将该反应混合物在室温下振荡过夜。过滤收集树脂，用200ml dmf洗涤3次，然后用200ml甲醇和200ml二氯甲烷旋转洗涤3次以上。真空干燥收集的树脂用于下一步。
[1046]
实施例17a
[1047]
[1048]
将在200ml dmf/哌啶4∶1中的实施例16a(23.8g，10.7mmol)在室温下振荡30分钟。过滤收集树脂并用dmf洗涤3次。重复这两个步骤，并将收集的树脂用200ml甲醇和200ml二氯甲烷旋转洗涤3次。真空干燥收集的树脂用于下一步。
[1049]
实施例18a
[1050][1051]
将实施例17a(22.1g，9.95mmol)在150ml dmf中在室温下溶胀5分钟。加入在50ml dmf中的o-叔丁基-n-{[(9h-芴-9-基)甲氧基]羰基}-l-丝氨酸(15.3g，39.8mmol)、dic(6.0ml，39mmol)和oxyma(5.51g，38.8mmol)的混合物，并将反应混合物在室温下振荡过夜。过滤收集树脂，用200ml dmf洗涤3次，然后用200ml甲醇和200ml二氯甲烷旋转洗涤3次以上。真空干燥收集的树脂用于下一步。
[1052]
实施例19a
[1053][1054]
将在200ml dmf/哌啶4∶1中的实施例18a(24.7g，11.1mmol)在室温下振荡30分钟。过滤收集树脂并用dmf洗涤3次。重复这两个步骤，并将收集的树脂用200ml甲醇和200ml二氯甲烷旋转洗涤3次。真空干燥收集的树脂用于下一步。
[1055]
实施例20a
[1056][1057]
将实施例19a(22.2g，9.99mmol)在150ml dmf中在室温下溶胀5分钟。加入在50ml dmf中的n-{[(9h-芴-9-基)甲氧基]羰基}-s-(三苯甲基)-l-半胱氨酸(23.4g，40.0mmol)、dic(6.0ml，39mmol)和oxyma(5.54g，39.0mmol)的混合物，并将该反应混合物在室温下振荡过夜。过滤收集树脂，用200ml dmf洗涤3次，然后用200ml甲醇和200ml二氯甲烷旋转洗涤3次以上。真空干燥收集的树脂用于下一步。
[1058]
实施例21a
[1059][1060]
将在200ml dmf/哌啶4∶1中的实施例20a(24.5g，11.0mmol)在室温下振荡30分钟。过滤收集树脂并用dmf洗涤3次。重复这两个步骤，并将收集的树脂用200ml甲醇和200ml二氯甲烷旋转洗涤3次。真空干燥收集的树脂用于下一步。
[1061]
实施例22a
[1062][1063]
将实施例21a(22.3g，10.0mmol)在150ml dmf中在室温下溶胀5分钟。加入在50ml dmf中的n-{[(9h-芴-9-基)甲氧基]羰基}-l-异亮氨酸(14.2g，40.1mmol)、dic(6.0ml，39mmol)和oxyma(5.55g，加入39.0mmol)的混合物，并将该反应混合物在室温下振荡过周末。过滤收集树脂，用200ml dmf洗涤3次，然后用200ml甲醇和200ml二氯甲烷旋转洗涤3次以上。真空干燥收集的树脂用于下一步。
[1064]
实施例23a
[1065][1066]
将在7.5ml dmf/哌啶4∶1中的实施例22a(1.00g，250μmol)在室温下振荡30分钟。过滤收集树脂并用dmf洗涤3次。重复这两个步骤，将收集的树脂用甲醇和二氯甲烷旋转洗涤3次。真空干燥收集的树脂用于下一步。
[1067]
实施例24a
[1068][1069]
将实施例23a(1.00g，250μmol)在5ml dmf中在室温下溶胀5分钟。加入在1ml dmf中的(2s)-({[(9h-芴-9-基)甲氧基]羰基}氨基)(氧杂-4-基)乙酸(381mg，1.00mmol)、dic(150μl，980μmol)和oxyma(139mg，975μmol)的混合物，并在室温下振荡反应混合物过周末。过滤收集树脂，用dmf洗涤3次，然后用甲醇和二氯甲烷旋转洗涤3次以上。真空干燥收集的
树脂用于下一步。
[1070]
实施例25a
[1071][1072]
将在7.5ml dmf/哌啶4∶1中的实施例24a(1.00g，250μmol)在室温下振荡30分钟。过滤收集树脂并用dmf洗涤3次。重复这两个步骤，并将收集的树脂用甲醇和二氯甲烷旋转洗涤3次。真空干燥收集的树脂用于下一步。
[1073]
实施例26a
[1074]
(2s，3s)-2-{[(2r)-2-{[(2s，3s)-2-{[(2s，3as，7as)-1-{(2s)-1-[(2s，5s，8s，11s，14r，17s，20s)-20-氨基-17-[(2s)-丁-2-基]-8-(3-甲脒基氨基丙基(carbamimidamidopropyl))-5，11-双(羟基甲基)-2-(2-甲基丙基)-20-(氧杂-4-基)-4，7，10，13，16，19-六氧代-14-(硫烷基甲基)-3，6，9，12，15，18-六氮杂二十烷-1-酰]吡咯烷-2-羰基}八氢-1h-吲哚-2-羰基]氨基}-3-甲基戊酰基]氨基}-3硫烷基丙酰基]氨基}-3-甲基戊酸(单一立体异构体)
[1075][1076]
向实施例25a(1.00g，250μmol)中加入tfa/edt/茴香硫醚(90∶3∶7)的裂解混合物，并将该混合物在室温下振荡2小时。收集滤液，用二氯甲烷洗涤树脂。蒸发合并的滤液。将残余物与乙醚一起搅拌，过滤收集固体。用乙醚洗涤固体数次，真空干燥用于下一步。
[1077]
实施例184
[1078]
((2s)-2[(氨基)-2-(四氢-2h-吡喃-4-基)]乙酸)-ic+srslp-(oic)-ic+i-oh(实施例184)
[1079]
n-[(6s，9s，12s，15s，18r，23r，26s，28as，29as，33as，35as)-18-({n-[(2s)-2-氨基-2-(氧杂-4-基)乙酰基]-l-异亮氨酰基}氨基)-26-[(2s)-丁-2-基]-12-(3-甲脒基氨基丙基)-9，15-双(羟甲基)-6-(2-甲基丙基)-5，8，11，14，17，25，28，35-八氧代三十二烷氢-1h，5h，22h-吡咯并[2
′
，1
′
：13，14][1，2，5，8，11，14，17，20，23，26]二硫八氮杂环二十九烷并[11，10-a]吲哚-23-羰基]-l-异亮氨酸(单一立体异构体)
[1080][1081]
向实施例26a(425mg，304μmol)中加入850ml 0.1m碳酸氢铵水溶液(ph 7.86)。将空气鼓泡通入反应混合物5分钟。将反应混合物在开口烧瓶中在室温下搅拌过夜。将溶剂冻干，得到580mg白色固体。使用如上所述的反相hplc(方法b)进行纯化，得到所需实施例184的三个级分7.4mg(＞99％)、24.5mg(98％)以及15mg(95％)。
[1082]
通用方法f：肽tfa盐转化为hcl盐
[1083]
aic+srs-((tbu)a)-ppi-((n-me)c)+ipd-nh2(hcl盐)(实施例30)的合成为代表性的。
[1084]
自动离子交换站(automatic ion exchange station)步骤：
[1085]
hirschmann公司的蠕动泵(rotarus volume 50)，管子：tygon 2001(内径(id)0.64mm)
[1086]
设置：
[1087]
水洗：运行时间1200s；80min-1
；1个循环(体积为35ml)
[1088]
肽样品循环：运行时间1200s；80min-1
；1个循环(体积为70ml)
[1089]
用h2o(或％acn的水溶液)洗涤：运行时间1200s；80min-1
；1个循环(体积为35ml)
[1090]
使用amberlite ira 410(hcl形式)。将1500mg树脂置入2个滤筒中并用去离子水洗涤(10次)。
[1091]
将溶于3ml 5％acn/h2o溶液中的肽装载到柱上并循环通过柱10次。用水洗涤柱，将溶液收集到falcon管中并冻干
[1092]
获得72.83mg所需肽的hcl盐：lc-ms(＞99％)；离子色谱分析：3.7重量％cl-(1.57eq cl-)，＜1wt％tfa。
[1093]
离子交换过程也可以使用以下方案进行：
[1094]
将amberlite ira 410树脂(hcl形式)(1-2g)置入10ml玻璃-注射器(100mg肽需要1g ira 410树脂)中
[1095]
1)用水洗涤树脂(10次x3ml)
[1096]
2)用5％acn水溶液洗涤树脂(1次x3ml)
[1097]
3)将肽溶于5％acn水溶液中
[1098]
4)将肽加入注射器中，溶液通过柱子循环10-20次。将洗脱液收集到falcon管中。
[1099]
5)用5％acn水溶液洗涤树脂(10次x3ml)；将此溶液加入到falkon管中的溶液中
[1100]
6)将合并的溶液冻干。
[1101]
通用方法fa：肽tfa盐转化为其他盐
[1102]
其他盐形式：
[1103]
通过将所需盐形式(例如乙酸钠)的溶液反复通过柱子，然后用水反复洗涤柱子，可以将氯离子反离子与其他反离子交换。然后装载肽并进行上述程序。因此制备了肽乙酸盐、酒石酸盐、柠檬酸盐和乳酸盐。以下三个实施例具有代表性：
[1104]
实施例249
[1105]
序列：((n-me)g)-ic+srslp-(oic)-i-(pen)+ip-nh2(乙酸盐)(实施例249)
[1106]
n-[(6s，9s，12s，15s，18r，23r，26s，28as，29as，33as，35as)-26-[(2s)-丁-2-基]-12-(3-甲脒基氨基丙基)-9，15-双(羟甲基)-22，22-二.甲基-18-[(n-甲基甘氨酰基-l-异亮氨酰基)氨基]-6-(2-甲基丙基)-5，8，11，14，17，25，28，35-八氧代三十二烷氢-1h，5h，22h-吡咯并[2
′
，1
′
：13，14][1，2，5，8，11，14，17，20，23，26]二硫八氮杂环二十九烷并[11，10-a]吲哚-23-羰基]-l-异亮氨酰基-l-脯氨酰胺，乙酸盐
[1107]
将ira 410氯化树脂(12g)置入空的20ml biotage柱中，并用5％的acn-水溶液洗涤树脂(10次)。柱体连接到自动离子交换站。树脂用20倍柱体积的1m naoh溶液(2x1800s转速80min-1
)洗涤。用水洗涤柱子直到洗脱液的ph为＜ph 9(10倍柱体积)。然后用1m乙酸溶液(10倍柱体积)洗脱该柱，然后用水洗涤直至洗脱液的ph为＞5(约10倍柱体积)。将肽(n-me)gic+srslp-(oic)-i-pen+ip-nh2(tfa盐)(1200mg)于12ml 5％乙腈/水中装载到色谱柱上，并根据通用方法f使其循环通过柱10次。然后用5％乙腈/水溶液洗涤树脂10次，并将洗脱液收集到50ml falcon管中。用于此方法(scale)的参数设置为：
[1108]
水洗：运行时间3085s；80min-1
；1个循环(90ml体积)
[1109]
肽样品循环：运行时间3085s；80min-1
；1个循环(180ml体积)
[1110]
用h2o(或用％acn的水溶液)洗涤：运行时间3085s；80min-1
；1个循环(90ml体积)
[1111]
冻干合并的洗脱液，得到1120mg(纯度100％，产率97％)的目标乙酸盐。
[1112]
离子色谱法(氯化物含量)：＜1％氯化物
[1113]
离子色谱法(tfa含量)：＜1％tfa
[1114]
离子色谱法(乙酸盐含量)：7.1％乙酸盐＝1.84当量
[1115]
lc-ms(mcw-tof-aq-ymc-18分钟)：rt＝7.74分钟；ms(esipos)：m/z＝725[m+2h]
+
[1116]
实施例264
[1117]
序列：((n-me)g)-ic+srslp-(oic)-i-(pen)+ip-nh2(l-酒石酸盐)(实施例264)
[1118]
n-[(6s，9s，12s，15s，18r，23r，26s，28as，29as，33as，35as)-26-[(2s)-丁-2-基]-12-(3-甲脒基氨基丙基)-9，15-双(羟甲基)-22，22-二甲基-18-[(n-甲基甘氨酰基-l-异亮氨酰基)氨基]-6-(2-甲基丙基)-5，8，11，14，17，25，28，35-八氧代三十二烷氢-1h，5h，22h-吡咯并[2
′
，1
′
：13，14][1，2，5，8，11，14，17，20，23，26]二硫八氮杂环二十九烷并[11，10-a]吲哚-23-羰基]-l-异亮氨酰基-l-脯氨酰胺(2r，3r)-2，3-二羟基丁二酸(l-(+)酒石酸)盐
[1119]
将ira 410氯化树脂(12.5g)置入空的20ml biotage柱中，并用5％的acn-水溶液洗涤树脂(10次)。柱体连接到自动离子交换站。用20倍柱体积的1m naoh溶液(2x1800s转速80min-1
)洗涤树脂。用水洗涤柱子直到洗脱液的ph为＜ph 9(10倍柱体积)。然后用1m l-酒石酸溶液(10倍柱体积)洗脱柱子，然后用水洗涤直到洗脱液的ph＞5(约10倍柱体积)。将肽((n-me)g)-ic+srslp-(oic)-i-(pen)+ip-nh2(tfa盐)(1200mg)于12ml 5％乙腈/水中装载到色谱柱上，并根据通用方法f使其循环通过柱10次。然后用5％乙腈/水溶液洗涤树脂10次，并将洗脱液收集到50ml falcon管中。用于此方法的参数设置为：
[1120]
水洗：运行时间3085s；80min-1
；1个循环(90ml体积)
[1121]
肽样品循环：运行时间3085s；80min-1
；1个循环(180ml体积)
[1122]
用h2o(或％acn的水溶液)洗涤：运行时间3085s；80min-1
；1个循环(90ml体积)
[1123]
将合并的洗脱液冻干，得到1170mg(100％纯度，91％产率)的目标l-酒石酸盐。
[1124]
离子色谱法(氯化物含量)：＜1％氯化物
[1125]
离子色谱法(tfa含量)：＜1％tfa
[1126]
离子色谱法(乙酸盐含量)：13.4％乙酸盐＝1.49当量
[1127]
lc-ms(mcw-tof-aq-ymc-18min)：rt＝7.62min；ms(esipos)：m/z＝725[m+2h]
+
[1128]
实施例376
[1129]
序列：((n-me)g)-ic+srslp-(oic)-i-(pen)+ip-nh2(柠檬酸盐)(实施例376)
[1130]
n-[(6s，9s，12s，15s，18r，23r，26s，28as，29as，33as，35as)-26-[(2s)-丁-2-基]-12-(3-甲脒基氨基丙基)-9，15-双(羟甲基)-22，22-二甲基-18-[(n-甲基甘氨酰基-l-异亮氨酰基)氨基]-6-(2-甲基丙基)-5，8，11，14，17，25，28，35-八氧代三十二烷氢-1h，5h，22h-吡咯并[2
′
，1
′
：13，14][1，2，5，8，11，14，17，20，23，26]二硫八氮杂环二十九烷并[11，10-a]吲哚-23-羰基]-l-异亮氨酰基-l-脯氨酰胺，2-羟基丙烷-1，2，3-三羧酸(柠檬酸)盐。
[1131][1132]
将ira 410氯化树脂(26g)置入空的20ml biotage柱中，并用5％的acn-水溶液洗涤树脂(10次)。柱体连接到自动离子交换站。用20倍柱体积的1m naoh溶液(2x1800s转速80min-1
)洗涤树脂。用水洗涤柱子直到洗脱液的ph为ph 9(10倍柱体积)。然后用1m柠檬酸溶液(10倍柱体积)洗脱柱子，然后用水洗涤直到洗脱液的ph＞5(约10倍柱体积)。将肽(n-me)gic+srslp-(oic)-i-pen+ip-nh2(tfa盐)(1200mg)于12ml 5％乙腈/水中装载到柱上，并根据通用方法f使其循环通过柱10次。然后用5％乙腈/水溶液洗涤树脂10次，将洗脱液收集到50ml falcon管中。用于此方法的参数设置为：
[1133]
水洗：运行时间3085s；80min-1
；1个循环(90ml体积)
[1134]
肽样品循环：运行时间3085s；80min-1
；1个循环(180ml体积)
[1135]
用h2o(或％acn的水溶液)洗涤：运行时间3085s；80min-1
；1个循环(90ml体积)
[1136]
冻干合并的洗脱液，得到1370mg(纯度100％，产率97％)的目标l-酒石酸盐。
[1137]
离子色谱法(氯化物含量)：＜1％氯化物
[1138]
离子色谱法(tfa含量)：＜1％tfa
[1139]
离子色谱法(乙酸盐含量)：19.0％乙酸盐＝1.77当量
[1140]
lc-ms(mcw-tof-aq-ymc-18分钟)：rt＝7.6分钟；ms(esipos)：m/z＝725[m+2h]
+
[1141]
本领域技术人员将认识到，尽管离子色谱法的化学计量并不总是化学计量的(例如1∶2或1∶1)，但并未考虑水含量，在少数情况下测量的水含量可以为8-15％。
[1142]
通用方法g：制备无盐形式
[1143]
aic+srslp-(oic)-i-(pen)+ipd-nh2(无盐形式)(实施例27)的制备为代表性的。
[1144]
5克tfa盐(实施例75)通过反相hplc使用乙腈水梯度在70℃纯化，没有酸改性剂。合并所需级分并冻干。得到2.2g无盐形式(实施例27)；lc-ms(纯度＞99％)；离子色谱法(＜1％tfa)
[1145]
通用方法h：大规模合成
[1146]
aic+srs-((tbu)a)-ppi-((n-me)c)+ipd-nh2(实施例48)的合成具有代表性
[1147][1148]
该肽使用标准fmoc化学进行合成。
[1149]
1)将dmf加入到含有mbha树脂(180mmol)的容器中，并使树脂溶胀2小时。
[1150]
2)加入fmoc-rink酰胺接头并混合30秒，然后加入活化缓冲液。使用n2鼓泡约1小时进行混合。
[1151]
3)将溶液从树脂中排出，并用dmf洗涤液(30秒x3次)洗涤树脂。
[1152]
4)加入20％哌啶/dmf溶液，用氮气鼓泡混合30分钟。
[1153]
5)排干溶液并用dmf洗涤树脂(5次)。
[1154]
6)加入fmoc-氨基酸溶液并混合30秒，然后加入活化缓冲液。使用n2鼓泡约1小时进行混合。
[1155]
7)对每个氨基酸偶联重复步骤3至6。
[1156]
表10：所用材料及条件说明
[1157]
[1158][1159]
20％哌啶的dmf溶液用于fmoc脱保护30分钟。偶联反应通过茚三酮试验监测，用dmf洗涤树脂5次。
[1160]
肽裂解和纯化：
[1161]
1)在室温下将裂解缓冲液(92.5％tfa：2.5％edt：2.5％tis：2.5％h2o)加入到含有侧链保护肽的烧瓶中，搅拌混合物2小时。
[1162]
2)肽用冷异丙醚沉淀并离心(在5000rpm下2分钟)。
[1163]
3)肽用异丙醚洗涤两次以上。
[1164]
4)真空干燥粗肽2小时。
[1165]
形成二硫化物
[1166]
向在h2o/i(3l 2∶1)中的粗线性肽(15g，9.92mmol，1.0eq)(20批)溶液中加入nh4hco3(7.84g，99.2mmol，10eq)。将混合物在30℃搅拌16h，通过加入hcl至ph～6淬灭，然后冻干混合物。冻干液通过制备型hplc纯化，得到为白色固体的所需实施例48(41.8g，95.8％，13.3％产率)，总计156.8g。
[1167]
纯化条件
[1168]
设备：shimadzu 10a；将肽溶于dmf/h2o中。流动相：a(h2o(0.075％tfa的水溶液)，b etoh；梯度：10-50％-60分钟。保留时间：47分钟；色谱柱：luna，c18，10μm，100a，25cm x 50mm；流速：80ml/min；波长：220/254nm；烘箱温度：室温。
[1169]
方法i：制备((n-me)a)-ic+srslp-(oic)-i-(pen)+ip-((n-苄基)d)-nh2(实施例462)
[1170]
n-[(6s，9s，12s，15s，18r，23r，26s，28as，29as，33as，35as)-26-[(2s)-丁-2-基]-12-(3-甲脒基氨基丙基)-9，15-双(羟甲基)-22，22-二甲基-18-[(n-甲基-l-丙氨酰基-l-异亮氨酰基)氨基]-6-(2-甲基丙基)-5，8，11，14，17，25，28，35-八氧代三十二烷氢-1h，5h，22h-吡咯并[2
′
，1
′
：13，14][1，2，5，8，11，14，17，20，23，26]二硫代八氮杂环十九酸[11，10-a]吲哚-23-羰基]-l-异亮氨酰基-l-脯氨酰基-n
4-苄基-l-天冬酰胺
[1171][1172]
在rink amide mbha树脂(装载量通常约为0.4-0.6mmol/g)上以0.3mmol规模制备肽。使用方法c中描述的方法将第一个氨基酸fmoc-asp(2-苯基异丙基酯)-oh(cas 200336-86-3)加入树脂中。使用方法c中描述的步骤构建肽序列。序列完成后，使用的1％tfa的dcm溶液去除2-opp保护基团(30分钟)。加入n-苄胺(3当量)、dic(3当量)和oxyma(3当量)并将混合物振荡2小时。将肽裂解，形成二硫键，并根据方法c纯化肽。
[1173]
通用方法j.制备((n-me)g)-ic+srslp-(oic)-i-(pen)+ip-(＊dap)-oh(实施例467)
[1174]
n-[(6s，9s，12s，15s，18r，23r，26s，28as，29as，33as，35as)-26-[(2s)-丁-2-基]-12-(3-甲脒基氨基丙基)-9，15-双(羟甲基)-22，22-二甲基-18-[(n-甲基甘氨酰基-l-异亮氨酰基)氨基]-6-(2-甲基丙基)-5，8，11，14，17，25，28，35-八氧代三十二烷氢-1h，5h，22h-吡咯并[2
′
，1
′
：13，14][1，2，5，8，11，14，17，20，23，26]二硫代八氮杂环二十九烷并[11，10-a]吲哚-23-羰基]-l-异亮氨酰基-n-[(2s)-2-氨基-2-羧乙基]-l-脯氨酰胺。
[1175][1176]
根据方法c在2-氯三苯甲基树脂上制备肽。根据方法c将boc-dap(fmoc)-oh(cas 122235-70-5)加至树脂上。根据方法c构建和纯化肽。
[1177]
通用方法k.制备(2-(吗啉)乙酰基)-ic+srs-((tbu)a)-ppi-(pen)+ipd-nh2(实施例283)
[1178]
实施例27a
[1179]
n-(溴乙酰基)-l-异亮氨酰基-l-半胱氨酰基-l-丝氨酰基-l-精氨酰基-l-丝氨酰基-4-甲基-l-亮氨酰基-l-脯氨酰基-l-脯氨酰基-l-异亮氨酰基-3-硫烷基-l-缬氨酰基-l-异亮氨酰基-l-脯氨酰基-l-α-天冬酰胺
[1180][1181]
根据方法a在rinkamide chemmatrix树脂上以0.1mmol规模制备序列ic+srs-((tbu)a)-ppi-(pen)+ipd-nh212次。向包含树脂的肽中加入n，n
′‑
二异丙基碳二亚胺(31μl，200μmol)、乙基(羟基亚氨基)氰基乙酸酯(28.4mg，200μmol)和溴乙酸(14μl，200μmol)，并将混合物在5ml dmf中在热混合振荡器上在室温下振荡过夜。过滤树脂，用dmf(6x5ml)洗涤，用dcm(6x5ml)洗涤，然后真空干燥用于下一步。
[1182]
实施例283
[1183]
n-[(5as，11s，14s，17s，20s，23r，28r，31s，33as)-31-[(2s)-丁-2-基]-17-(3-甲脒基氨基丙基)-11-(2，2-二甲基丙基)-14，20-双(羟甲基)-27，27-二甲基-23-({n-[(吗啉-4-基)乙酰基]-l-异亮氨酰基}氨基)-5，10，13，16，19，22，30，33-八氧代二十八烷氢-1h，5h，10h-二吡咯并[2，1-j：2
′
，1
′‑
m][l，2，5，8，11，14，17，20，23，26]二硫八氮杂环二十九烷-28-羰基]-l-异亮氨酰基-l-脯氨酰基-l-α-天冬酰胺
[1184][1185]
向nmp(10ml)中的实施例27a(200mg，纯度74％，77.7μmol)中加入吗啉(34μl，390μmol)并将悬浮液在热混合器中在37℃下振荡。通过过滤收集固体树脂，用10ml dmf和10ml二氯甲烷各洗涤两次。将残余物用tfa/edt/硫代乙醇(thionaisol)(90∶3∶7)处理并在室温下振荡2小时。反应混合物用冷乙醚(-10℃)处理，然后将悬浮液在氮气下离心并用冷乙醚洗涤3次(3x30ml)。向残余物中加入0.1m碳酸氢铵水溶液(400ml)，并将反应混合物在与空气连通的圆底烧瓶中振荡过夜。将溶液冻干并根据方法a纯化冻干粉末，以提供20.4mg(纯度98％，产率16％)的实施例283。
[1186]
实施例300将(2-羟基乙酰基)-ic+srs-((tbu)a)-ppi-(pen)+ipd-nh2作为副产物分离。
[1187]
通用方法l.制备钠盐和胆碱盐形式
[1188]
这些盐是由无盐形式的肽而制备的。下文的两个实施例代表通用方法：
[1189]
实施例431
[1190]
n-[(6s，9s，12s，15s，18r，23r，26s，28as，29as，33as，35as)-18-[(l-丙氨酰基-l-异亮氨酰基)氨基]-26-[(2s)-丁-2-基]-12-(3-甲脒基氨基丙基)-9，15-双(羟甲基)-22，22-二甲基-6-(2-甲基丙基)-5，8，11，14，17，25，28，35-八氧代三十二烷氢-1h，5h，22h-吡咯并[2
′
，1
′
：13，14][1，2，5，8，11，14，17，20，23，26]二硫八氮杂环二十九烷并[11，10-a]吲哚-23-羰基]-l-异亮氨酰基-n-[(1s)-1，2-二羧基乙基]-l-脯氨酰胺，钠盐
[1191][1192]
序列：aic+srslp-(oic)-i-(pen)+ipd-oh(钠盐)(实施例431)
[1193]
向aic+srslp-(oic)-i-(pen)+ipd-oh(无盐形式)(100mg)于20ml乙腈/水1∶1中的溶液中加入1.3ml的0.1m氢氧化钠溶液。真空干燥混合物，得到109mg(产率104％，纯度99％)目标化合物。
[1194]
lc-ms(mcw-tof-aq-ymc-18分钟)：rt＝8.62分钟；ms(esipos)：m/z＝783[m+2h]2+
[1195]
离子色谱法(钠含量)：2.9％钠＝2.03当量
[1196]
实施例432
[1197]
n-[(6s，9s，12s，15s，18r，23r，26s，28as，29as，33as，35as)-18-[(l-丙氨酰基-l-异亮氨酰基)氨基]-26-[(2s)-丁-2-基]-12-(3-甲脒基氨基丙基)-9，15-双(羟甲基)-22，22-二甲基-6-(2-甲基丙基)-5，8，11，14，17，25，28，35-八氧代三十二烷氢-1h，5h，22h-吡咯并[2
′
，1
′
：13，14][1，2，5，8，11，14，17，20，23，26]二硫八氮杂环二十九烷并[11，10-a]吲哚-23-羰基]-l-异亮氨酰基-n-[(1s)-1，2-二羧酸乙基]-l-脯氨酰胺，2-羟基-n，n，n-三甲基乙烷-1-铵)(胆碱)盐
[1198][1199]
向aic+srslp-(oic)-i-(pen)+ipd-oh(无盐形式)(100mg)于20ml乙腈/水1∶1中的溶液中加入511μl的0.25m氢氧化胆碱溶液。真空干燥混合物，得到122mg(产率105％，纯度99％)目标化合物。
[1200]
lc-ms(mcw-tof-aq-ymc-18min)：rt＝8.65分钟；ms(esipos)：m/z＝783[m+2h]2+
[1201]
离子色谱法(胆碱含量)：11.7％胆碱＝1.97当量
[1202]
实施例13
[1203]
aic+srslp-(oic)-i-(pen)+ipd-oh(实施例13)
[1204]
(3s)-4-氨基-3-({(2s)-1-[(2s，3s)-2-{[(2r)-2-{[(2s，3s)-2-{[(2s，3as，7as)-1-{(2s)-1-[(2s，5s，8s，11s，14r，17s，20s)-20-氨基-17-[(2s)-丁-2-基]-8-(3-甲脒基氨基丙基)-5，11-双(羟基甲基)-2-(2-甲基丙基)-4，7，10，13，16，19-六氧杂-14-(硫烷基甲基)-3，6，9，12，15，18-六氮杂二十一烷-1-酰基]吡咯烷-2-羰基}八氢-1h-吲哚-2-羰基]氨基}-3-甲基戊酰基]氨基}-3-甲基-3硫烷基丁酰基]氨基}-3-甲基戊酰基]吡咯烷-2-羰基}氨基)-4-氧代丁酸
[1205][1206]
合成多肽
[1207]
肽使用标准fmoc化学合成。
[1208]
1)制备树脂：向ctc树脂(15.0mmol，15.0g，1.0mmol/g)中加入fmoc-asp(otbu)-oh(15.0mmol，6.17g，1.0eq)和diea(10.4ml，60.0mmol，4.0eq)于dcm(300ml)中。将混合物在20℃下用n2搅拌2小时。然后加入甲醇(15.0ml)并将树脂用n2再搅拌30分钟。用dmf(300ml x 3)洗涤树脂。然后加入20％哌啶的dmf(300ml)溶液，将混合物在20℃下用n2搅拌20分钟。然后将混合物过滤以得到树脂。用dmf(300ml x3)洗涤树脂并过滤以得到树脂。
[1209]
2)偶联：将fmoc-pro-oh(15.2g，45.0mmol，3.0eq)、hbtu(16.2g，42.8mmol，2.85eq)和diea(90.0mmol，15.6ml，6.00eq)于dmf(100ml)中加入至树脂中，并在20℃下用n2将树脂搅拌30分钟。然后用dmf(300ml x5)洗涤树脂。
[1210]
3)脱保护：将20％哌啶的dmf溶液(300ml)加入树脂中，在20℃下用n2搅拌20分钟。
[1211]
4)对所有其他氨基酸重复步骤2和3：
[1212]
表11：用于实施例13的试剂
[1213][1214][1215]
20％哌啶的dmf溶液用于fmoc脱保护30分钟。偶联反应通过茚三酮(除pro外的所有氨基酸)和氯醌测试(pro)监测，用dmf(300ml)洗涤树脂5次。
[1216]
hbtu、diea供应商：苏州昊帆生物股份有限公司(suzhou highfine biotech co.，ltd)
[1217]
肽裂解和纯化
[1218]
5)用甲醇(300ml x 5)洗涤树脂并真空干燥，得到41.5g肽树脂。然后在20℃下将400ml裂解缓冲液(92.5％tfa/2.5％3-巯基丙酸/2.5％tis/2.5％h2o)加入到含有侧链保护的肽树脂的烧瓶中，将混合物搅拌2.5h，然后过滤。
[1219]
6)将肽用冷叔丁基甲基醚(4000ml)沉淀并离心(3000rpm 3min)得到粗固体肽。将粗肽沉淀用叔丁基甲基醚洗涤3次以上(1000ml x 3)。然后将粗肽真空干燥2.0小时，得到21.8g粗肽。
[1220]
7)将粗肽(21.8g)溶于ch3cn(6.5l)和水(6.5l)中。在20℃下加入i2(0.1m于meoh中，55ml)直到黄色持续存在。然后将混合物在20℃下搅拌2分钟。然后滴加硫代硫酸钠溶液
(0.1m水溶液，15ml)直至黄色消失。然后将混合物冻干以得到粗粉末(22.7g)。
[1221]
8)通过制备型hplc纯化粗肽(条件：a：0.075％tfa水溶液b：ch3cn)，收集含有产物的级分，冻干得到目标肽(序列id 13)；(4305.1mg，产率18.3％，99.1％通过c18 rp-hplc柱(gemini c18 5μm150x4.6mm)；97.8％通过c18 rp-hplc柱(discovery bio 5m5m150x4.6mm)，tfa盐)，为白色固体。
[1222]
表12：纯化条件
[1223][1224][1225]
lc-ms：rt＝1.369分钟；1564[m+2h]+
[1226]
rt＝8.72min(纯度99.1％)gemini c18 5μm150x4.6mm
[1227]
rt＝9.42min(97.8％)discovery bio wide porei c185μm150x4.6mm
[1228]
可以使用通用方法f从实施例13(tfa盐)制备实施例29(hcl盐)；实施例5(无盐形式)可以使用通用方法g制备。来自实施例5的实施例431(钠盐)和实施例432(胆碱盐)的制备分别如下文的实施例431和实施例432所示。
[1229]
实施例237
[1230]
aic+srsl-(l-脱氢脯氨酸)-(oic)-i-(pen)+ipd-oh(实施例237)
[1231]
n-[(6s，9s，12s，15s，18r，23r，26s，28as，35as)-18-[(l-丙氨酰基-l-异亮氨酰基)氨基]-26-[(2s)-丁烷-2-基]-12-(3-甲脒基氨基丙基)-9，15-双(羟基甲基)-22，22-二甲基-6-(2-甲基丙基)-5，8，11，14，17，25，28，35-八氧杂-6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，23，24，25，26，27，28，28a，29，29a，30，31，32，33，33a，35，35a-三十烷氢-3h，5h，22h-吡咯[2
′
，1
′
：13，14][1，2，5，8，11，14，17，20，23，26]二硫八氮杂环二十九烷并[11，10-a]吲哚-23-羰基]-l-异亮氨酰基-l-脯氨酰基-l-天冬氨酸
((oic)-i-(pen)+ipd-oh)处验证氘原子的位置。
[1240]
实施例28a
[1241]
(2s，3as，6as)-八氢环戊二烯并[b]吡咯-2-羧酸-氯化氢(1/1)(单一立体异构体)
[1242][1243]
反应在氩气气氛下进行。向钯碳(200mg，10％)中加入20ml甲醇和苄基(2s，3as，6as)-八氢环戊二烯并[b]吡咯-2-羧酸酯-氯化氢(1/1)(1.00g，3.55mmol)。向反应瓶中加入氢气(1atm)并将反应混合物在氢气气氛下在室温下搅拌过夜。反应混合物经硅藻土过滤，用甲醇洗涤滤饼。蒸发滤液并真空干燥，得到698mg目标化合物。
[1244]
(2s，3as，6as)-八氢环戊二烯并[b]吡咯-2-羧酸也可以无盐形式商购获得。
[1245]
实施例29a
[1246]
(2s，3as，6as)-1-{[(9h-芴-9-基)甲氧基]羰基}八氢环戊二烯并[b]吡咯-2-羧酸(单一立体异构体)
[1247][1248]
向在12ml水中的(2s，3as，6as)-八氢环戊二烯并[b]吡咯-2-羧酸-氯化氢(1/1)(680mg，3.55mmol)中加入碳酸氢钠(2.98g，35.5mmol)和1-({[(9h-芴-9-基)甲氧基]羰基}氧基)吡咯烷-2，5-二酮(fmoc-osu)(1.26g，3.73mmol)于18ml丙酮中的溶液。反应混合物在室温下搅拌过夜。反应混合物用水处理，用1m盐酸酸化并用乙酸乙酯萃取两次。有机相用饱和氯化钠水溶液洗涤，用硫酸镁干燥，过滤然后蒸发。残余物通过硅胶色谱法(biotage isolera，柱：50g snap ultra；洗脱液∶二氯甲烷/甲醇100∶2-100∶5)分离。合并合适的级分，蒸发并真空干燥，得到1.27g(纯度99％，产率94％)目标化合物。
[1249]
lc-ms(方法10)：rt＝2.08min；ms(esi pos)：m/z＝378[m+h]+
[1250]1h-nmr(400mhz，dmso-d6)δ[ppm]：1.260(1.76)，1.274(1.85)，1.299(1.78)，1.321(2.09)，1.335(2.38)，1.440(0.92)，1.455(1.10)，1.473(0.87)，1.521(3.61)，1.537(3.86)，1.551(2.28)，1.607(4.53)，1.620(3.68)，1.640(3.08)，1.653(1.66)，1.712(2.02)，1.781(1.38)，1.816(2.30)，1.827(2.26)，1.839(2.37)，1.855(1.68)，2.073(1.20)，2.305(0.83)，2.328(1.99)，2.351(1.35)，2.360(1.64)，2.384(0.92)，2.468(0.60)，2.606(1.50)，2.670(1.11)，3.860(0.94)，3.874(1.94)，3.893(1.95)，3.907(0.92)，4.143(2.61)，4.156(3.68)，4.167(5.16)，4.186(5.89)，4.266(1.43)，4.280
(3.20)，4.294(2.11)，4.345(1.31)，4.371(3.19)，4.386(3.83)，4.396(4.39)，4.411(3.74)，4.422(2.40)，4.437(0.98)，7.292(0.97)，7.311(3.89)，7.329(6.99)，7.346(6.08)，7.363(2.49)，7.395(9.91)，7.414(16.00)，7.432(6.98)，7.663(9.73)，7.680(6.46)，7.879(12.31)，7.897(11.49)，12.586(0.80)。
[1251]
实施例30a
[1252]
(1r，3s，5r)-2-氮杂双环[3.1.0]己烷-3-羧酸(单一立体异构体)
[1253][1254]
将(1r，3s，5r)-2-(叔丁氧基羰基)-2-氮杂双环[3.1.0]己烷-3-羧酸(cas rn：197142-34-0，500mg)溶于4m hcl-二噁烷溶液(3ml)中并在室温下搅拌8h。蒸发溶剂，并将粗产物直接用于下一步。
[1255]
实施例31a
[1256]
(1r，3s，5r)-2-{[(9h-芴-9-基)甲氧基]羰基}-2-氮杂双环[3.1.0]己烷-3-羧酸(单一立体异构体)
[1257][1258]
向在3ml水中的(1r，3s，5r)-2-氮杂双环[3.1.0]己烷-3-羧酸(实施例30a，280mg，2.20mmol)溶液中加入碳酸氢钠(1.85g，22.0mmol)和在4.5ml丙酮中的1-({[(9h-芴-9-基)甲氧基]羰基}氧基)吡咯烷-2，5-二酮(0.78g，2.31mmol)溶液。将反应混合物在室温下搅拌过夜。用水处理反应混合物并用乙酸乙酯萃取两次。有机相用饱和氯化钠水溶液洗涤，用硫酸镁干燥，过滤然后浓缩。粗产物通过制备型反相hplc(色谱柱：reprosil；c18；10μm；125x30mm；洗脱液a：can，洗脱液b：含0.1％甲酸的水)纯化，合并含有产物的级分并冻干得到88.0mg(纯度96％，产率11％)目标化合物。
[1259]
lc-ms(方法11)：rt＝1.32min；ms(esi pos)：m/z＝372[m+na]+
[1260]1h-nmr(400mhz，dmso-d6)δ[ppm]：-0.149(1.15)，-0.008(10.73)，0.008(9.13)，0.146(1.21)，0.468(1.54)，0.534(3.66)，0.803(4.38)，1.682(2.68)，2.072(0.75)，2.128(2.19)，2.142(2.32)，2.223(1.05)，2.293(2.19)，2.327(4.45)，2.349(2.68)，2.366(2.75)，2.523(3.89)，2.670(1.44)，2.710(1.31)，2.816(0.82)，3.413(3.93)，3.757(1.83)，4.010(2.91)，4.140(2.39)，4.211(3.11)，4.285(12.30)，6.929(0.43)，6.950(0.43)，7.340(9.91)，7.358(6.02)，7.406(10.08)，7.425(16.00)，7.443(7.10)，7.650(2.85)，7.702(4.52)，7.724(5.53)，7.746(3.40)，7.892(12.40)，7.910(9.85)，12.680(0.65)。
[1261]
该氨基酸用于fmoc spps。该fmoc氨基酸也可商购获得。
[1262]
实施例32a
[1263]
(2r，4r)-4-[(2s)-丁-2-基]-2-叔丁基-5-氧代-1，3-噁唑烷-3-羧酸苄酯(单一立体异构体)
[1264]
向d-异亮氨酸(8.06g，61.4mmol)于120ml乙醇中的悬浮液中加入由2.45g氢氧化钠于11ml水中制成的氢氧化钠溶液。将反应混合物在室温下搅拌90min，然后蒸发。残余物用195ml戊烷处理，然后加入2，2-二甲基丙醛(10ml，92mmol)。将反应混合物用连接至圆底烧瓶的dean-stark分水器(trap)在45℃下搅拌24h。冷却后，蒸发溶剂，残余物用甲苯(共沸蒸馏)干燥数次。残余物用165ml二氯甲烷处理并冷却至0℃。加入氯甲酸苄酯(benzyl carbonochloridate)(13ml，92mmol)并将反应混合物在0-4℃下搅拌一周。向反应混合物中加入4-二甲基氨基吡啶(375mg，3.1mmol)和65ml水，使反应混合物达到室温，然后在室温下搅拌过夜。反应混合物用乙酸乙酯处理数次并萃取。合并的有机相用10％柠檬酸水溶液洗涤两次，然后用饱和碳酸氢钠水溶液洗涤两次。水相用乙酸乙酯反萃取。合并的有机相用饱和氯化钠水溶液洗涤，用硫酸镁干燥，过滤，然后蒸发。通过硅胶色谱法(isolera；洗脱液∶环己烷/乙酸乙酯100∶3-100∶7)纯化残余物。合并含有产物的级分，蒸发然后真空干燥，得到8.71g目标化合物。
[1265]
实施例33a
[1266]
(2r，4r)-4-[(2s)-丁-2-基]-2-叔丁基-4-甲基-5-氧代-1，3-噁唑烷-3-羧酸苄酯(单一立体异构体)
[1267][1268]
反应在氩气气氛下进行。将在100ml干燥thf中的(2r，4r)-4-[(2s)-丁-2-基]-2-叔丁基-5-氧代-1，3-噁唑烷-3-羧酸苄酯(实施例32a，8.12g，24.4mmol)冷却至-78℃。滴加六甲基二硅叠氮钾(44ml，29mmol)并将反应混合物在-78℃下搅拌2h。将碘甲烷(2.3ml，37mmol)滴加入反应混合物中并将反应混合物在室温下搅拌2.5h。将饱和氯化铵水溶液(20ml)加入到反应混合物中，使反应混合物达到室温，然后将产物萃取到乙酸乙酯中。合并的有机相用饱和碳酸氢钠水溶液洗涤，用硫酸镁干燥，过滤然后浓缩。残余物通过硅胶色谱(isolera，柱：100g snap ultra；洗脱液∶环己烷/乙酸乙酯100∶3-100∶7)纯化。合并含有产物的级分，蒸发，然后真空干燥，得到3.2g目标化合物。
[1269]
实施例34a
[1270]
n-[(苄氧基)羰基]-2-甲基-d-别异亮氨酸(单一立体异构体)
[1271][1272]
向在甲醇(40ml)中的(2r，4r)-4-[(2s)-丁-2-基]-2-叔丁基-4-甲基-5-氧代-1，3-噁唑烷-3-羧酸苄酯(33a，3.20g，9.21mmol)的溶液中加入1m氢氧化钠溶液(40ml)。将反应混合物回流搅拌2h。冷却后，蒸发甲醇。用10％柠檬酸溶液处理残余物，将产物萃取到乙酸乙酯中。水相用乙酸乙酯再萃取两次。用饱和氯化钠水溶液洗涤合并的有机相，用硫酸镁干燥，过滤，蒸发，然后真空干燥，得到2.77g目标化合物。
[1273]
实施例35a
[1274]
2-甲基-d-别异亮氨酸(单一立体异构体)
[1275][1276]
反应在氩气气氛下进行。向190ml甲醇中的n-[(苄氧基)羰基]-2-甲基-d-异亮氨酸(实施例34a，2.57g，9.20mmol)中加入钯碳(390mg，10％)。将反应混合物在室温和常压下在氢气氛下搅拌4小时。反应混合物经硅藻土过滤并浓缩滤液，然后真空干燥，得到1.32g(产率98％)目标化合物。
[1277]
实施例36a
[1278]
n-{[(9h-芴-9-基)甲氧基]羰基}-2-甲基-d-别异亮氨酸(单一立体异构体)
[1279][1280]
向2-甲基-d-异亮氨酸(实施例35a，1.32g，9.09mmol)于水(20ml)和丙酮(29ml)的混合物中的溶液中加入碳酸氢钠(7.64g，90.9mmol)，然后加入1-({[(9h-芴-9-基)甲氧基]羰基}氧基)吡咯烷-2，5-二酮(3.22g，9.55mmol)于丙酮(20ml)中的溶液。将反应混合物在室温下搅拌过夜。反应混合物用mtbe处理并萃取。水相用浓盐酸(ph 1)酸化，并用乙酸乙酯再萃取3次。合并的有机相用硫酸镁干燥，过滤并蒸发。残余物通过硅胶色谱法(isolera，柱：50g snap ultra；洗脱液∶二氯甲烷/甲醇100∶3-100∶5)分离。合并合适的级分，蒸发，然后真空干燥。
[1281]
随后用5％碳酸氢钠溶液处理mtbe相并用乙酸乙酯(600ml)萃取。水相用浓盐酸
(ph1)酸化，每次用乙酸乙酯萃取。合并的有机相用硫酸镁干燥，过滤，蒸发，然后真空干燥。合并的粗产物产量为2.53g。
[1282]
残余物通过硅胶色谱(isolera，柱：50g snap ultra；洗脱液∶二氯甲烷/甲醇97∶3-97∶5)纯化。合并含有产物的级分，蒸发，然后真空干燥，得到967.4mg目标化合物。将产物进一步溶于水/乙腈中并在使用前冻干。
[1283]
lc-ms(方法10)：rt＝2.10min；ms(esi pos)：m/z＝368.1857[m+h]+
[1284]
该氨基酸用于fmoc spps。
[1285]
实施例37a
[1286]
(6s)-1，1-二氟-5-氮杂螺[2.4]庚烷-6-羧酸(立体异构体的混合物)
[1287][1288]
向在85ml二氯甲烷中的(6s)-5-(叔丁氧基羰基)-1，1-二氟-5-氮杂螺[2.4]庚烷-6-羧酸(omega，cas 1357482-03-1)(2.50g，9.02mmol)中加入三氟乙酸(15ml，250mmol)。将反应混合物在室温下搅拌2h。将反应混合物浓缩并真空干燥用于下一步。
[1289]
实施例38a
[1290]
(6s)-5-{[(9h-芴-9-基)甲氧基]羰基}-1，1-二氟-5-氮杂螺[2.4]庚烷-6-羧酸(立体异构体的混合物)
[1291][1292]
向在水(13ml)中的(6s)-1，1-二氟-5-氮杂螺[2.4]庚烷-6-羧酸(立体异构体的混合物)(实施例37a，1.60g，9.03mmol)的溶液中加入碳酸氢钠(7.59g，90.3mmol)，然后加入1-({[(9h-芴-9-基)甲氧基]羰基}氧基)吡咯烷-2，5-二酮(3.20g，9.48mmol)于丙酮(20ml)中的溶液。反应混合物在室温下搅拌过夜。反应混合物用水处理并用mtbe萃取两次。水相用盐酸酸化至ph 3，用二氯甲烷萃取3次。有机相用饱和氯化钠水溶液洗涤，用硫酸镁干燥，过滤，蒸发并真空干燥，得到3.31g(产率92％)目标化合物。
[1293]
lc-ms(方法10)：rt＝1.99min；ms(esi pos)：m/z＝400[m+h]+
[1294]1h-nmr(400mhz，dmso-d6)δ[ppm]：1.106(16.00)，1.589(0.92)，1.605(1.39)，1.619(1.06)，1.627(1.11)，1.655(0.62)，1.682(1.25)，1.703(1.21)，1.916(0.49)，1.949(0.86)，1.978(0.91)，2.012(0.85)，2.042(0.52)，2.086(11.35)，2.558(0.83)，2.568(0.67)，2.591(0.67)，2.645(0.52)，2.670(0.56)，3.077(5.29)，3.442(0.43)，3.452
(0.50)，3.471(1.17)，3.479(1.13)，3.500(1.39)，3.527(0.51)，3.562(1.21)，3.627(1.20)，3.652(1.65)，3.677(0.78)，4.186(1.02)，4.200(2.72)，4.223(2.09)，4.238(2.18)，4.257(1.63)，4.279(2.63)，4.294(2.46)，4.306(1.36)，4.322(1.56)，4.348(2.13)，4.359(1.17)，4.372(1.33)，4.382(0.84)，4.477(0.57)，4.499(0.61)，4.510(0.69)，4.518(0.72)，4.533(0.73)，4.541(0.64)，5.754(0.94)，7.300(0.77)，7.316(3.26)，7.334(5.65)，7.353(3.32)，7.406(4.71)，7.425(7.78)，7.443(3.45)，7.640(4.69)，7.659(4.35)，7.683(0.73)，7.884(5.08)，7.903(4.79)。
[1295]
实施例39a
[1296]
(6s)-5-{[(9h-芴-9-基)甲氧基]羰基}-1，1-二氟-5-氮杂螺[2.4]庚烷-6-羧酸(对映异构体1)和(对映异构体2)
[1297][1298]
使用thar超临界流体色谱prep 200仪器使用chiralpcel ad-h(sfc)5μm，250x30mm柱分离非对映异构体混合物；洗脱液∶co2/异丙醇(83∶17)；压力：135bar；洗脱液温度：38℃；zyklon温度：40℃；zyklon压力：24bar；流速：100g/min；检测：uv 210am；进样量0.4ml/进样；在通常操作条件下，1g/min的co2约相当于1ml/min。
[1299]
序列设置：循环时间＝11.2min
[1300]
在5.85min和8.0min之间收集级分1(对映异构体1)
[1301]
在8.4min和10.25min之间收集级分2(对映异构体2)
[1302]
将级分浓缩。
[1303]
使用分析型sfc-ms(安捷伦，柱：chiralpak ad-33μm 100x4.6mm，洗脱液∶co2/异丙醇(85∶15)；bpr压力：130bar；bpr温度：60℃；柱温：40℃；流速：3ml/min；uv 210nm)分析级分。
[1304]
级分1(rt＝2.081min)被指定为加入“(对映异构体1)”。
[1305]
级分2(rt＝2.838min)被指定为加入“(对映异构体2)”。
[1306]
未指定两种对映异构体的立体化学。
[1307]
实施例40a
[1308]
(3r＊，6s)-5-{[(9h-芴-9-基)甲氧基]羰基}-1，1-二氟-5-氮杂螺[2.4]庚烷-6-羧酸(单一对映异构体，对映异构体1，未定义3位处的立体化学)
[1309][1310]
从手性sfc制备纯化得到2,015g目标化合物，100％ee
[1311]
lc-ms(方法10)：rt＝1.99min；ms(esi pos)：m/z＝400[m+h]+
[1312]1h-nmr(400mhz，dmso-d6)δ[ppm]：-0.008(0.70)，0.008(0.74)，1.032(15.85)，1.047(16.00)，1.285(1.59)，1.568(0.69)，1.589(1.52)，1.617(1.57)，1.635(0.96)，1.656(0.63)，1.686(1.36)，1.702(1.37)，1.941(0.90)，1.974(1.05)，2.008(0.87)，2.041(0.90)，2.073(1.11)，2.557(1.08)，2.566(0.95)，2.591(0.80)，2.645(0.71)，2.670(0.95)，2.701(0.65)，3.451(0.87)，3.468(1.64)，3.479(1.88)，3.495(1.12)，3.505(1.17)，3.626(2.11)，3.651(2.91)，3.677(1.38)，3.770(0.41)，3.778(0.42)，4.169(0.43)，4.186(1.17)，4.200(3.11)，4.221(2.05)，4.238(1.40)，4.256(1.57)，4.279(3.79)，4.293(3.74)，4.304(1.62)，4.322(2.70)，4.336(1.12)，4.348(2.93)，4.358(1.92)，4.371(1.64)，4.381(1.52)，4.509(1.14)，4.517(1.25)，4.531(1.28)，4.540(1.12)，7.300(0.91)，7.315(3.87)，7.334(7.04)，7.350(3.82)，7.352(4.21)，7.406(5.88)，7.424(9.76)，7.443(4.35)，7.640(7.54)，7.658(6.74)，7.885(6.80)，7.904(6.34)，10.194(0.55)，10.991(0.42)。
[1313]
该氨基酸用于fmoc spps。
[1314]
实施例41a
[1315]
(3s＊，6s)-5-{[(9h-芴-9-基)甲氧基]羰基}-1，1-二氟-5-氮杂螺[2.4]庚烷-6-羧酸(单一对映异构体，对映异构体2，未指定环丙基中心的立体化学)
[1316][1317]
由手性sfc制备纯化得到1.041g目标化合物，94.58％ee
[1318]
lc-ms(方法10)：rt＝1.93min；ms(esi pos)：m/z＝400[m+h]+
[1319]1h-nmr(400mhz，dmso-d6)δ[ppm]：-0.008(1.19)，0.008(1.31)，1.031(0.55)，
1.047(0.56)，1.285(0.60)，1.583(1.53)，1.604(4.87)，1.627(5.45)，1.650(3.25)，1.673(2.78)，1.682(3.76)，1.704(3.11)，1.718(0.95)，1.915(3.17)，1.949(3.55)，1.979(3.13)，2.012(3.33)，2.073(3.85)，2.526(1.60)，2.590(1.44)，2.626(1.61)，2.649(0.89)，2.659(0.80)，3.471(2.04)，3.498(5.50)，3.527(3.26)，3.561(7.96)，3.570(4.68)，3.598(0.84)，4.167(0.94)，4.183(2.75)，4.199(6.46)，4.223(7.75)，4.238(9.60)，4.258(5.95)，4.277(4.06)，4.290(3.98)，4.306(3.80)，4.319(4.63)，4.340(4.17)，4.346(4.47)，4.354(2.34)，4.367(3.96)，4.477(3.66)，4.497(3.66)，7.300(1.97)，7.318(8.34)，7.334(11.70)，7.337(12.42)，7.352(6.35)，7.355(6.41)，7.407(9.62)，7.425(16.00)，7.444(7.11)，7.633(6.46)，7.651(10.65)，7.666(6.62)，7.683(4.36)，7.883(9.71)，7.893(10.32)，7.901(9.57)，7.912(8.99)，12.802(0.79)，12.984(0.67)。
[1320]
该氨基酸用于fmoc spps。
[1321]
实施例42a
[1322]
3-[4-(叔丁氧基羰基)-1h-1，2，3-三唑-1-基]-n-{[(9h-芴-9-基)甲氧基]羰基}-l-丙氨酸(单一立体异构体)
[1323][1324]
向3-叠氮基-n-{[(9h-芴-9-基)甲氧基]羰基}-l-丙氨酸(1.00g，2.84mmol)于27ml水/叔丁醇/二氯甲烷(1∶1∶1)的混合物中加入丙-2-炔酸叔丁酯(580μl，4.3mmol)、五水硫酸铜(ii)(709mg，2.84mmol)和抗坏血酸钠(1.41g，7.10mmol)于14ml水中的溶液。将反应混合物在室温下搅拌过夜。反应混合物用水处理，用稀柠檬酸酸化，用二氯甲烷萃取3次。有机相用硫酸钠干燥，过滤，然后蒸发。将残余物溶于乙腈/水中，并通过制备型hplc(柱：chromatorex c18 10μm 125x40mm；含有0.05％tfa的水-乙腈-梯度：0-2min 25％乙腈，2-22min 25-75％乙腈，23-26min 75％乙腈，26-28min回到25％乙腈；流速100ml/min)分离成两份。合并含有产物的级分，蒸发并真空干燥，得到1.02g(100％纯度，75％产率)目标化合物。
[1325]
lc-ms(方法11)：rt＝1.30min；ms(esi neg)：m/z＝477[m-h]-[1326]
该氨基酸用于fmoc spps。
[1327]
实施例43a
[1328]
5-氮杂螺[2.4]庚烷-1-羧酸-三氟乙酸(1/1)
[1329]
[1330]
向5-(叔丁氧基羰基)-5-氮杂螺[2.4]庚烷-1-甲酸(1.00g，4.14mmol)于25ml二氯甲烷中的溶液中加入tfa(960μl，12mmol)。将反应混合物在室温下搅拌2小时。将反应混合物蒸发并真空干燥，得到0.80g(76％产率)目标化合物。
[1331]
lc-ms(方法9)：rt＝0.18min；ms(esi pos)：m/z＝142[m+h]+
[1332]
实施例44a
[1333]
5-{[(9h-芴-9-基)甲氧基]羰基}-5-氮杂螺[2.4]庚烷-1-羧酸
[1334][1335]
向5-氮杂螺[2.4]庚烷-1-羧酸-三氟乙酸(1/1)(实施例43a，994mg，3.90mmol)在5ml乙腈和5ml水的混合物中的溶液中加入1-({[(9h-芴-9-基)甲氧基]羰基}氧基)吡咯烷-2，5-二酮(2.63g，7.79mmol)和三乙胺(2.2ml，16mmol)。将反应混合物在室温下搅拌过夜。将反应混合物用水处理，用1m盐酸酸化至ph4，然后用二氯甲烷萃取3次。合并的有机相用硫酸钠干燥，过滤并蒸发。残余物用乙腈研磨，然后过滤收集沉淀并用乙腈洗涤。滤液通过制备型hplc(色谱柱：chromatorex c18 10μm 125x40mm；含0.05％tfa的水-乙腈-梯度：0-2min 25％乙腈，2-22min 25-75％乙腈，23-26min 75％乙腈，26-28min回到25％乙腈；流速100ml/min)以三份进行纯化。合并合适的级分，蒸发并真空干燥，得到1.16g(纯度95％，产率78％)目标化合物。
[1336]
lc-ms(方法9)：rt＝0.99min；ms(esi pos)：m/z＝364[m+h]+
[1337]
该氨基酸用于fmoc spps。
[1338]
实施例45a
[1339]
(3s，5s，6r)-3-(2-甲基烯丙基)-2-氧代-5，6-二苯基-吗啉-4-羧酸叔丁酯
[1340][1341]
两批平行进行：向(2r，3s)-6-氧代-2，3-二苯基-吗啉-4-羧酸叔丁酯(90.0g，255mmol)和3-溴-2-甲基-丙-1-烯(37.0g，27.6ml，274mmol)于thf(1.8l)和hmpa(180ml)的溶液中在-70℃下在氮气气氛下在60分钟时间内滴加双(三甲基甲硅烷基)酰胺钠(279ml，1m的thf溶液)。然后将溶液在-70℃下搅拌30分钟。将反应合并并用饱和氯化铵水溶液(2.5l)淬灭，然后用乙酸乙酯(2.0l x 2)萃取。合并的有机相用饱和氯化钠水溶液(1.5l x 2)洗涤，经硫酸钠干燥，过滤并真空浓缩。残余物通过硅胶色谱法(石油醚/乙酸乙酯＝1/0、
10/1)纯化得到残余物，将残余物和石油醚/乙酸乙酯(2.0l/0.2l)的混合物在25℃下搅拌0.5h，然后过滤得到145g(纯度89％，产率62％)目标化合物。
[1342]
lc-ms：rt＝1.027min，ms+na＝430.2
[1343]
1h nmr：cdcl3：7.35-7.00(m，8h)，6.52(m，2h)，6.35-6.28(m，1h)，5.15-4.82(m，4h)，2.95-2.70(m，2h)，1s，3h)，1.41(s，3h)，1.03(s，6h)
[1344]
实施例46a
[1345]
(3s，5s，6r)-3-[(1-甲基环丙基)甲基]-5，6-二苯基-吗啉-2-酮
[1346][1347]
三批平行进行。向(3s，5s，6r)-3-(2-甲基烯丙基)-2-氧代-5，6-二苯基-吗啉-4-羧酸叔丁酯(实施例45a，35.0g，76mmol)于1.3l二氯甲烷中的溶液中在0℃下在30分钟内加入二乙基锌(400ml，1m于甲苯中)，然后在0℃下在30分钟内加入氯(碘)甲烷(140g，793mmol，57.6ml)。将反应在0℃下搅拌1.5h。将反应合并并倒入2.0l饱和碳酸氢钠水溶液中，过滤溶液，然后用二氯甲烷(1.0l x 2)萃取滤液。合并的有机相用1.5l饱和氯化钠水溶液洗涤，经硫酸钠干燥，通过一小块硅胶过滤。然后浓缩滤液得到残余物。将残余物和石油醚/乙酸乙酯/二氯甲烷(10/1/1，400ml)的混合物在25℃下搅拌0.5h并过滤。将滤液浓缩至约120ml，然后过滤得到20g(纯度92％，产率25％)目标化合物。
[1348]
lc/ms：rt＝0.909min，m+h+＝322.2
[1349]
实施例47a
[1350]
(2s)-2-(叔丁氧基羰基氨基)-3-(1-甲基环丙基)丙酸
[1351][1352]
向搅拌的冷却至-70℃的含有乙醇(50ml)、液氨(600ml)、thf(500ml)和(3s，5s，6r)-3-[(1-甲基环丙基)甲基]-5，6-二苯基-吗啉-2-酮(实施例46a，57.4g)的溶液中在-70℃下在0.5h内加入小片锂(8g，1.15mol)，直至深蓝色在-70℃下持续10分钟。通过小心加入50ml 20％氯化铵水溶液将反应淬灭，移除冷浴，并将反应加热至25℃。将反应混合物用300ml水稀释并用mtbe(200ml x 2)萃取。水相在冰中冷却，用1m盐酸水溶液酸化至ph＝1，并立即用乙酸乙酯(800ml x 2)萃取。合并的乙酸乙酯相用300ml饱和氯化钠水溶液洗涤，用硫酸钠干燥并减压浓缩，得到24g(99mmol)目标化合物。
[1353]
实施例48a
[1354]
(2s)-2-氨基-3-(1-甲基环丙基)丙酸盐酸盐
[1355][1356]
在25℃下在15分钟内向(2s)-2-(叔丁氧基羰基氨基)-3-(1-甲基环丙基)丙酸(实施例47a，24.0g，99mmol)于二氯甲烷(60ml)中的溶液中加入盐酸/二噁烷(200ml，4m)，然后将溶液在25℃下搅拌0.5小时。将反应浓缩得到残余物。将残余物用150ml mtbe处理并在25℃下搅拌15分钟，然后过滤得到16g(产率90％)目标化合物。
[1357]1h nmr：dmso-d6：0.21-0.33(3h，m)，0.37-0.51(1h，m)，1.64-1.81(2h，d)，3.88-3.92(1h，t)，8.41(3h，s)，13.73(1h，s)
[1358]
实施例49a
[1359]
(2s)-2-(9h-芴-9-基甲氧基羰基氨基)-3-(1-甲基环丙基)丙酸
[1360][1361]
向((2s)-2-氨基-3-(1-甲基环丙基)丙酸盐酸盐(实施例48a，14g，77.9mmol)和碳酸钠(25g，236mmol)于thf(200ml)和水(200ml)中的溶液中在0℃下在30分钟内加入1-({[(9h-芴-9-基)甲氧基]羰基}氧基)吡咯烷-2，5-二酮(25g，74.1mmol)，然后将溶液在0℃下搅拌2小时。加入100ml水。溶液用mtbe(300ml x 2)萃取，然后用2m盐酸水溶液将水相的ph调节至2。合并的有机相用150ml饱和氯化钠水溶液洗涤，经硫酸钠干燥，并通过二氧化硅小柱过滤。浓缩滤液得到残余物。合并的残余物(来自之前的实验)通过硅胶色谱(石油醚/乙酸乙酯(10∶1，3∶1))纯化，得到半纯残余物。通过制备型hplc(柱：phenomenex luna c18250x50mm，10μm；流动相：[水(0.05％hcl)-乙腈]；b％：38％-68％，31分钟，50％分钟)进一步纯化残余物，得到24.4g(纯度97％，产率74％)目标化合物。
[1362]
lc-ms：rt＝0.914min，[m+h]+＝366.1
[1363]1hnmr：cdcl3：δppm0.23-0.40(4h，m)，1.02-1.20(3h，m)，1.48-1.95(2h，m)，4.22-4.33(1h，m)，4.39-4.61(3h，m)，5.26-5.33(1h，m)，7.31-7.49(4h，m)，7.56-7.81(4h，m)。
[1364]
该氨基酸用于fmoc spps。
[1365]
实施例50a
[1366]
n-(叔丁氧基羰基)-d-甲硫氨酰基-l-异亮氨酸甲酯
[1367][1368]
将n-(叔丁氧基羰基)-d-甲硫氨酸(2.42g，9.71mmol)、l-异亮氨酸甲酯-氯化氢(1/1)(1.76g，9.71mmol)、1h-苯并三唑-1-醇(1.78g，11.6mmol)、3-{[(乙基亚氨基)亚甲基]氨基}-n，n-二甲基丙-1-胺盐酸盐(1∶1)(2.23g，11.6mmol)和n，n-二异丙基乙胺(3.5ml，20mmol)溶于dmf(30ml)中。混合物在环境温度下搅拌16小时。然后加入水(100ml)，将混合物用两份乙酸乙酯萃取。合并的有机萃取液依次用盐酸、水(10ml)、饱和碳酸氢钠水溶液(10ml)和盐水洗涤，然后用无水硫酸钠干燥。过滤有机层并浓缩滤液。将残余物溶于乙醚，并将产物结晶。将固体过滤并依次用乙醚和戊烷洗涤。得到3.13g(99％纯度，86％产率)目标化合物。
[1369]
实施例51a
[1370]
(2s，3s)-2-{(3r)-3-[(叔丁氧基羰基)氨基]-2-氧代吡咯烷-1-基}-3-甲基戊酸甲酯
[1371][1372]
将n-(叔丁氧基羰基)-d-甲硫氨酰基-l-异亮氨酸甲酯(实施例50a，2.85g，7.57mmol)溶于二氯甲烷(40ml)中并将溶液冷却至0℃。加入四氟硼酸三甲基氧鎓(1.12g，7.57mmol)并将混合物在室温下搅拌3小时。加入碳酸钾(3.13g，22.71mmol)。然后将混合物加热回流16小时。将反应混合物倒入50ml二氯甲烷中并用五份水洗涤。将有机层用盐水洗涤，用无水硫酸镁干燥，然后过滤。将滤液浓缩并从己烷中结晶，得到2.01g(纯度100％，产率81％)目标化合物。
[1373]
实施例52a
[1374]
(2s，3s)-2-{(3r)-3-[(叔丁氧羰基)氨基]-2-氧代吡咯烷-1-基}-3-甲基戊酸
[1375][1376]
将(2s，3s)-2-{(3r)-3-[(叔丁氧基羰基)氨基]-2-氧代吡咯烷-1-基}-3-甲基戊酸甲酯(实施例51a，1.96g，5.97mmol)溶于thf(7.8ml)和甲醇(7.8ml)中。加入氢氧化锂(300mg，12.5mmol)于8ml水中的溶液并将混合物在室温下搅拌1小时。浓缩反应混合物后，将白色残余物溶于水(40ml)，用dcm(6ml)洗涤，然后用1m盐酸(12ml)酸化。混合物用三份乙酸乙酯萃取。合并的有机萃取物用无水硫酸钠干燥，过滤，然后浓缩。将残余物从乙酸乙酯和己烷中结晶得到1.3g(纯度100％，产率67％)目标化合物。
[1377]
lc-ms(方法11)：rt＝1.09min；ms(esi neg)：m/z＝313[m-h]-[1378]1h-nmr(400mhz，dmso-d6)δ[ppm]：0.810(0.96)，0.829(2.41)，0.847(1.25)，0.889(2.53)，0.906(2.59)，1.387(16.00)，3.260(0.71)，3.274(0.56)，3.283(0.75)，3.298(0.64)，4.200(0.97)，4.225(0.94)。
[1379]
实施例53a
[1380]
n-(叔丁氧基羰基)甘氨酰基-l-异亮氨酸甲酯
[1381][1382]
将l-异亮氨酸甲酯(3.00g，20.7mmol)和n-(叔丁氧基羰基)甘氨酸(3.98g，22.7mmol)溶于dmf(20ml)中。在冰浴中将该溶液冷却至0-5℃。加入n，n-二异丙基乙胺(3.6ml，21mmol)、1h-苯并三唑-1-醇水合物(316mg，2.07mmol)和1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(4.36g，22.7mmol)，并将混合物在室温下搅拌。反应混合物用浓氯化铵水溶液淬灭并用三份乙酸乙酯萃取。合并的有机萃取液用无水硫酸镁干燥并浓缩。通过硅胶色谱法(环己烷/乙酸乙酯0％至10％)纯化粗产物，得到目标化合物5.40g(90％纯度，78％产率)。
[1383]
lc-ms(方法11)：rt＝1.13min；ms(esi pos)：m/z＝247[m-tbu]+
[1384]1h-nmr(400mhz，dmso-d6)δ[ppm]：0.819(4.90)，0.835(8.09)，0.853(2.63)，1.152(0.40)，1.174(0.45)，1.354(1.52)，1.375(16.00)，1.459(0.46)，3.561(0.84)，3.571(0.98)，3.577(1.45)，3.594(0.81)，3.630(11.35)，4.220(0.63)，4.237(0.78)，4.240(0.82)，4.257。
[1385]
实施例54a
[1386]
甘氨酰基-l-异亮氨酸甲酯
[1387][1388]
将n-(叔丁氧基羰基)甘氨酰基-l-异亮氨酸甲酯(实施例53a，1.50g，4.96mmol)溶于dcm(27ml)中。加入三氟乙酸(3.0ml，39mmol)并将反应混合物在室温下搅拌30分钟。浓缩反应混合物得到粗产物，将其直接用于下一步。
[1389]
实施例55a
[1390]
n-(4-硝基苯-1-磺酰基)甘氨酰基-l-异亮氨酸甲酯
[1391][1392]
将甘氨酰基-l-异亮氨酸甲酯(实施例54a，1.00g，4.96mmol)溶于二氯甲烷(40ml，620mmol)中，加入三乙胺(2.4ml，17mmol)，然后将溶液冷却至0℃。加入4-硝基苯-1-磺酰氯(1.21g，5.46mmol)并将反应混合物搅拌1小时。然后将反应用浓氯化铵水溶液淬灭并用三份乙酸乙酯萃取。合并的有机萃取物用无水硫酸镁干燥，过滤，然后浓缩，得到1.70g(71％产率)目标化合物。产物直接用于下一步。
[1393]
实施例56a
[1394]
(2s，3s)-3-甲基-2-[4-(4-硝基苯-1-磺酰基)-2-氧代哌嗪-1-基]戊酸甲酯
[1395][1396]
将n-(4-硝基苯-1-磺酰基)甘氨酰基-l-异亮氨酸甲酯(实施例55a，1.92g，4.96mmol)和1，2-二溴乙烷(4.3ml，50mmol)溶的dmf溶液。加入碳酸钾(6.86g，49.6mmol)并将混合物加热至60℃保持3小时。然后将反应用浓氯化铵水溶液猝灭并用三份乙醚萃取。合
并的有机萃取物用无水硫酸镁干燥，过滤，然后蒸发。通过硅胶柱色谱法(环己烷/乙酸乙酯6∶1)纯化粗产物，得到目标化合物1.40g(纯度97％，产率66％)。
[1397]
lc-ms(方法11)：rt＝1.30min；ms(esi pos)：m/z＝414[m+h]+
[1398]
实施例57a
[1399]
(2s，3s)-3-甲基-2-(2-氧代哌嗪-1-基)戊酸甲酯
[1400][1401]
将(2s，3s)-3-甲基-2-[4-(4-硝基苯-1-磺酰基)-2-氧代哌嗪-1-基]戊酸甲酯(实施例56a，1.40g，3.39mmol)和苯硫醇(1.0ml，10mmol)溶于乙腈(20ml)中。加入碳酸钾(936mg，6.77mmol)并将混合物在室温下搅拌。过滤混合物并蒸发。通过硅胶快速色谱法(梯度二氯甲烷/甲醇100∶0至95∶5)纯化残余物，得到310mg(产率40％)目标化合物，将其直接用于下一步。
[1402]
实施例58a
[1403]
4-[(2s，3s)-1-甲氧基-3-甲基-1-氧代戊烷-2-基]-3-氧代哌嗪-1-羧酸叔丁基酯
[1404][1405]
将(2s，3s)-3-甲基-2-(2-氧代哌嗪-1-基)戊酸甲酯(实施例57a，310mg，1.36mmol)溶于二氯甲烷(1.7ml，26mmol)中。加入二碳酸二叔丁酯(370μl，1.6mmol)并将混合物在室温下搅拌1小时。然后将反应用浓氯化铵水溶液猝灭，然后用三份dcm(20ml)萃取。合并的有机萃取物用无水硫酸镁干燥，过滤然后浓缩，得到440mg(纯度99％，产率98％)目标化合物。
[1406]
lc-ms(
§
方法11)：rt＝1.27min；ms(esi pos)：m/z＝273[m+h-tbu]+
[1407]1h-nmr(400mhz，dmso-d6)δ[ppm]：0.807(0.86)，0.826(2.27)，0.844(1.20)，0.870(2.25)，0.887(2.30)，1.410(16.00)，3.645(6.00)，3.963(0.63)，3.970(0.62)，4.766(0.82)，4.792(0.80)，5.754(0.87)。
[1408]
实施例59a
[1409]
(2s，3s)-2-[4-(叔丁氧基羰基)-2-氧代哌嗪-1-基]-3-甲基戊酸
[1410][1411]
将4-[(2s，3s)-1-甲氧基-3-甲基-1-氧代戊烷-2-基]-3-氧代哌嗪-1-羧酸叔丁酯(实施例58a，440mg，纯度80％，1.07mmol)溶于thf(1.4ml)和甲醇(1.4ml)中。加入氢氧化锂
(53.9mg，2.25mmol)于水(1.4ml)中的溶液并将混合物在室温下搅拌1小时。将反应混合物浓缩，将残余物溶于水中，然后用dcm洗涤。分离出水层，用1m盐酸酸化至ph 3-4，然后用乙酸乙酯萃取3次。合并的有机层用无水硫酸镁干燥，过滤，然后减压浓缩，得到310mg(95％纯度，87％产率)无色油状物的目标化合物。
[1412]
lc-ms(方法11)：rt＝1.11min；ms(esi neg)：m/z＝313[m-h]-[1413]1h-nmr(400mhz，dmso-d6)δ[ppm]：0.809(0.81)，0.827(2.06)，0.845(1.12)，0.908(2.11)，0.924(2.09)，1.411(16.00)，3.438(0.43)，3.968(0.78)，4.688(0.79)，4.713(0.77)。
[1414]
实施例60a
[1415]
n-(叔丁氧基羰基)-l-丙氨酰基-l-异亮氨酸甲酯
[1416][1417]
将n-(叔丁氧基羰基)-l-丙氨酸(1.50g，7.93mmol)和l-异亮氨酸甲酯-氯化氢(1/1)(1.58g，8.72mmol)溶于dmf(7.7ml)中。在冰浴中将该溶液冷却至0-5℃。加入n，n-二异丙基乙胺(1.4ml，7.9mmol)、1h-苯并三唑-1-醇水合物(121mg，793μmol)和1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(1.67g，8.72mmol)并在室温下搅拌混合物。然后将反应用浓氯化铵水溶液淬灭并用三份乙酸乙酯萃取。合并的有机萃取液用无水硫酸镁干燥，过滤，然后浓缩。通过硅胶色谱法(环己烷/乙酸乙酯0％至15％)纯化粗产物，得到2.12g(纯度100％，产率84％)目标化合物。
[1418]
lc lc-ms(方法10)：rt＝1.70min；ms(esi pos)：m/z＝317[m+h]+
[1419]1h-nmr(400mhz，dmso-d6)δ[ppm]：-0.008(1.00)，0.008(0.77)，0.818(3.17)，0.825(4.25)，0.836(7.51)，0.842(4.72)，0.855(3.30)，1.144(4.07)，1.161(4.10)，1.179(0.54)，1.200(0.53)，1.371(16.00)，1.398(13.44)，1.775(0.49)，2.523(0.85)，3.621(15.73)，4.021(0.46)，4.039(0.60)，4.207(1.06)，4.223(1.19)，4.228(1.22)，4.244(1.06)，6.908(0.61)，6.928(0.58)，7.886(0.57)，7.907(0.60).
[1420]
实施例61a
[1421]
l-丙氨酰基-l-异亮氨酸甲酯
[1422][1423]
将n-(叔丁氧基羰基)-l-丙氨酰基-l-异亮氨酸甲酯(实施例60a，2.10g，6.64mmol)溶于dcm(20ml)中。加入三氟乙酸(20ml，260mmol)并将反应混合物在室温下搅拌30分钟。浓缩反应混合物，并将粗二肽直接用于下一步。
[1424]
实施例62a
[1425]
n-(4-硝基苯-1-磺酰基)-l-丙氨酰基-l-异亮氨酸甲酯
[1426][1427]
将l-丙氨酰基-l-异亮氨酸甲酯(实施例61a，1.44g，6.64mmol)溶于二氯甲烷(54ml)中，加入三乙胺(3.2ml，23mmol)，然后将溶液冷却至0℃。加入4-硝基苯-1-磺酰氯(1.62g，7.30mmol)并搅拌反应混合物。然后将反应用浓氯化铵水溶液猝灭并用两份二氯甲烷萃取。将合并的有机萃取物用饱和氯化钠水溶液洗涤，用无水硫酸镁干燥，过滤并浓缩，得到1.65g(95％纯度，59％产率)目标化合物。
[1428]
lc-ms(方法11)：rt＝1.18min；ms(esi neg)：m/z＝400[m-h]-[1429]1h-nmr(400mhz，dmso-d6)δ[ppm]：0.008(0.40)，0.676(6.59)，0.693(6.80)，0.740(2.79)，0.758(6.99)，0.777(3.46)，1.013(0.52)，1.025(0.62)，1.047(0.69)，1.066(0.50)，1.117(6.09)，1.135(6.12)，1.175(0.51)，1.192(0.64)，1.203(0.60)，1.210(0.56)，1.222(0.67)，1.237(0.48)，1.243(0.42)，1.551(0.53)，1.568(0.61)，1.578(0.45)，1.584(0.47)，1.988(0.64)，3.577(16.00)，3.933(1.14)，3.948(1.32)，3.953(1.31)，3.968(1.12)，4.056(0.61)，4.073(0.82)，4.091(0.54)，7.994(4.08)，7.999(1.44)，8.012(1.63)，8.016(4.58)，8.135(1.41)，8.155(1.39)，8.365(4.39)，8.383(1.48)，8.388(3.90)，8.463(1.04)，8.482(0.99)。
[1430]
实施例63a
[1431]
(2s，3s)-3-甲基-2-[(3s)-3-甲基-4-(4-硝基苯-1-磺酰基)-2-氧代哌嗪-1-基]戊酸甲酯
[1432][1433]
将n-(4-硝基苯-1-磺酰基)-l-丙氨酰基-l-异亮氨酸甲酯(实施例62a，1.65g，4.11mmol)和1，2-二溴乙烷(3.5ml，41mmol)溶于dmf(35ml)中。加入碳酸钾(5.68g，41.1mmol)并将反应混合物加热至60℃保持3小时。然后将反应用浓氯化铵水溶液猝灭并用
三份乙醚萃取。合并的有机萃取物用无水硫酸镁干燥，过滤，然后浓缩。通过硅胶色谱法(环己烷/乙酸乙酯6∶1)纯化粗产物，得到1.60g(纯度70％，产率64％)目标化合物。
[1434]
lc-ms(方法11)：rt＝1.30min；ms(esi pos)：m/z＝428[m+h]
+
[1435]
实施例64a
[1436]
(2s，3s)-3-甲基-2-[(3s)-3-甲基-2-氧代哌嗪-1-基]戊酸甲酯
[1437][1438]
将(2s，3s)-3-甲基-2-[(3s)-3-甲基-4-(4-硝基苯-1-磺酰基)-2-氧代哌嗪-1-基]戊酸甲酯(实施例63a，900mg，2.11mmol)和苯硫醇(650μl，6.3mmol)溶于乙腈(12ml)中。加入碳酸钾(582mg，4.21mmol)并将反应混合物在室温下搅拌过夜。将混合物过滤并浓缩。通过硅胶快速色谱法(梯度二氯甲烷/甲醇100∶0至95∶5)纯化残余物，得到336mg(100％纯度，66％产率)目标化合物。
[1439]
lc-ms(方法13)：rt＝1.09min；ms(esi pos)：m/z＝243[m+h]
+
[1440]
实施例65a
[1441]
(2s)-4-[(2s，3s)-1-甲氧基-3-甲基-1-氧代戊烷-2-基]-2-甲基-3-氧代哌嗪-1-羧酸叔丁酯
[1442][1443]
将(2s，3s)-3-甲基-2-[(3s)-3-甲基-2-氧代哌嗪-1-基]戊酸甲酯(实施例64a，736mg，3.04mmol)溶于二氯甲烷(8ml)中。加入二碳酸二叔丁酯(1.0ml，4.6mmol)，并将反应混合物在室温下搅拌过周末。然后用浓氯化铵水溶液淬灭反应并用两份dcm萃取。合并的有机萃取液用氯化钠溶液洗涤，用无水硫酸镁干燥，过滤，然后浓缩。通过硅胶色谱法(环己烷/乙酸乙酯3∶1)纯化粗产物，得到1.08g(纯度100％，产率104％)目标化合物。
[1444]
lc-ms(方法10)：rt＝1.98min；ms(esi pos)：m/z＝343[m+h]
+
[1445]1h-nmr(400mhz，dmso-d6)δ[ppm]：0.800(0.95)，0.818(2.41)，0.837(1.25)，0.875(2.38)，0.892(2.43)，1.305(2.02)，1.323(2.06)，1.414(16.00)，3.645(6.08)，4.769(0.88)，4.795(0.86)。
[1446]
实施例66a
[1447]
(2s，3s)-2-[(3s)-4-(叔丁氧基羰基)-3-甲基-2-氧代哌嗪-1-基]-3-甲基戊酸
[1448]
[1449]
将(2s)-4-[(2s，3s)-1-甲氧基-3-甲基-1-氧代戊烷-2-基]-2-甲基-3-氧代哌嗪-1-羧酸叔丁酯(实施例65a，1.08g，3.15mmol)溶于thf(4.5ml)和甲醇(4.5ml)的混合物中。加入氢氧化锂(159mg，6.62mmol)于水(4.5ml)中的溶液并将反应混合物在室温下搅拌1小时。将反应混合物浓缩并将残余物溶于浓氯化铵水溶液中。水层用1m盐酸酸化至ph3-4并用dcm萃取3次。合并的有机层用无水硫酸镁干燥，过滤，然后浓缩，得到952mg(纯度100％，产率92％)目标化合物。
[1450]
lc-ms(方法9)：rt＝0.87min；ms(esi pos)：m/z＝329[m+h]
+
[1451]1h-nmr(400mhz，dmso-d6)δ[ppm]：0.802(1.09)，0.820(2.24)，0.838(1.18)，0.911(2.22)，0.927(2.28)，1.295(0.50)，1.308(2.03)，1.326(1.99)，1.415(16.00)，3.342(0.65)，4.691(0.84)，4.717(0.82)。
[1452]
实施例67a
[1453]
(2r，5r)-3，6-二甲氧基-2-(丙烷-2-基)-5-[(三甲基甲硅烷基)甲基]-2，5-二氢吡嗪
[1454][1455]
将(2r)-3，6-二甲氧基-2-(丙烷-2-基)-2，5-二氢吡嗪(2.9ml，16mmol)溶于thf(58ml)中并将溶液冷却至-78℃。搅拌下滴加正丁基锂(10ml，1.6m，16mmol)。在-78℃下继续搅拌15分钟。加入(氯-甲基)(三甲基)硅烷(5.0ml，36mmol)并将所得混合物在环境温度下搅拌过夜。将反应混合物用水稀释并用乙醚萃取。合并的有机层用无水硫酸钠干燥，过滤，然后浓缩。通过硅胶色谱法(环己烷/乙酸乙酯2％)纯化粗产物，得到3.0g(纯度87％，产率60％)目标化合物。
[1456]
lc-ms(方法9)：rt＝1.47min；ms(esi pos)：m/z＝271[m+h]+
[1457]1h-nmr(400mhz，dmso-d6)δ[ppm]：-0.036(0.45)，-0.028(9.14)，-0.020(0.46)，-0.008(1.38)，0.580(3.69)，0.597(3.75)，0.737(0.61)，0.762(0.63)，0.773(0.73)，0.798(0.73)，0.959(3.60)，0.977(3.69)，1.107(0.73)，1.119(0.75)，1.143(0.66)，1.148(0.47)，1.155(0.63)，1.370(1.30)，2.512(16.00)，3.574(8.95)，3.582(8.85)，3.885(0.64)，3.894(1.26)，3.903(0.72)，3.999(0.49)，4.023(0.47)。
[1458]
实施例68a
[1459]
3-(三甲基甲硅烷基)-l-丙氨酸甲酯
[1460]
[1461]
将(2r，5r)-3，6-二甲氧基-2-(丙烷-2-基)-5-[(三甲基甲硅烷基)甲基]-2，5-二氢吡嗪(实施例67a，3.00g，11.1mmol)溶于甲醇(30ml，740mmol)中并将溶液冷却至0℃。加入盐酸(10ml，10％)并将溶液搅拌2小时。蒸发溶液并将残余物溶于dcm和碳酸钠溶液(100ml，2.0m，200mmol)中。水层用两份dcm萃取。dcm萃取物用无水硫酸镁干燥，过滤，然后浓缩。将粗产物通过硅胶色谱法(2％甲醇：(1％n，n-二乙基乙胺的dcm溶液))纯化得到2.83g(纯度68％，产率99％)目标化合物。
[1462]
1h-nmr(400mhz，dmso-d6)δ[ppm]：-0.010(3.10)，0.008(1.81)，0.736(0.85)，0.759(0.89)，0.772(1.48)，0.795(1.56)，0.803(1.89)，0.820(1.90)，0.841(1.84)，0.858(2.43)，0.875(1.64)，0.900(4.19)，0.911(1.07)，0.918(8.65)，0.936(4.28)，1.682(1.42)，2.384(1.35)，2.402(4.11)，2.420(4.02)，2.438(1.25)，3.088(0.55)，3.102(0.54)，3.302(1.19)，3.306(1.81)，3.321(1.27)，3.330(1.15)，3.345(1.03)，3.583(16.00)，3.591(0.48)，3.605(4.33)，5.742(4.37)。
[1463]
实施例69a
[1464]
n-{[(9h-芴-9-基)甲氧基]羰基}-3-(三甲基甲硅烷基)-l-丙氨酸
[1465][1466]
将3-(三甲基甲硅烷基)-l-丙氨酸甲酯(实施例68a，2.83g，纯度68％，11.0mmol)溶于甲醇(44ml)中并将溶液冷却至0℃。加入氢氧化钠溶液(11ml，1.0m，11mmol)并将反应混合物在室温下搅拌过夜。加入水(40ml)、碳酸氢钠(922mg，11.0mmol)和碳酸钠(1.53g，14.4mmol)。减压除去甲醇，然后将1，4-二噁烷(32ml)加入水溶液中。将该溶液在冰浴中冷却至0℃。然后加入(9h-芴-9-基)氯甲酸甲酯(fmoc-cl)(4.26g，16.5mmol)并将反应混合物在室温下搅拌5小时。加入过量的fmoc-cl(1.42g，5.5mmol)并将反应混合物再搅拌2小时。将等份的水和叔丁基甲基醚加入到反应混合物中。分离水相并用叔丁基甲基醚进一步洗涤，然后用1m盐酸酸化(ph3-4)。将酸化的混合物用三份mtbe萃取。合并的有机层用无水硫酸镁干燥，过滤，然后浓缩。粗产物通过制备型hplc(柱：reprosil；c18；10μm；125x40mm；洗脱液：含0.1％hcooh的accn/h2o；流速：100ml/min；梯度：0-5.50分钟10∶90；3.00分钟时进样；5.50-17.65分钟至95∶5；17.65-19.48分钟95∶5；19.48-19.66分钟至10∶90；19.66-20.72分钟10∶90；)得到1.65g(纯度99％，产率39％)目标化合物。
[1467]
lc-ms(方法10)：rt＝2.20min；ms(esi pos)：m/z＝384[m+h]+
[1468]1h-nmr(400mhz，dmso-d6)δ[ppm]：-0.006(16.00)，0.987(3.81)，1.006(3.64)，3.309(2.95)，3.950(0.67)，3.970(1.71)，3.991(1.59)，4.010(0.53)，4.182(0.67)，4.199(1.66)，4.217(1.67)，4.228(1.08)，4.253(2.79)，4.268(3.86)，4.287(1.60)，4.293
(0.85)，4.313(0.41)，7.286(1.24)，7.291(1.27)，7.293(1.31)，7.302(2.68)，7.304(2.70)，7.309(2.55)，7.321(1.75)，7.323(1.70)，7.328(1.57)，7.389(2.90)，7.408(4.73)，7.426(2.11)，7.566(1.81)，7.587(1.74)，7.697(2.14)，7.714(3.62)，7.731(1.81)，7.872(4.43)，7.891(4.02)，12.451(0.54)。
[1469]
该氨基酸用于fmoc spps。
[1470]
实施例70a
[1471]
(2s)-5-羟基吡咯烷-1，2-二羧酸二叔丁酯(异构体混合物)
[1472][1473]
将(2s)-5-氧代吡咯烷-1，2-二羧酸二叔丁酯(cas-rn：91229-91-3，21.0g，73.6mmol)溶于250ml thf中，并将溶液冷却至-78℃。滴加二异丁基氢化铝(160ml，1.0m，160mmol)并将混合物在-78℃下搅拌1小时。然后将反应用2-丙醇(25ml)淬灭。加入(2r，3r)-2，3-二羟基丁二酸钾钠溶液(200ml)，将混合物在室温下搅拌，然后用mtbe和水稀释反应混合物。分离水层并用两份mtbe进一步萃取。合并的有机萃取物用无水硫酸镁干燥，过滤，将残余物减压浓缩，得到19.53g(79％纯度，73％产率)无色油状物的目标化合物。
[1474]
实施例71a
[1475]
(2s，)-5-甲氧基吡咯烷-1，2-二羧酸二叔丁酯(异构体混合物)
[1476][1477]
将(2s)-5-羟基吡咯烷-1，2-二羧酸二叔丁酯(实施例70a，19.5g，67.9mmol)溶于甲醇(160ml)中。向溶液中加入对甲苯磺酸吡啶鎓(341mg，1.36mmol)并将反应混合物在室温下搅拌过夜。浓缩反应混合物，粗产物通过硅胶快速色谱(梯度环己烷-环己烷乙酸乙酯7∶3)纯化，得到14.4g(纯度90％，产率64％)目标化合物。
[1478]1h-nmr(400mhz，dmso-d6)δ[ppm]：1.363(9.51)，1.375(8.10)，1.393(2.67)，1.419(16.00)，1.756(0.58)，1.775(0.93)，1.781(0.88)，1.807(0.46)，3.225(3.77)，3.240(1.93)，3.261(2.02)，3.307(4.01)，4.059(0.64)，4.081(0.82)，5.128(0.56)。
[1479]
实施例72a
[1480]
(2s)-5-氰基吡咯烷-1，2-二羧酸二叔丁酯(异构体混合物)
[1481][1482]
将(2s，)-5-甲氧基吡咯烷-1，2-二羧酸二叔丁酯(实施例71a，14.4g，47.8mmol)溶于dcm(125ml)中并将溶液冷却至-40℃。加入三氟甲磺酸三甲基甲硅烷酯(1.3ml)(1体积％)，然后在40分钟内滴加入三甲基硅烷腈(7.0ml，53mmol)。随后将混合物在-40℃下再搅拌1.5h。将反应混合物用甲醇(19ml)猝灭，然后浓缩，分离得到14.87g(产率86％)目标化合物。
[1483]
gc-ms(gc-ms方法1)：195.2(m+-boc)，139.1(-boc，-t-bu)
[1484]
实施例73a
[1485]
(2s)-5-甲酰基吡咯烷-1，2-二羧酸二叔丁酯(异构体混合物)
[1486][1487]
将(2s)-5-氰基吡咯烷-1，2-二羧酸二叔丁酯(实施例72a，14.0g，47.2mmol)溶于吡啶(250ml)、乙酸(130ml)和水(130ml)的混合物中。加入raney-镍-水悬浮液(70.0g，纯度50％)并将混合物在环境压力、80℃下氢化7小时。然后通过在硅藻土层上过滤除去催化剂并用250ml水洗涤溶剂。将水相用mtbe(650ml)萃取3次。合并的有机层用水洗涤3次，用盐水洗涤，经无水硫酸镁干燥，然后过滤。减压蒸发滤液，将残余物通过硅胶快速色谱(梯度环己烷-环己烷/乙酸乙酯7∶3)纯化，得到7.40g(纯度85％，产率44％)粘性油状物。
[1488]
gc-ms(gc-ms方法1)：(m+-co)；(m+-co，-boc)
[1489]
实施例74a
[1490]
(2s)-5-乙烯基吡咯烷-1，2-二羧酸二叔丁酯(异构体混合物)
[1491][1492]
将甲基(三苯基)溴化鏻(17.7g，49.4mmol)悬浮在180ml thf中。在室温下滴加双(三甲基甲硅烷基)酰胺钾溶液(1m的甲苯溶液，75ml，15％溶液，49mmol)并搅拌1小时。将混合物冷却至-78℃。将(2s)-5-甲酰基吡咯烷-1，2-二羧酸二叔丁酯(实施例73a，7.40g，24.7mmol)溶于thf(60ml)中。加入溶液并在室温下搅拌2小时。将反应混合物倾倒入(2r，3r)-2，3-二羟基丁二酸钾钠(140ml)和水(85ml)的溶液中，并用三份mtbe(210ml)萃取。合
并的有机萃取物用氯化钠溶液洗涤，用无水硫酸钠干燥，过滤，然后浓缩。通过硅胶快速色谱法(梯度环己烷-乙酸环己烷乙酯(9∶1))纯化粗产物，分离得到4.25g(纯度100％，产率58％)目标化合物。
[1493]
gc-ms(gc-ms方法1)：rt＝5.07min，5.17min；197.3(m+-boc)
[1494]
实施例75a
[1495]
5-乙烯基-l-脯氨酸叔丁基酯(异构体混合物)
[1496][1497]
将(2s)-5-乙烯基吡咯烷-1，2-二羧酸二叔丁酯(实施例74a，4.25g，14.3mmol)溶于45ml dcm中并将溶液冷却至0℃。滴加三氟甲磺酸三甲基甲硅烷基酯(2.6ml，14mmol)，并将所得混合物在0℃下搅拌5分钟。然后将反应用浓碳酸氢钠水溶液(21ml)淬灭并用两份dcm萃取。合并的有机层用硫酸镁干燥，过滤，然后浓缩。通过硅胶快速色谱法(梯度甲醇-二氯甲烷(100：2))纯化粗产物，得到2.09g(纯度100％，产率74％)目标化合物。
[1498]
gc-ms(gc-ms方法1)：rt＝3.37min，3.50min；197.3(m+)
[1499]
实施例76a
[1500]
(5r)-5-乙烯基-l-脯氨酸叔丁酯(单一立体异构体)
[1501][1502]
通过硅胶快速色谱法(梯度环己烷-乙酸乙酯-三甲胺(70∶30∶1))对叔丁基-5-乙烯基-l-脯氨酸酯(非对映混合物)(实施例75a，2.55g，12.9mmol)进行异构分离，得到1.35g(纯度100％，产率53％)目标化合物。
[1503]
gc-ms(gc-ms方法1)：rt＝3.50min；197.3(m+)
[1504]1h-nmr(400mhz，dmso-d6)δ[ppm]：1.3-1.4(1h)，1.40(9h)，2.4(1h)，3.5(2h)，4.9(1h)，5.15(1h)，5.8(1h)。
[1505]
实施例77a
[1506]
2-甲基-3-乙烯基哌啶-1，2-二羧酸1-叔丁酯(异构体混合物)
[1507][1508]
将在无水thf(20ml)中的乙烯基溴化镁(39ml，0.70m，27mmol)溶液冷却至-35℃，然后加入溴化亚铜(i)-二甲硫醚(1∶1)(741mg，3.61mmol)溶液。将反应混合物在-35℃下搅拌1小时。将2-甲基5，6-二氢吡啶-1，2(4h)-二羧酸1-叔丁酯(cas-rn：155905-80-9，4.35g，18.0mmol)于thf(10ml)中的溶液加入混合物中，然后将反应混合物在-35℃下搅拌6小时。
将混合物用氯化铵水溶液(85ml)和氨水(85ml)的混合物淬灭并用两份mtbe(285ml)萃取。将合并的有机层依次用氯化铵水溶液(570ml)和盐水(570ml)洗涤，用硫酸镁干燥，过滤，然后浓缩。通过硅胶色谱法(梯度：环己烷-乙酸乙酯(2％-20％))纯化粗产物，得到1.59g(纯度100％，产率33％)目标化合物。
[1509]
lc-ms(方法12)：rt＝3.33min；ms(esi pos)：m/z＝270[m+h]
+
[1510]1h-nmr(400mhz，dmso-d6)δ[ppm]：1.038(0.51)，1.087(0.77)，1.382(16.00)，1.419(0.83)，1.429(0.59)，1.448(0.73)，1.459(0.80)，1.466(0.54)，1.479(1.01)，1.485(1.09)，1.496(0.73)，1.502(0.66)，1.506(0.59)，1.514(0.47)，1.532(0.47)，1.544(0.42)，1.600(0.64)，1.627(0.61)，2.899(0.88)，3.690(13.11)，3.817(0.47)，3.849(0.45)，5.120(2.03)，5.148(0.90)，5.164(1.49)，5.869(0.57)。
[1511]
实施例78a
[1512]
1-(叔丁氧基羰基)-3-乙烯基哌啶-2-羧酸(异构体混合物)
[1513][1514]
将2-甲基3-乙烯基哌啶-1，2-二羧酸1-叔丁酯(实施例77a，1.59g，5.90mmol)溶于甲醇(5.9ml)和thf(17.7ml)的混合物中。加入氢氧化锂溶液(5.9ml，2.0m，12mmol)并将混合物在50℃下搅拌5小时，然后冷却至室温。将反应混合物用mtbe(7.5ml)洗涤，冷却至0℃，用1m盐酸(14.5ml)酸化，然后用dcm(15ml)萃取五次。合并的有机萃取物用硫酸镁干燥，过滤，然后浓缩，得到1.39g(纯度100％，产率92％)目标化合物。
[1515]1h-nmr(400mhz，dmso-d6)δ[ppm]：1.381(16.00)，1.423(0.70)，1.434(0.57)，1.455(0.77)，1.465(1.32)，1.473(0.93)，1.488(1.66)，1.495(1.29)，1.519(0.46)，1.530(0.40)，1.608(0.80)，1.632(0.75)，2.911(0.96)，3.815(0.50)，3.842(0.47)，5.113(1.95)，5.140(0.73)，5.156(1.59)，5.753(0.50)，5.874(0.51)，12.910(0.69)。
[1516]
实施例79a
[1517]
2-{[(2s，5r)-2-(叔丁氧基羰基)-5-乙烯基吡咯烷-1-基]羰基}-3-乙烯基哌啶-羧酸叔丁酯(异构体混合物)
[1518]
[1519]
将1-(叔丁氧基羰基)-3-乙烯基哌啶-2-羧酸(外消旋物)(实施例78a，1.35g，5.30mmol)和(5r)-5-乙烯基-l-脯氨酸叔丁酯(实施例76a，950mg，4.82mmol)溶于乙腈(60ml)中。加入n，n-二异丙基乙胺(2.5ml，14mmol)并将反应混合物冷却至0℃。将1h-苯并三唑-1-基氧基)(三吡咯烷-1-基)鏻六氟磷酸酯(3.26g，6.26mmol)于乙腈(30ml)中的溶液加入至混合物中，并将反应混合物在室温下搅拌20小时。将反应混合物浓缩，重新溶于mtbe中并用水洗涤。水相用mtbe再萃取。合并的有机层用盐水洗涤，用硫酸镁干燥，过滤，然后浓缩。通过硅胶色谱法(环己烷/乙酸乙酯(85∶15))纯化粗产物，得到2.03g(产率88％)目标化合物。
[1520]1h-nmr(400mhz，dmso-d6)δ[ppm]：-0.008(0.60)，1.373(10.15)，1.392(16.00)，1.396(14.53)，1.458(0.57)，1.489(0.46)，1.763(0.46)，1.780(0.56)，2.105(0.42)，2.122(0.42)，2.524(0.41)，5.050(0.44)，5.090(0.70)，5.116(0.79)，5.754(1.04)。
[1521]
实施例80a
[1522]
(4ar，6ar，9s，11as)-11-氧代-2，3，4，4a，6a，7，8，9，11，11a-十氢-1h-吡啶并[3，2-e]吡咯并[1，2-a]氮杂-1，9-二羧酸二叔丁酯(单一立体异构体)
[1523][1524]
将2-{[(2s，5r)-2-(叔丁氧基羰基)-5-乙烯基吡咯烷-1-基]羰基}-3-乙烯基哌啶-羧酸叔丁酯(实施例79a，2.00g，4.60mmol)溶于dcm(100ml)中并加入[1，3-双(2，4，6-三甲基苯基)咪唑啉-2-亚基](二氯)(苯基亚甲基)钌-三环己基膦(1∶1)(781mg，920μmol)。将反应混合物在回流下搅拌48小时，然后将其冷却至室温。加入dmso(2.0ml)并将反应混合物在室温下搅拌过夜。浓缩反应混合物，通过硅胶色谱法(环己烷/乙酸乙酯(25％-50％))纯化粗产物，得到805mg(纯度99％，产率42％)目标化合物。
[1525]
lc-ms(方法9)：rt＝1.12min；ms(esi pos)：m/z＝407[m+h]+
[1526]1h-nmr(400mhz，dmso-d6)δ[ppm]：1.296(5.30)，1.361(16.00)，1.378(2.93)，5.540(0.72)，5.562(0.51)。
[1527]
实施例81a
[1528]
(4ar，6ar，9s，11as)-1-{[(9h-芴-9-基)甲氧基]羰基}-11-氧代-2，3，4，4a，6a，7，8，9，11，11a-十氢-1h-吡啶并[3，2-e]吡咯并[1，2-a]氮杂-9-羧酸(单一立体异构体)
[1529][1530]
将二叔丁基-(4ar，6ar，9s，11as)-11-氧代-2，3，4，4a，6a，7，8，9，11，11a-十氢-1h-吡啶并[3，2-e]吡咯并[1，2-a]氮杂-1，9-二羧酸酯(实施例80a，800mg，1.97mmol)溶于8ml dcm中，并将溶液冷却至0℃。加入三氟乙酸(8.0ml，100mmol)并将反应混合物在室温下搅拌1小时。浓缩反应混合物并用碳酸氢钠溶液(20ml，ph＝8)稀释残余物。加入(9h-芴-9-基)氯甲酸甲酯(cas-rn：28920-43-6，764mg，2.95mmol)于thf(24ml)中的溶液并将反应混合物在室温下搅拌16h。将反应混合物用dcm(100ml)稀释并用1m盐酸(40ml)(ph＝1)酸化。将溶液用dcm(50ml)萃取两次，合并的有机萃取物用硫酸镁干燥，过滤，然后浓缩。通过硅胶柱色谱法(dcm/meoh 95/5)纯化粗产物，得到676mg(100％纯度，73％产率)目标化合物。
[1531]
lc-ms(方法10)：rt＝1.86min；ms(esi pos)：m/z＝473[m+h]+
[1532]1h-nmr(400mhz，dmso-d6)δ[ppm]：-0.008(2.87)，0.008(2.54)，0.778(0.66)，0.800(1.51)，0.808(1.58)，0.832(2.85)，0.856(1.93)，0.865(2.01)，0.889(0.79)，1.125(0.77)，1.157(1.38)，1.182(0.90)，1.215(0.50)，1.235(1.06)，1.517(2.61)，1.538(3.44)，1.563(6.49)，1.593(6.17)，1.610(5.67)，1.636(4.98)，1.660(3.92)，1.684(2.46)，1.719(2.25)，1.747(2.01)，1.846(4.49)，1.858(7.62)，1.868(6.96)，1.901(3.19)，2.010(0.57)，2.073(9.83)，2.189(2.95)，2.200(3.74)，2.241(3.30)，2.276(2.71)，2.307(1.21)，2.327(1.10)，2.366(0.52)，2.398(0.80)，2.428(1.41)，2.456(0.84)，2.670(0.63)，2.710(0.50)，2.816(1.60)，2.833(1.66)，2.849(2.51)，2.862(2.28)，2.877(2.34)，2.895(1.47)，3.040(0.69)，3.075(1.10)，3.086(1.04)，3.101(1.03)，3.121(0.69)，3.690(1.24)，3.724(4.64)，3.744(6.62)，3.756(6.47)，3.777(4.44)，3.823(8.20)，3.852(7.84)，4.120(4.36)，4.137(4.86)，4.148(4.24)，4.191(3.57)，4.202(7.64)，4.212(4.19)，4.261(1.02)，4.276(2.33)，4.291(4.52)，4.316(4.20)，4.328(5.37)，4.346(4.61)，4.370(3.31)，4.383(5.08)，4.395(4.54)，4.411(5.53)，4.422(5.83)，4.456(3.22)，4.595(1.63)，4.761(4.95)，4.773(5.04)，4.788(4.59)，4.800(4.19)，5.364(2.72)，5.393(7.67)，5.422(7.48)，5.451(2.73)，5.510(0.98)，5.540(4.23)，5.553(4.14)，5.585(0.91)，7.282(3.12)，7.300(7.84)，7.319(10.54)，7.337(13.57)，7.355(9.71)，7.366(2.95)，7.377(5.06)，7.399(12.17)，7.420(16.00)，7.438(6.68)，7.521(8.10)，7.539(6.98)，7.613(12.53)，7.631(11.16)，7.646(3.71)，7.665(3.16)，7.847(8.31)，7.865(15.04)，7.884(10.42)，7.908(4.87)，12.429(2.52)。
[1533]
该氨基酸用于fmoc spps。
[1534]
实施例82a
[1535]
(6s)-5-{[(9h-芴-9-基)甲氧基]羰基}-5-氮杂螺[2.4]庚烷-6-羧酸
[1536][1537]
将(6s)-5-氮杂螺[2.4]庚烷-6-羧酸(cas-rn：152723-57-4，1.38g，9.79mmol)溶于水(14ml)中并加入碳酸氢钠(8.23g，97.9mmol)。然后加入1-({[(9h-芴-9-基)甲氧基]羰基}氧基)吡咯烷-2，5-二酮(cas-rn：82911-69-1，3.47g，10.3mmol)于丙酮(21ml)中的溶液并将混合物在室温下搅拌过夜。反应混合物用水稀释并用mtbe萃取两次。将水层用1m盐酸酸化至ph3-4并用dcm萃取3次。合并的有机相用无水硫酸镁干燥，过滤，然后浓缩，得到3.3g(纯度100％，产率93％)目标化合物。
[1538]
lc-ms(方法9)：rt＝1.04min；ms(esi pos)：m/z＝364[m+h]+
[1539]1h-nmr(400mhz，dmso-d6)δ[ppm]：0.497(1.67)，0.510(2.34)，0.527(5.55)，0.559(3.82)，0.567(5.51)，0.590(9.33)，0.598(11.21)，0.619(1.87)，0.636(0.58)，1.106(9.23)，1.714(2.14)，1.723(2.15)，1.745(2.40)，1.755(2.50)，1.764(1.94)，1.772(1.85)，1.796(2.02)，1.804(1.93)，2.086(7.36)，2.280(2.12)，2.301(2.47)，2.311(2.21)，2.333(2.24)，2.390(1.75)，2.412(2.07)，2.421(1.87)，2.443(1.71)，2.524(0.88)，2.594(3.10)，3.076(2.73)，3.219(3.24)，3.245(4.13)，3.283(3.41)，3.309(5.19)，3.385(5.05)，3.403(4.32)，3.410(3.56)，3.429(3.16)，3.747(1.01)，4.160(0.68)，4.175(1.57)，4.187(3.09)，4.192(3.69)，4.209(6.08)，4.218(4.18)，4.224(3.09)，4.237(2.43)，4.247(1.22)，4.254(2.15)，4.272(16.00)，4.284(3.83)，4.297(4.75)，4.306(2.72)，4.427(2.10)，4.435(2.31)，4.449(2.34)，4.457(2.02)，5.754(0.45)，7.301(1.47)，7.318(5.18)，7.320(5.43)，7.325(2.74)，7.336(7.24)，7.339(7.37)，7.344(4.81)，7.348(3.25)，7.352(3.50)，7.354(3.84)，7.357(3.67)，7.403(9.03)，7.422(14.80)，7.440(6.64)，7.640(8.10)，7.647(7.82)，7.658(7.43)，7.666(6.87)，7.884(10.09)，7.902(9.58)。
[1540]
该氨基酸用于fmoc spps。
[1541]
该fmoc氨基酸也由实施例124a中制备的(6s)-5-氮杂螺[2.4]庚烷-6-羧酸而制备。
[1542]
实施例83a
[1543]
(1s，3s，5s，6s)-2-{[(9h-芴-9-基)甲氧基]羰基}-6-(三氟甲基)-2-氮杂双环[3.1.0]己烷-3-羧酸和rel-(1r，3r，5r，6r)-2-{[(9h-芴-9-基)甲氧基]羰基}-6-(三氟甲基)-2-氮杂双环[3.1.0]己烷-3-羧酸
[1544][1545]
将(1s，3s，5s，6s)-6-(三氟甲基)-2-氮杂双环[3.1.0]己烷-3-羧酸(450mg，2.31mmol)溶于水(6ml)中并加入碳酸氢钠(1.94g，23.1mmol)。然后加入1-({[(9h-芴-9-基)甲氧基]羰基}氧基)吡咯烷-2，5-二酮(cas-rn：82911-69-1，817mg，2.42mmol)于丙酮(9ml)中的溶液，并将所得悬浮液在室温下搅拌过夜。反应混合物用水稀释并用mtbe萃取两次。水层用1m盐酸酸化至ph 3-4并用dcm萃取3次。合并的有机相用无水硫酸镁干燥，过滤，然后浓缩。将粗产物通过制备型hplc纯化(柱：reprosil；c18；10μm；125x40mm；溶剂：含有0.1％hcooh的accn/h2o；流速：100ml/min；梯度：0-5.50min 10∶90；3.00min时进样；5.50-17.65min梯度至95∶5；17.65-19.48min至95∶5；19.48-19.66min至10∶90；19.66-20.72min10∶90)，得到571mg(纯度96％，产率57％)目标化合物。
[1546]
lc-ms(方法9)：rt＝1.06min；ms(esi pos)：m/z＝418[m+h]
+
[1547]1h-nmr(400mhz，dmso-d6)δ[ppm]：2.073(0.99)，2.203(4.88)，2.345(2.00)，2.366(1.94)，3.755(2.94)，4.078(1.74)，4.221(1.50)，4.253(4.04)，4.270(5.55)，4.290(4.95)，4.337(2.21)，7.293(3.93)，7.301(4.07)，7.312(9.32)，7.319(8.88)，7.330(6.19)，7.337(5.57)，7.407(9.40)，7.425(16.00)，7.444(7.29)，7.695(5.70)，7.887(13.98)，7.906(12.87)，12.866(0.63)。
[1548]
该物质也可商购获得(cas rn：1986905-54-7)
[1549]
使用rel-(1r，3r，5r，6r)-6-(三氟甲基)-2-氮杂双环[3.1.0]己烷-3-羧酸(烯胺)以类似方法制备外消旋氨基酸。
[1550]
这些氨基酸在spps使用。
[1551]
实施例84a
[1552]
n-(叔丁氧羰基)-l-异亮氨酰基丝氨酸甲酯(非对映异构体的混合物)
[1553][1554]
将n-(叔丁氧基羰基)-l-异亮氨酸(7.50g，32.4mmol)和dl-丝氨酸甲酯-氯化氢(1/1)(5.05g，32.4mmol)溶于二氯甲烷(65ml)中。加入(苯并三唑-1-基氧基)三(二甲基氨基)鏻六氟磷酸酯(14.9g，33.6mmol)和n，n-二异丙基乙胺(11ml，65mmol)并将反应混合物在室温下搅拌过夜。加入二氯甲烷(250ml)，将反应混合物依次用水、盐酸水溶液(1m)和碳酸氢钠水溶液洗涤。将合并的有机萃取物用硫酸镁干燥，过滤，然后浓缩。将粗产物溶于dcm
中并用水彻底洗涤，再用盐酸水溶液(1m)洗涤两次，然后用碳酸氢钠水溶液再洗涤两次。随后将合并的有机相用硫酸镁干燥，过滤，然后浓缩。粗产物直接用于下一步。
[1555]
lc-ms(方法11)：355.2(m+na+)
[1556]
实施例85a
[1557]
2-{(1s，2s)-1-[(叔丁氧基羰基)氨基]-2-甲基丁基}-4，5-二氢-1，3-噁唑-4-羧酸甲酯(非对映异构体的混合物)
[1558][1559]
将n-(叔丁氧基羰基)-l-异亮氨酰基丝氨酸甲酯(实施例84a，4.62g，13.9mmol)溶于二氯甲烷(51ml)中，并将溶液冷却至-78℃。加入n-乙基-n-(三氟-λ
4-硫烷基)乙胺(2.2ml，17mmol)并将反应混合物在-78℃下搅拌1.5小时。将反应用碳酸钾(7.68g，55.6mmol)猝灭，然后冷却至室温。将溶液在室温下搅拌1小时。然后将溶液用dcm(50ml)稀释并用饱和碳酸氢钠水溶液洗涤3次。水相进一步用dcm萃取。合并的有机相用盐水洗涤，用无水硫酸镁干燥，过滤，然后浓缩，得到5.75g所需产物。
[1560]
lc-ms(方法11)：315.2(m+h+)，337.2(m+na+)
[1561]
实施例86a
[1562]
2-{(1s，2s)-1-[(叔丁氧基羰基)氨基]-2-甲基丁基}-1，3-噁唑-4-羧酸甲酯
[1563][1564]
将2-{(1s，2s)-1-[(叔丁氧基羰基)氨基]-2-甲基丁基}-4，5-二氢-1，3-噁唑-4-羧酸甲酯(实施例85a，4.37g，13.9mmol)溶于二氯甲烷(35ml，540mmol)中并将溶液在-40℃下冷却。加入溴(三氯)甲烷(2.7ml，27mmol)，然后还加入2，3，4，6，7，8，9，10-八氢嘧啶并[1，2-a]氮杂卓(4.6ml，31mmol)。将反应溶液在0℃下搅拌2.5小时，然后用dcm稀释。将反应混合物用10％柠檬酸溶液洗涤五次。合并的水层用dcm萃取。合并的有机层用盐水洗涤，经无水硫酸镁干燥，过滤并浓缩。通过硅胶色谱法(梯度∶环己烷/乙酸乙酯(4∶1))纯化粗产物，得到2.2g(50.7％产率)目标化合物。
[1565]
lc-ms(方法10)：335.15(m+na+)
[1566]
实施例87a
[1567]
2-{(1s，2s)-1-[(叔丁氧基羰基)氨基]-2-甲基丁基}-1，3-噁唑-4-羧酸
[1568][1569]
将2-{(1s，2s)-1-[(叔丁氧基羰基)氨基]-2-甲基丁基}-1，3-噁唑-4-羧酸甲酯(实施例86a，2.21g，7.06mmol)溶于甲醇(13.5ml)中。加入氢氧化钠水溶液(4.3ml，3m)并将反应混合物搅拌40分钟，然后浓缩以除去甲醇。将水溶液用1m盐酸水溶液(14ml)酸化并用乙酸乙酯萃取。合并的有机层用无水硫酸镁干燥，过滤，然后减压浓缩，得到12.0g(纯度95％，产率51％)目标化合物。
[1570]
lc-ms(mcw_oa_s1)：rt＝1.13min；ms(esi neg)：m/z＝297[m+h]-[1571]
实施例88a
[1572]
(4r)-3-[(3s)-3-甲基戊酰基]-5，5-二苯基-4-(丙烷-2-基)-1，3-噁唑烷-2-酮
[1573][1574]
将(3s)-3-甲基戊酸(867mg，7.46mmol)于无水thf(50ml)中的溶液冷却至-30℃。滴加2，2-二甲基丙酰氯(920μl，7.5mmol)并将反应混合物在-30℃下搅拌1.5小时。依次加入干燥的氯化锂(347mg，8.17mmol)和(4r)-5，5-二苯基-4-(丙烷-2-基)-1，3-噁唑烷-2-酮(2.00g，7.11mmol)((r)-dioz)，将反应混合物缓慢升至室温并搅拌过夜。将反应混合物用乙酸乙酯和水稀释。分离水层并用乙酸乙酯萃取。将合并的乙酸乙酯层用氯化钠水溶液洗涤，用硫酸镁干燥，过滤，然后浓缩，得到2.87g白色固体。将粗产物溶于含有少量甲醇的dcm中，并通过硅胶柱色谱法(biotage isolera，50g柱体)用环己烷/乙酸乙酯(80∶20)作为洗脱液纯化。合并含有产物的级分，浓缩并干燥，得到2.25g(纯度98％，产率82％)目标化合物。
[1575]
lc-ms(方法10)：rt＝2.69min；ms(esi pos)：m/z＝380[m+h]+
[1576]1h-nmr(400mhz，dmso-d6)δ[ppm]：0.616(13.33)，0.633(13.58)，0.650(7.84)，0.660(16.00)，0.668(15.61)，0.676(15.27)，0.686(7.40)，0.719(0.40)，0.875(12.87)，0.893(12.59)，0.940(0.92)，0.958(1.50)，0.975(2.08)，0.993(2.23)，1.011(1.38)，1.028(0.84)，1.045(1.41)，1.061(1.93)，1.079(1.89)，1.095(1.16)，1.112(0.62)，1.541(0.55)，1.557(1.29)，1.574(1.91)，1.590(1.82)，1.607(1.10)，1.623(0.40)，2.020(0.71)，2.036(1.44)，2.049(1.78)，2.065(1.28)，2.082(0.50)，2.449(2.60)，2.468(2.84)，2.755(2.63)，2.771(2.50)，2.793(2.05)，2.808(1.92)，5.557(5.98)，5.563(5.64)，7.271(2.61)，7.289(6.37)，7.307(5.02)，7.352(5.04)，7.368(10.74)，7.385
(9.60)，7.403(3.47)，7.557(8.45)，7.577(6.54)，7.639(8.45)，7.659(6.92)。
[1577]
实施例89a
[1578]
{(2s，3s)-3-甲基-2-[(4r)-2-氧代-5，5-二苯基-4-(丙烷-2-基)-1，3-噁唑烷-3-羰基]戊基}氨基甲酸苄酯
[1579][1580]
遵循文献方法(sebesta and seebach，helv.chim.acta 2003，86，4061-4072)。将(4r)-3-[(3s)-3-甲基戊酰基]-5，5-二苯基-4-(丙烷-2-基)-1，3-噁唑烷-2-酮(实施例88a，2.20g，5.80mmol)溶于dcm(20ml)中并将溶液冷却至-15℃。滴加氯化钛(iv)溶液(6.1ml，1.0m的dcm溶液，6.1mmol)，同时将温度保持在-15℃。然后加入三乙胺(890μl，6.4mmol)并将反应混合物在-15℃下搅拌30分钟。
[1581]
在单独的圆底烧瓶中，将(甲氧基甲基)氨基甲酸苄酯(1.24g，6.38mmol，cas rn：94471-35-9)于dcm(10ml)中的溶液冷却至0℃。滴加氯化钛(iv)(6.4ml，1.0m于dcm中，6.4mmol)溶液，然后将整个溶液滴加到含有(4r)-3-[(3s)-3-甲基戊酰基]-5，5-二苯基-4-(丙烷-2-基)-1，3-噁唑烷-2-酮的烧瓶中。将反应混合物在0℃下搅拌4小时，然后在室温下搅拌过夜。通过加入氯化铵水溶液将反应淬灭，然后用过量的dcm稀释。分离的有机层用1m hcl水溶液、1m naoh水溶液、然后用氯化钠水溶液洗涤。过滤有机层，然后浓缩，得到3.39g黄色油状物。粗产物通过硅胶柱色谱法(biotage isolera 100g筒)用环己烷/乙酸乙酯(85∶15)作为洗脱液纯化。合并含有产物的级分，浓缩，然后干燥，得到1.50g(纯度96％，产率46％，选择性)非对映选择性为96.3％(文献96％)的目标化合物。
[1582]
lc-ms(方法10)：rt＝2.63min；ms(esi pos)：m/z＝543[m+h]+
[1583]1h-nmr(400mhz，dmso-d6)δ[ppm]：0.429(3.22)，0.446(3.32)，0.480(1.44)，0.498(3.18)，0.516(1.79)，0.595(4.27)，0.611(4.65)，0.643(0.49)，0.663(0.46)，0.768(0.45)，0.786(0.46)，0.874(3.86)，0.891(4.01)，1.098(0.48)，1.397(16.00)，1.993(0.45)，2.010(0.57)，2.023(0.45)，3.146(0.44)，3.169(0.66)，3.180(1.02)，3.192(0.63)，3.206(0.44)，3.222(0.53)，3.243(0.48)，3.816(0.57)，4.920(0.59)，4.952(1.85)，4.978(2.04)，5.010(0.65)，5.539(1.70)，5.544(1.73)，7.187(0.53)，7.201(0.87)，7.282(3.41)，7.289(5.28)，7.306(4.14)，7.322(1.84)，7.342(2.69)，7.362(3.73)，7.385(3.47)，7.405(1.52)，7.566(3.08)，7.584(2.46)，7.662(2.88)，7.681(2.48)。
[1584]
实施例90a
[1585]
(2s，3s)-2-({[(苄氧基)羰基]氨基}甲基)-3-甲基戊酸
[1586][1587]
制备{(2s，3s)-3-甲基-2-[(4r)-2-氧代-5，5-二苯基-4-(丙烷-2-基)-1，3-噁唑烷-3-羰基]戊基}氨基甲酸苄酯(实施例89a，1.49g，2.75mmol)于thf(15ml)中的溶液。加入lioh(105mg，4.39mmol)于水(5ml)中的溶液，并将反应混合物在室温下搅拌24小时。hplc分析表明反应未完成，因此加入另外当量的lioh(65.8mg，2.75mmol)于水(3ml)中的溶液。将反应混合物在室温下搅拌过夜。将反应混合物用乙醚稀释，将混合物搅拌5分钟，然后过滤。滤饼用水和乙醚洗涤，然后分层。水层用1m hcl水溶液酸化至ph 1并用乙醚萃取3次。合并的乙醚相用氯化钠溶液洗涤，用硫酸镁干燥，过滤，然后浓缩。在高真空下干燥后，获得715mg(纯度100％，产率93％)目标化合物。
[1588]
lc-ms(方法10)：rt＝1.71min；ms(esi pos)：m/z＝280[m+h]+
[1589]1h-nmr(400mhz，dmso-d6)δ[ppm]：0.837(6.34)，0.856(14.23)，0.863(13.72)，0.880(12.65)，1.098(0.91)，1.117(1.35)，1.133(1.47)，1.151(1.49)，1.170(0.95)，1.348(0.42)，1.367(1.02)，1.380(1.33)，1.398(1.53)，1.414(1.09)，1.431(0.72)，1.596(0.82)，1.611(1.42)，1.627(1.61)，1.644(1.16)，1.660(0.53)，1.908(3.41)，2.396(1.17)，2.413(2.79)，2.429(2.67)，2.445(1.07)，2.501(16.00)，3.139(4.27)，3.155(7.41)，3.171(4.60)，5.000(15.52)，7.221(1.46)，7.234(2.66)，7.248(1.41)，7.283(0.89)，7.290(0.97)，7.300(2.98)，7.318(5.22)，7.332(11.34)，7.339(12.29)，7.356(5.30)，7.375(1.45)，12.135(3.58)。
[1590]
实施例91a
[1591]
(2s，3s)-2-(氨基甲基)-3-甲基戊酸
[1592][1593]
将10％钯碳(100mg)称量到圆底烧瓶中，并用氩气冲洗烧瓶。加入(2s，3s)-2-({[(苄氧基)羰基]氨基}甲基)-3-甲基戊酸(实施例90a，710mg，2.54mmol)于甲醇(40ml)中的溶液并将反应混合物在常压h2气体下，在室温下搅拌。hplc分析表明在室温下2小时后，反应完成。将反应混合物通过硅胶塞(plug)过滤，用甲醇洗涤滤饼数次。减压浓缩合并的滤液以提供345mg(93％)目标化合物。该化合物直接用于下一步。
[1594]
实施例92a
[1595]
(2s，3s)-2-[({[(9h-芴-9-基)甲氧基]羰基}氨基)甲基]-3-甲基戊酸
[1596][1597]
将(2s，3s)-2-(氨基甲基)-3-甲基戊酸(实施例91a，344mg，2.37mmol)溶于碳酸钠水溶液(32ml，0.15m，4.7mmol)中。将1-({[(9h-芴-9-基)甲氧基]羰基}氧基)吡咯烷-2，5-二酮(959mg，2.84mmol)溶于丙酮(30ml)中，并将该溶液加入到之前的溶液中，将反应混合物在室温下搅拌2小时。将反应混合物浓缩以除去丙酮。水溶液用水稀释并用乙酸乙酯萃取。将水层用1m盐酸水溶液酸化至ph 3-4并用乙酸乙酯萃取。将合并的有机层用盐水洗涤，用无水硫酸镁干燥，过滤，然后浓缩。粗产物通过制备型hplc纯化(柱：reprosil；c18；10μm；125x30mm；溶剂：含有0.1％hcooh的accn/h2o；流速：75ml/min；梯度：0-5.50min(10∶90)；3.00min时进样；5.50-17.65min梯度至95∶5；17.65-19.48min(95∶5)；19.48-19.66min梯度至10∶90；19.66-20.72min(10∶90))，得到795mg(纯度96％，产率88％)目标化合物。
[1598]
lc-ms(方法9)：rt＝1.06min；ms(esi pos)：m/z＝368[m+h]
+
[1599]1h-nmr(400mhz，dmso-d6)δ[ppm]：-0.008(1.04)，0.008(0.54)，0.752(0.73)，0.841(7.69)，0.860(16.00)，0.870(15.28)，0.878(10.54)，0.887(13.22)，1.085(0.4d，1.103(0.99)，1.123(1.45)，1.139(1.58)，1.157(1.60)，1.176(1.00)，1.371(1.16)，1.384(1.50)，1.403(1.71)，1.418(1.23)，1.435(0.83)，1.604(0.88)，1.619(1.50)，1.636(1.70)，1.651(1.23)，2.408(1.27)，2.425(2.91)，2.441(3.13)，2.458(1.88)，2.524(0.87)，2.749(0.82)，3.143(4.18)，3.158(6.08)，3.174(3.40)，4.176(1.25)，4.194(3.04)，4.211(4.04)，4.241(8.74)，4.255(4.27)，4.263(3.35)，7.303(5.42)，7.322(12.94)，7.340(10.81)，7.353(1.98)，7.394(7.49)，7.413(11.83)，7.431(5.34)，7.673(5.88)，7.683(5.84)，7.691(5.19)，7.701(4.30)，7.876(12.54)，7.895(11.30)，12.176(1.21)。
[1600]
该氨基酸用于spps。
[1601]
实施例93a
[1602]
2-[(1s，2s)-1-({[(9h-芴-9-基)甲氧基]羰基}氨基)-2-甲基丁基]-1，3-噁唑-4-羧酸
[1603][1604]
将2-{(1s，2s)-1-[(叔丁氧基羰基)氨基]-2-甲基丁基}-1，3-噁唑-4-羧酸(实施例87a，1.85g，6.21mmol)溶于三氟乙酸(7.6ml，99mmol)中并将溶液搅拌15分钟。然后将该溶液用甲苯稀释并蒸发。再次重复此步骤。将粗产物溶于1，4-二噁烷(20ml，230mmol)和水(20ml)中。加入碳酸钾(1.60g，11.6mmol)和1-{[(9h-芴-9-基甲氧基)羰基]氧基}吡咯烷-2，5-二酮(2.35g，6.96mmol)并将反应混合物在室温下搅拌过夜。将反应混合物用水(65ml)稀释并用10％柠檬酸水溶液酸化至ph 2-3。将反应混合物用乙酸乙酯萃取(3次)，并将合并的有机层用盐水洗涤，用硫酸镁干燥，过滤，然后减压浓缩。将残余物通过硅胶色谱纯化(二氯甲烷-甲醇(3-7％+1％乙酸)，合并含有产物的级分，用甲苯稀释，然后浓缩。然后再次加入甲苯，然后将溶液浓缩，得到2.09g(100％纯度，80％产率)目标化合物。
[1605]
lc-ms(mcw_ft_ms_m1)：rt＝2.01min；ms(esi pos)：m/z＝421[m+h]+
[1606]
该氨基酸用于spps。
[1607]
实施例94a
[1608]
二(丙-2-烯-1-基)氨基](1-甲基-1h-吲唑-5-基)乙酸(外消旋物)
[1609][1610]
将(1-甲基-1h-吲唑-5-基)硼酸(cas-rn：590418-08-9，500mg，2.84mmol)、氧代乙酸(cas-rn：298-12-4，310μl，纯度50％，2.8mmol)和n-(丙-2-烯-1-基)丙-2-烯-1-胺(cas-rn：124-02-7，350μl，2.8mmol)溶于乙腈(7.5ml)中，并将反应混合物在60℃下搅拌40小时。冷却后，过滤所得固体，用乙酸乙酯洗涤并干燥，得到740mg(纯度100％，产率91％)目标化合物。
[1611]
lc-ms(方法9)：rt＝0.44min；ms(esi neg)：m/z＝284[m-h]-[1612]1h-nmr(400mhz，dmso-d6)δ[ppm]：0.008(1.87)，2.073(0.51)，3.110(0.68)，3.125(0.77)，3.147(2.14)，3.161(2.16)，3.176(2.32)，3.193(2.28)，3.213(0.90)，3.230(0.96)，4.030(16.00)，4.531(3.61)，5.110(2.47)，5.134(4.58)，5.174(2.56)，5.752(0.60)，5.768(1.07)，5.778(0.73)，5.783(0.73)，5.794(1.49)，5.810(1.35)，5.820(0.63)，5.826(0.67)，5.837(0.87)，5.852(0.49)，6.514(1.52)，7.432(1.39)，7.435(1.47)，7.454(1.77)，7.457(1.87)，7.602(2.26)，7.624(1.75)，7.699(3.10)，8.041
(4.18)。
[1613]
实施例95a
[1614]
({[(9h-芴-9-基)甲氧基]羰基}氨基)(1-甲基-1h-吲唑-5-基)乙酸(外消旋物)
[1615][1616]
将1，3-二甲基-1，3-二嗪烷-2，4，6-三酮(cas-rn：769-42-6，1.97g，12.6mmol)和四(三苯基膦)钯(0)(48.6mg，42.1μmol)在氩气下加入圆底烧瓶中。然后加入[二(丙-2-烯-1-基)氨基](1-甲基-1h-吲唑-5-基)乙酸(实施例94a，600mg，2.10mmol)的干燥dcm的溶液，并将反应混合物在35℃下搅拌2小时。用水丙酮和水稀释悬浮液，然后浓缩反应混合物以除去dcm。加入碳酸氢钠(2.65g，31.5mmol)(注意气体形成)。将1-({[(9h-芴-9-基)甲氧基]羰基}氧基)吡咯烷-2，5-二酮(780mg，2.31mmol)加入悬浮液中并将反应混合物在室温下搅拌过夜。加入水和碳酸钠水溶液(10％)，将溶液用mtbe萃取两次。水相用柠檬酸水溶液酸化，然后用dcm萃取3次。将合并的有机层用盐水洗涤，用硫酸镁干燥，过滤，然后浓缩。残余物通过制备型hplc纯化(柱：reprosil；c18；10μm；125x40mm；溶剂：含有0.1％hcooh的accn/h2o；流速：100ml/min；梯度：0-5.50min(10∶90)；在3.00min时进样；5.50-17.65min梯度至95∶5；17.65-19.48min(95∶5)；19.48-19.66min梯度至10∶90；19.66-20.72min(10∶90))，得到422mg(纯度100％，产率47％)目标化合物。
[1617]
lc-ms(方法9)：rt＝0.94min；ms(esi pos)：m/z＝428[m+h]
+
[1618]1h-nmr(400mhz，dmso-d6)δ[ppm]：2.073(0.59)，4.041(16.00)，4.198(0.63)，4.215(1.87)，4.231(3.51)，4.253(1.84)，4.269(1.50)，4.280(1.92)，4.298(1.70)，4.319(0.59)，5.256(1.81)，5.276(1.80)，7.275(0.90)，7.293(2.03)，7.320(2.08)，7.339(1.26)，7.388(1.98)，7.406(3.38)，7.424(1.73)，7.445(1.60)，7.467(1.96)，7.621(2.30)，7.643(1.76)，7.744(3.56)，7.763(3.31)，7.792(3.19)，7.875(4.81)，7.893(4.48)，8.063(4.53)，8.213(1.70)，8.232(1.65)，12.835(1.03)。
[1619]
实施例96a
[1620]
({[(9h-芴-9-基)甲氧基]羰基}氨基)(1-甲基-1h-吲唑-5-基)乙酸(对映异构体1)
[1621]
[1622]
将非对映异构体混合物(实施例95a，600mg)溶于甲醇/乙腈(60ml)中，并使用thar超临界流体色谱prep 200仪器进行分离，使用chiralpakad-h(sfc)5μm，250x30mm柱；洗脱液：co2/异丙醇(80∶20)；压力：135bar；洗脱液温度：38℃；流速：100g/min；检测：uv 210nm；进样量0.4ml/进样；在常规操作条件下，1g/min的co2大约相当于1ml/min。
[1623]
序列设置：循环时间＝11.2min
[1624]
在5.8min时收集级分1(对映异构体1)；在7.7分钟之间收集级分2(对映异构体2)。将级分浓缩。
[1625]
使用分析型sfc-ms(agilent，柱：daicel ad-3 3μm 100x4，6mm，洗脱液：co2/甲醇(80∶20)；bpr压力：130bar；bpr温度：60℃；柱温：40℃；流速：3ml/min；uv 210nm)分析级分。
[1626]
未指定两种对映异构体的立体化学。
[1627]
获得185mg对映异构体1(纯度100％，99.5％ee)(未确定立体化学)
[1628]
lc-ms(方法10)：rt＝1.80min；ms(esi pos)：m/z＝428[m+h]
+
[1629]1h-nmr(400mhz，dmso-d6)δ[ppm]：4.040(16.00)，4.197(0.54)，4.214(1.44)，4.230(2.80)，4.251(1.59)，4.268(1.38)，4.278(1.68)，4.295(1.46)，4.316(0.48)，5.241(1.20)，5.261(1.19)，7.275(0.78)，7.294(1.73)，7.321(1.78)，7.339(1.11)，7.386(1.77)，7.394(1.54)，7.405(2.97)，7.412(2.26)，7.423(1.63)，7.444(1.36)，7.466(1.53)，7.617(1.85)，7.638(1.42)，7.742(3.01)，7.761(2.84)，7.787(2.53)，7.874(4.50)，7.893(4.19)，8.058(4.56)，8.183(0.93)，8.201(0.92)。
[1630]
该氨基酸用于spps。
[1631]
实施例97a
[1632]
({[(9h-芴-9-基)甲氧基]羰基}氨基)(1-甲基-1h-吲唑-5-基)乙酸(对映异构体2)
[1633][1634]
使用实施例96a中描述的手性分离方法，获得145mg(纯度100％，94.3％)的对映异构体2(未确定立体化学)。
[1635]
lc-ms(方法10)：rt＝1.80min；ms(esi pos)：m/z＝428[m+h]+
[1636]1h-nmr(400mhz，dmso-d6)δ[ppm]：-0.008(0.78)，0.008(0.70)，4.040(16.00)，4.198(0.41)，4.214(1.16)，4.230(2.33)，4.252(1.27)，4.268(1.03)，4.278(1.36)，4.295(1.14)，4.300(0.99)，5.243(0.98)，5.262(0.98)，7.276(0.59)，7.294(1.34)，7.313(1.11)，7.321(1.38)，7.340(0.86)，7.387(1.36)，7.394(1.12)，7.406(2.32)，7.413(1.70)，7.424(1.22)，7.431(0.89)，7.444(1.06)，7.466(1.21)，7.618(1.52)，7.640(1.16)，7.743(2.38)，7.762(2.23)，7.787(2.02)，7.875(3.68)，7.894(3.45)，8.059(3.94)，8.188(0.73)，8.207(0.72)。
[1637]
该氨基酸用于spps。
[1638]
实施例98a
[1639]
n-[(苄氧基)羰基]-3-溴-l-苯丙氨酸苄酯
[1640][1641]
将n-[(苄氧基)羰基]-3-溴-l-苯丙氨酸(15.3g，40.5mmol)溶于甲醇(113ml)中。加入碳酸铯(6.59g，20.2mmol)并搅拌混合物直至不再有气体逸出。将溶液蒸发至干。将残余物溶于dmf(140ml，1.8mol)中并滴加(溴甲基)苯(5.3ml，44mmol)。短时间后沉淀出固体。悬浮液用乙醚和水稀释。分离有机相，将水相用乙醚萃取两次。合并的有机层用水洗涤，用盐水洗涤，然后用硫酸镁干燥。将结晶残余物溶于乙醚中，加入戊烷后形成沉淀。过滤固体并干燥。蒸发乙醚/戊烷溶液并溶于乙醚中；加入戊烷后形成沉淀。将固体过滤并干燥，得到16.0g(纯度100％，产率84％)目标化合物。
[1642]
lc-ms(方法10)：rt＝2.42min；ms(esi pos)：m/z＝468[m+h]+
[1643]1h-nmr(500mhz，dmso-d6)δ[ppm]：2.874(2.41)，2.895(2.86)，2.902(3.10)，2.923(2.76)，3.071(2.84)，3.082(2.96)，3.099(2.26)，3.109(2.09)，3.636(0.82)，4.336(1.73)，4.347(2.20)，4.353(2.43)，4.357(2.48)，4.363(2.48)，4.373(1.83)，4.383(1.37)，4.921(0.55)，4.963(1.81)，4.989(12.84)，4.994(11.01)，5.020(1.18)，5.043(0.96)，5.093(1.11)，5.119(12.74)，5.139(0.55)，5.147(0.97)，7.174(0.85)，7.211(3.13)，7.226(9.23)，7.241(11.35)，7.248(16.00)，7.263(11.82)，7.298(10.22)，7.313(14.37)，7.316(14.35)，7.321(12.62)，7.332(10.08)，7.336(11.10)，7.344(8.08)，7.351(11.64)，7.366(7.19)，7.379(2.35)，7.414(5.80)，7.429(4.73)，7.499(7.87)，7.880(4.47)，7.896(4.30)。
[1644]
实施例99a
[1645]
3-[(2s)-3-(苄氧基)-2-{[(苄氧基)羰基]氨基}-3-氧代丙基]苯甲酸
[1646][1647]
反应在氩气下进行。在2l高压釜(搅拌速度750rpm)中加入乙酸钯(ii)(2.16g，9.61mmol)、1，1
′‑
双(二苯基膦)二茂铁(10.63g，19.22mmol)和乙酸钾(47.1g，480mmol)。高压釜用氩气冲洗，通过加入干燥的dmf(450ml)溶解试剂。将n-[(苄氧基)羰基]-3-溴-l-苯丙氨酸苄酯(实施例98a，45.0g，96.1mmol)的干燥dmf(930ml)溶液加入高压釜中，然后加入水(18ml)。将高压釜密封，用氮气反复吹扫并短暂搅拌。高压釜用一氧化碳(3bar)加压，然后加热至80℃和3巴，并保持960分钟。反应完成后，将高压釜吹扫、打开，然后将内容物溶于水(13l)中。将反应混合物用乙酸乙酯(7l)萃取3次，将合并的有机层用盐水洗涤，然后浓缩。粗产物通过制备型正相色谱法(10kg硅胶)使用dcm/meoh(95/5)纯化，然后通过制备型色谱法(dcm/meoh梯度，biotage isolera)进一步纯化，得到10.7g(纯度92％)目标化合物。
[1648]
lc-ms(方法10)：rt＝1.92min；ms(esi neg)：m/z＝432.14[m-h]-[1649]
实施例100a
[1650]
n-[(苄氧基)羰基]-3-(叔丁氧基羰基)-l-苯丙氨酸苄酯
[1651][1652]
向3-[(2s)-3-(苄氧基)-2-{[(苄氧基)羰基]氨基}-3-氧代丙基]苯甲酸(实施例99a，18.0g，41.5mmol)中加入二氯甲烷(280ml，4.4mol)。加入环己烷(140ml，1.3mol)、2，2，2-三氯乙亚氨酸叔丁酯(36.3g，166mmol)和(二乙醚)(三氟)硼(1.6ml，12mmol)，并将反应混合物在室温下搅拌。1小时后，加入另外的(二乙醚)(三氟)硼(1.6ml，12mmol)并将反应混合物在室温下搅拌过夜。加入(二乙醚)(三氟)硼(1ml，7.5mmol)并将反应混合物在室温下
搅拌2小时。加入另外的2，2，2-三氯乙亚胺酸叔丁基酯(9.0g，40.5mmol)和另外的(二乙醚)(三氟)硼(1ml，7.5mmol)，并将反应混合物在室温下搅拌过夜。将悬浮液过滤并用dcm∶环己烷(2∶1)洗涤沉淀。该溶液用浓碳酸氢钠水溶液稀释。将合并的水层用dcm萃取两次。然后用硫酸镁干燥合并的有机层，过滤然后蒸发。将所得黑色油状物与环己烷和乙酸乙酯(2％)一起搅拌，过滤沉淀，蒸发滤液。所得黑色油状物通过硅胶柱色谱法(环己烷-乙酸乙酯(9∶1))纯化，得到12.1g(纯度100％，产率60％)目标化合物。
[1653]
lc-ms(方法9)：rt＝1.34min；ms(esi pos)：m/z＝[m+h]+490
[1654]
实施例101a
[1655]
3-(叔丁氧羰基)-l-苯丙氨酸
[1656][1657]
将n-[(苄氧基)羰基]-3-(叔丁氧基羰基)-l-苯丙氨酸苄酯(实施例100a，13.0g，26.6mmol)溶于甲醇(250ml)中。加入10％炭载钯(1.54g)，将混合物在室温下在环境压力下氢化4小时。形成沉淀。将悬浮液溶于甲醇中并在回流下搅拌。将温的溶液在一层硅藻土上过滤，滤饼用甲醇(约1l)洗涤。将合并的滤液浓缩并干燥，得到6.10g(纯度94％，产率81％)目标化合物。
[1658]
lc-ms(方法9)：rt＝0.59min；ms(esi neg)：m/z＝264[m-h]-[1659]1h-nmr(400mhz，dmso-d6)δ[ppm]：1.525(5.74)，1.546(16.00)，2.326(0.50)，2.366(0.48)，2.670(0.50)，2.709(0.48)，3.169(0.57)，7.400(0.89)，7.419(0.66)，7.501(0.76)，7.739(0.84)，7.759(0.85)，7.796(1.02)。
[1660]
实施例102a
[1661]
3-(叔丁氧基羰基)-n-{[(9h-芴-9-基)甲氧基]羰基}-l-苯丙氨酸
[1662][1663]
将3-(叔丁氧基羰基)-l-苯丙氨酸(实施例101a，6.10g，23.0mmol)溶于水(100ml)和丙酮(100ml)中。加入碳酸氢钠(19.3g，230mmol)。加入溶于丙酮(100ml)中的1-({[(9h-芴-9-基)甲氧基]羰基}氧基)吡咯烷-2，5-二酮(8.14g，24.1mmol)溶液，将反应混合物在室
温下搅拌过夜。将混合物用水稀释并用一份mtbe萃取。水层用1m盐酸酸化并用dcm萃取。将合并的有机层用盐水洗涤，用无水硫酸镁干燥，过滤，然后浓缩，得到8.90g(100％纯度，79％产率)目标化合物。产物也存在于有机层中。浓缩有机层。向残余物中加入dcm和1m盐酸并将混合物搅拌5分钟。将残余物过滤并用水和dcm洗涤。分离各层，并用dcm萃取水层。然后用无水硫酸镁干燥合并的有机层，过滤，然后浓缩。通过硅胶快速色谱法(梯度dcm：甲醇(0-10％))纯化粗产物。将残余物溶于乙腈并通过制备型hplc纯化(柱：reprosil；c18；10μm；125x40mm；溶剂：含有0.1％hcooh的accn/h2o；流速：100ml/min；梯度：0-5.50min(10∶90)；在3.00min时进样；5.50-17.65min梯度至95∶5；17.65-19.48min(95∶5)；19.48-19.66min梯度至10∶90；19.66-20.72min(10∶90)。总共获得1.58g(纯度100％，产率14％)目标化合物。
[1664]
lc-ms(方法10)：rt＝2.27min；ms(esi neg)：m/z＝486[m-h]-[1665]1h-nmr(400mhz，dmso-d6)δ[ppm]：1.106(1.34)，1.144(4.63)，1.519(16.00)，1.544(0.64)，2.086(1.34)，2.119(1.97)，2.483(1.16)，2.595(0.68)，3.077(0.43)，3.319(1.89)，4.158(0.42)，4.169(0.81)，4.181(2.03)，4.195(0.76)，4.203(0.48)，4.541(0.43)，7.259(0.80)，7.277(0.76)，7.293(0.68)，7.312(0.44)，7.378(0.62)，7.384(0.86)，7.397(1.11)，7.403(1.62)，7.415(0.62)，7.422(0.90)，7.521(0.63)，7.540(0.45)，7.583(0.68)，7.605(0.86)，7.626(0.62)，7.747(0.59)，7.766(0.57)，7.784(0.68)，7.806(0.63)，7.847(1.02)，7.864(1.58)，7.883(1.42)。
[1666]
该氨基酸用于spps。
[1667]
实施例103a
[1668]
(2s，5r)-2-(2-乙基丁基)-3，6-二甲氧基-5-(丙烷-2-基)-2，5-二氢吡嗪
[1669][1670]
将(2r)-3，6-二甲氧基-2-(丙烷-2-基)-2，5-二氢吡嗪(cas-rn：109838-859，2.9ml，16mmol)溶于无水thf(60ml，740mmol)中，并将溶液冷却至-78℃。在-78℃下搅拌时，在15分钟内缓慢滴加正丁基锂(10ml，1.6m，16mmol)。加入3-(溴甲基)戊烷(5.91g，35.8mmol)并将反应混合物在-78℃下搅拌2小时，然后使其升至室温过夜。将溶液冷却至0℃并用水缓慢淬灭。加入乙醚，搅拌数分钟后，分离有机层。水相用乙醚萃取两次。合并的有机层用盐水洗涤，经硫酸镁干燥，过滤并蒸发。通过硅胶色谱法(环己烷/乙酸乙酯2％)纯化粗产物，得到2.60g(纯度95％，产率57％)目标化合物。
[1671]
lc-ms(方法10)：rt＝2.90min；ms(esi pos)：m/z＝269[m+h]+
[1672]1h-nmr(400mhz，dmso-d6)δ[ppm]：-0.008(0.51)，0.008(0.45)，0.608(6.77)，0.624(6.91)，0.771(3.04)，0.790(7.57)，0.796(3.51)，0.808(4.20)，0.815(7.45)，0.833(3.54)，0.999(6.56)，1.016(6.71)，1.179(0.65)，1.197(0.97)，1.215(0.95)，1.223(0.51)，1.232(0.73)，1.240(0.81)，1.257(1.26)，1.275(1.64)，1.294(1.28)，1.310
(0.57)，1.343(0.55)，1.356(1.67)，1.364(0.66)，1.369(0.83)，1.376(1.52)，1.388(1.40)，1.398(0.66)，1.403(0.63)，1.409(1.04)，1.422(0.43)，1.459(0.56)，1.474(0.63)，1.489(0.45)，1.637(0.66)，1.647(0.68)，1.656(0.56)，1.667(0.69)，1.670(0.69)，1.681(0.54)，1.690(0.48)，1.700(0.44)，2.191(0.54)，2.199(0.55)，2.208(0.71)，2.216(0.71)，2.225(0.52)，2.233(0.51)，3.597(16.00)，3.616(15.85)，3.916(1.08)，3.925(2.24)，3.933(1.46)，3.959(0.67)，3.969(1.06)，3.980(0.99)，3.990(1.00)，4.000(0.49)。
[1673]
实施例104a
[1674]
4-乙基-l-正亮氨酸甲酯
[1675][1676]
将(2s，5r)-2-(2-乙基丁基)-3，6-二甲氧基-5-(丙烷-2-基)-2，5-二氢吡嗪(实施例103a，2.60g，9.69mmol)的甲醇(30ml)溶液冷却至0℃并加入10％的盐酸水溶液(10ml)，然后将反应混合物搅拌2h。蒸发溶液并用dcm和碳酸钠溶液(100ml，2.0m)稀释残余物。分离的水层用dcm萃取两次。合并的有机层用硫酸镁干燥，过滤，然后浓缩，得到3.49g(纯度48％，产率100％)目标化合物。
[1677]
gc-ms(gc-ms方法1)：rt＝3.18min，m/z＝173[m+]
[1678]
实施例105a
[1679]
4-乙基-n-{[(9h-芴-9-基)甲氧基]羰基}-l-正亮氨酸
[1680][1681]
向4-乙基-l-正亮氨酸甲酯(实施例104a，3.97g，纯度48％，11.0mmol)中加入甲醇(100ml)并将所得溶液冷却至0℃。加入氢氧化钠溶液(24ml，1.0m)并将反应混合物在0℃下搅拌1小时，然后升温至室温并再搅拌4小时。将水(80ml)、碳酸氢钠(2.03g，24.2mmol)和碳酸钠(4.00g，37.7mmol)依次加入溶液中。通过旋转蒸发从反应混合物中除去甲醇，并将水溶液用1，4-二噁烷(60ml)稀释。将悬浮液冷却至0℃并加入(9h-芴-9-基)氯甲酸甲酯(cas-rn：28920-43-6，8.54g，33.0mmol)。将反应混合物在室温下搅拌过夜。加入水和mtbe，短暂搅拌，然后分离有机层。水层用mtbe萃取，然后将合并的有机层用5％碳酸钠溶液洗涤。用硫
酸氢钾将合并的水层酸化至ph 1，并将水悬浮液用dcm萃取3次。将合并的有机层用盐水洗涤，经无水硫酸镁干燥，过滤，然后浓缩。粗产物通过制备型hplc纯化(柱：reprosil；c18；10μm；125x40mm；溶剂：含有0.1％hcooh的accn/h2o；流速：100ml/min；梯度：0-5.50min(10∶90)；进样时间为3.00min时；5.50-17.65min梯度至95∶5；17.65-19.48min(95∶5)；19.48-19.66min梯度至10∶90；19.66min-20.76min(10∶90)，得到1.57g(100％纯度，37％产率)目标化合物。
[1682]
lc-ms(方法11)：rt＝1.49min；ms(esi pos)：m/z＝404[m+na]+
[1683]1h-nmr(400mhz，dmso-d6)δ[ppm]：-0.008(3.19)，0.008(3.01)，0.774(6.73)，0.792(16.00)，0.809(13.36)，0.826(14.04)，0.844(7.32)，1.181(0.92)，1.197(1.90)，1.216(3.12)，1.234(3.84)，1.253(2.82)，1.273(1.79)，1.293(2.23)，1.308(3.41)，1.331(4.60)，1.339(4.12)，1.505(0.45)，1.557(3.55)，1.575(5.01)，1.590(3.09)，3.950(1.22)，3.970(2.67)，3.989(2.69)，4.009(1.11)，4.204(1.35)，4.220(3.90)，4.238(7.46)，4.263(5.22)，4.279(3.57)，4.286(5.10)，4.304(3.43)，4.310(2.32)，4.328(1.06)，7.299(2.60)，7.306(2.93)，7.317(5.73)，7.322(5.59)，7.336(3.69)，7.341(3.48)，7.400(6.17)，7.419(10.33)，7.437(4.62)，7.626(4.21)，7.647(3.80)，7.711(8.98)，7.729(8.16)，7.884(9.94)，7.903(9.15)，12.540(0.98)。
[1684]
该氨基酸用于spps。
[1685]
实施例106a
[1686][1687]
n-{[(9h-芴-9-基)甲氧基]羰基}-2，6-二氟-l-苯丙氨酸
[1688]
向2，6-二氟-l-苯丙氨酸甲酯(cas-rn：1192057-28-5，1.03g，4.79mmol)中加入甲醇(18.5ml)并将溶液冷却至0℃。加入氢氧化钠溶液(4.8ml，1.0m)并将反应混合物在室温下搅拌1小时。向溶液中加入水(17ml)、碳酸氢钠(402mg，4.79mmol)和碳酸钠(667mg，6.29mmol)。通过旋转蒸发除去甲醇并用1，4-二噁烷(14ml)稀释水层。将悬浮液冷却至0℃并加入(9h-芴-9-基)氯甲酸甲酯(cas-rn：28920-43-6，1.86g，7.18mmol)。混合物在室温下搅拌2小时。反应混合物用水稀释并用mtbe洗涤。水层用1m盐酸酸化至ph 1并用乙酸乙酯萃取3次。合并的有机层用盐水洗涤，用无水硫酸镁干燥，过滤并浓缩，得到1.74g(纯度100％，产率86％)目标化合物。
[1689]
lc-ms(方法10)：rt＝2.00min；ms(esi pos)：m/z＝424[m+h]+
[1690]1h-nmr(400mhz，dmso-d6)δ[ppm]：1.157(0.74)，1.175(1.50)，1.193(0.76)，1.988(2.79)，2.992(0.74)，3.014(0.87)，3.025(1.22)，3.048(1.17)，3.118(1.24)，3.134(1.32)，3.153(0.81)，3.169(0.76)，3.316(16.00)，4.021(0.71)，4.039(0.70)，4.131(0.95)，4.149(1.39)，4.166(2.72)，4.194(4.15)，4.213(2.65)，4.235(0.72)，7.013(1.71)，7.033(3.28)，7.053(2.07)，7.290(1.33)，7.307(3.44)，7.323(4.18)，7.341
(2.36)，7.357(0.48)，7.397(2.41)，7.415(4.00)，7.434(1.83)，7.639(2.22)，7.659(3.87)，7.679(1.99)，7.818(1.97)，7.839(1.95)，7.876(4.80)，7.894(4.40)，12.793(0.81)。
[1691]
该氨基酸用于spps。
[1692]
实施例107a
[1693]
n-{[(9h-芴-9-基)甲氧基]羰基}-2，5-二氟-l-苯丙氨酸
[1694][1695]
向2，5-二氟-l-苯丙氨酸甲酯(cas-rn：1213491-95-2)(2.27g，10.5mmol)中加入甲醇(40ml)，并将所得溶液冷却至0℃。加入氢氧化钠溶液(11ml，1.0m)并将反应混合物在室温下搅拌1.5h。向溶液中加入水(35ml)、碳酸氢钠(886mg，10.5mmol)和碳酸钠(1.47g，13.9mmol)。通过旋转蒸发除去甲醇并用1，4-二噁烷(30ml)稀释水层。将悬浮液冷却至0℃，加入(9h-芴-9-基)氯甲酸甲酯(cas-rn：28920-43-6，4.09g，15.8mmol)，并将反应混合物在室温下搅拌2h。混合物用水稀释并用mtbe洗涤。将水层用1m盐酸溶液酸化至ph 1并用乙酸乙酯萃取3次。将合并的有机层用盐水洗涤，用无水硫酸镁干燥，过滤并浓缩。粗产物通过硅胶快速色谱(梯度dcm：甲醇0-5％)纯化，然后将残余物溶的乙腈溶液并通过制备型hplc再次纯化(柱：reprosil；c18；10μm；125x40mm；溶剂：含有0.1％hcooh的accn/h2o；流速：100ml/min；梯度：0-5.50min(10∶90)；在3.00min时进样；5.50-17.65min梯度至95∶5；17.65-19.48min(95∶5)；19.48-19.66min至10∶90；19.66-20.72min(10∶90)，得到1.82g(纯度100％，产率41％)目标化合物
[1696]
lc-ms(方法9)：rt＝1.04min；ms(esi pos)：m/z＝424[m+h]
+
[1697]1h-nmr(400mhz，dmso-d6)δ[ppm]：-0.008(2.88)，0.008(2.75)，1.234(0.68)，2.329(0.47)，2.671(0.46)，2.843(2.48)，2.870(3.13)，2.877(3.47)，2.904(3.10)，3.166(3.44)，3.177(3.74)，3.200(2.97)，3.212(2.73)，4.141(1.90)，4.158(5.16)，4.173(9.08)，4.196(12.08)，4.201(12.22)，4.211(8.55)，4.221(7.38)，4.233(3.76)，4.246(2.97)，4.259(2.15)，7.084(0.87)，7.093(1.61)，7.106(2.33)，7.114(3.81)，7.124(3.21)，7.135(2.97)，7.144(2.17)，7.175(3.13)，7.187(4.77)，7.197(6.58)，7.210(7.69)，7.220(4.45)，7.232(3.61)，7.263(4.47)，7.282(9.79)，7.301(7.22)，7.305(7.95)，7.325(4.82)，7.349(0.45)，7.389(6.78)，7.408(11.73)，7.426(5.46)，7.489(0.48)，7.509(0.67)，7.532(0.46)，7.610(7.40)，7.628(12.92)，7.646(6.48)，7.791(6.23)，7.812(6.10)，7.871(16.00)，7.890(14.50)，12.862(3.43)。
[1698]
该氨基酸用于spps。
[1699]
该氨基酸也由实施例126a中制备的2，5-二氟-l-苯丙氨酸甲酯制备。
[1700]
该氨基酸也可以使用实施例106a中描述的方法由2，5-二氟-l-苯丙氨酸盐(cas rn：31105-92-7)制备。
[1701]
实施例108a
[1702]
四氢-2h-吡喃-3-基乙酸苄酯(外消旋物)
[1703][1704]
将四氢-2h-吡喃-3-基乙酸(1.00g，6.94mmol)溶于甲醇(10ml，250mmol)中。加入碳酸铯(1.13g，3.47mmol)并将反应混合物在室温下搅拌直至停止放出气体。然后蒸发溶液。将残余物溶于dmf(10ml)中，加入(溴甲基)苯(1.3ml，11mmol)，并将反应混合物在室温下搅拌过夜。加入另外的(溴甲基)苯(325μl，2.75mmol)并将反应混合物在室温下搅拌3小时。然后用水和乙醚稀释悬浮液。搅拌数分钟后，分离有机层。将水层用乙醚萃取3次。将合并的有机层用盐水洗涤，用无水硫酸镁干燥，过滤，然后浓缩。通过硅胶色谱法(环己烷/乙酸乙酯(85/15))纯化粗产物，得到1.50g(纯度100％，产率92％)目标化合物。
[1705]
lc-ms(方法10)：rt＝1.84min；ms(esi pos)：m/z＝235[m+h]
+
[1706]1h-nmr(500mhz，dmso-d6)δ[ppm]：1.161(0.45)，1.170(0.51)，1.183(0.89)，1.187(0.68)，1.191(0.98)，1.196(0.60)，1.204(0.68)，1.208(1.03)，1.212(0.77)，1.217(1.00)，1.229(0.62)，1.238(0.63)，1.428(0.47)，1.447(0.62)，1.449(0.74)，1.455(0.95)，1.463(0.63)，1.468(0.83)，1.476(1.42)，1.484(0.80)，1.489(0.56)，1.498(0.98)，1.501(0.53)，1.506(1.11)，1.509(1.00)，1.516(1.65)，1.523(1.08)，1.532(0.56)，1.543(0.70)，1.550(0.40)，1.747(0.90)，1.751(0.77)，1.755(0.89)，1.764(0.62)，1.773(0.82)，1.777(0.69)，1.781(0.77)，1.887(0.41)，1.894(0.68)，1.901(0.68)，1.908(0.76)，1.914(0.90)，1.921(0.74)，1.927(0.68)，1.934(0.63)，2.194(1.30)，2.208(1.18)，2.225(3.67)，2.239(3.41)，2.255(3.55)，2.270(3.23)，2.286(1.23)，2.301(1.12)，3.018(2.02)，3.038(2.30)，3.041(2.34)，3.059(2.06)，3.246(1.05)，3.252(1.07)，3.267(1.61)，3.273(1.61)，3.289(1.21)，3.295(1.19)，3.685(0.75)，3.692(1.34)，3.705(1.77)，3.708(1.89)，3.713(2.24)，3.716(2.16)，3.726(1.17)，3.730(1.14)，3.734(1.08)，3.738(0.97)，5.089(16.00)，7.310(0.41)，7.315(0.73)，7.320(0.71)，7.327(2.21)，7.334(1.16)，7.339(1.36)，7.342(1.95)，7.345(2.49)，7.348(2.36)，7.351(1.63)，7.360(9.48)，7.364(11.33)，7.371(1.08)，7.376(3.55)，7.378(3.74)，7.382(1.62)，7.390(0.55)，7.393(1.20)，7.395(0.74)。
[1707]
实施例109a
[1708]
四氢-2h-吡喃-3-基乙酸苄酯
[1709][1710]
将非对映异构体混合物(实施例108a，1.5g)溶于甲醇/乙腈(30ml)中，并使用thar超临界流体色谱prep 200仪器使用chiralpak az-h(sfc)5μm，250x30mm柱进行分离；洗脱
液∶co2/乙醇(90∶10)；压力：135bar；洗脱液温度：35℃；流速：100g/min；检测：uv 210nm；进样量0.4ml/进样；在常规操作条件下，1g/min的co2大约相当于1ml/min。
[1711]
序列设置：循环时间＝11，2min
[1712]
在1.48min收集级分1(对映异构体1)
[1713]
在1.89min之间收集级分2(对映异构体2)
[1714]
合并含有产物的级分并浓缩。
[1715]
使用分析型sfc-ms(agilent，柱：daicel az-3 3μm 100x4，6mm，洗脱液∶co2/乙醇(90∶10)；bpr压力：130bar；bpr温度：60℃；柱温：40℃；流速：3ml/min；uv 210nm)分析级分。
[1716]
未指定两种对映异构体的立体化学。
[1717]
获得具有99.5％ee(641mg(纯度100％))的四氢-2h-吡喃-3-基乙酸苄酯(对映异构体1)。
[1718]
lc-ms(方法9)：rt＝0.98min；ms(esi pos)：m/z＝235[m+h]+
[1719]1h-nmr(500mhz，dmso-d6)δ[ppm]：1.161(0.45)，1.170(0.51)，1.183(0.89)，1.187(0.67)，1.191(0.98)，1.196(0.61)，1.204(0.67)，1.209(1.03)，1.213(0.77)，1.217(1.00)，1.230(0.61)，1.238(0.62)，1.428(0.48)，1.447(0.61)，1.449(0.75)，1.455(0.95)，1.463(0.64)，1.468(0.82)，1.476(1.41)，1.484(0.79)，1.489(0.56)，1.498(0.98)，1.501(0.52)，1.507(1.05)，1.510(1.00)，1.516(1.65)，1.523(1.07)，1.532(0.55)，1.543(0.70)，1.747(0.90)，1.751(0.78)，1.755(0.89)，1.764(0.63)，1.773(0.81)，1.777(0.69)，1.781(0.78)，1.887(0.40)，1.894(0.69)，1.901(0.68)，1.908(0.76)，1.914(0.91)，1.921(0.74)，1.927(0.67)，1.934(0.64)，2.194(1.30)，2.208(1.18)，2.225(3.69)，2.239(3.42)，2.255(3.56)，2.270(3.24)，2.286(1.23)，2.301(1.12)，3.019(2.02)，3.038(2.29)，3.041(2.36)，3.060(2.07)，3.246(1.05)，3.252(1.08)，3.268(1.63)，3.273(1.63)，3.289(1.24)，3.295(1.23)，3.686(0.75)，3.692(1.34)，3.705(1.73)，3.708(1.90)，3.713(2.19)，3.715(2.20)，3.726(1.19)，3.730(1.13)，3.734(1.08)，3.738(0.97)，5.089(16.00)，7.310(0.40)，7.315(0.74)，7.321(0.69)，7.328(2.23)，7.334(1.13)，7.339(1.36)，7.342(1.99)，7.345(2.52)，7.347(2.34)，7.350(1.66)，7.360(9.33)，7.364(11.16)，7.371(1.09)，7.376(3.58)，7.378(3.72)，7.382(1.63)，7.390(0.54)，7.393(1.20)，7.396(0.75)。
[1720]
还获得了具有99.5％ee(611mg(纯度100％))的四氢-2h-吡喃-3-基乙酸苄酯(对映异构体2)。
[1721]
实施例110a
[1722]
四氢-2h-吡喃-3-基乙酸(对映异构体1)
[1723][1724]
将10％钯碳(84.0mg)在氩气下用甲醇润湿。加入四氢-2h-吡喃-3-基乙酸苄酯溶液(实施例109a，641mg，2.74mmol)。然后将反应混合物在环境压力和室温下氢化2小时。通过在硅藻土层上过滤除去催化剂，用甲醇洗涤滤饼，并通过旋转蒸馏除去溶剂，得到364mg(100％纯度，92％产率)目标化合物。
[1725]
gc-ms(gc-ms方法1)：rt＝3.57min，m/z＝144[m+]
[1726]1h-nmr(500mhz，dmso-d6)δ[ppm]：1.145(1.98)，1.154(2.21)，1.166(4.03)，1.171(3.11)，1.175(4.45)，1.180(2.85)，1.188(3.11)，1.192(4.69)，1.196(3.55)，1.201(4.57)，1.213(2.68)，1.222(2.75)，1.428(1.03)，1.436(1.93)，1.445(1.35)，1.449(1.65)，1.455(2.72)，1.458(3.25)，1.463(4.18)，1.471(2.92)，1.476(3.82)，1.484(6.50)，1.493(3.67)，1.498(2.58)，1.506(5.73)，1.514(6.62)，1.521(7.99)，1.528(5.13)，1.537(2.67)，1.548(3.18)，1.554(1.80)，1.563(0.64)，1.759(1.78)，1.767(4.22)，1.771(3.85)，1.775(4.26)，1.784(2.89)，1.793(3.85)，1.797(3.49)，1.801(3.85)，1.809(1.56)，1.824(0.81)，1.832(1.31)，1.839(1.87)，1.846(3.17)，1.853(3.16)，1.859(3.72)，1.866(4.34)，1.873(3.58)，1.879(3.34)，1.886(3.00)，1.893(1.65)，1.900(1.44)，1.908(0.69)，2.023(6.18)，2.036(5.11)，2.054(16.00)，2.068(14.33)，2.087(15.54)，2.101(13.64)，2.118(5.69)，2.133(5.09)，2.999(9.23)，3.018(10.90)，3.021(11.02)，3.040(9.47)，3.134(0.64)，3.247(6.14)，3.253(6.29)，3.269(9.57)，3.275(9.49)，3.291(7.06)，3.297(6.90)，3.586(0.59)，3.696(3.77)，3.703(6.42)，3.709(4.14)，3.717(8.63)，3.725(11.12)，3.739(5.37)，3.743(5.40)，3.747(5.21)，3.750(4.68)。
[1727]
该物质用于spps。
[1728]
实施例111a
[1729]
(3s)-3-[(2s，5r)-3，6-二甲氧基-5-(丙烷-2-基)-2，5-二氢吡嗪-2-基]环己-1-酮
[1730][1731]
将(2r)-3，6-二甲氧基-2-(丙烷-2-基)-2，5-二氢吡嗪(4.61g，25.0mmol)溶于thf(20ml)中并冷却至-78℃。在搅拌下滴加丁基锂(16ml，1.6m，25mmol)。在-78℃下继续搅拌15分钟。加入锂(氮杂亚芳基(nidylidene)亚甲基)(噻吩-2-基)铜(100ml，0.25m，25mmol)并将混合物在-78℃下搅拌15分钟。加入环己-2-烯-1-酮(2.4ml，25mmol)于thf(10ml)中的溶液并将反应混合物在-78℃下搅拌10分钟，然后在环境温度下进一步搅拌2小时。用水淬灭反应并用乙酸乙酯萃取两次。将合并的有机层用碳酸氢钠溶液和盐水洗涤，用无水硫酸镁干燥，过滤，然后减压浓缩残余物，得到6.8g无色油状物。通过硅胶快速色谱法(梯度环己烷-乙酸乙酯85-15)纯化粗产物，得到5.7g(90％纯度，64％产率)目标化合物。
[1732]
lc-ms(方法12)：rt＝3.14min；ms(esi pos)：m/z＝281.2[m+h]
+
[1733]1h-nmr(400mhz，dmso-d6)δ[ppm]：0.587(0.94)，0.604(1.17)，0.617(6.04)，0.634(6.04)，0.971(0.51)，0.988(5.87)，0.995(1.32)，1.005(5.67)，1.012(0.98)，1.032(0.88)，1.049(0.91)，1.575(0.55)，1.596(0.42)，1.607(0.61)，1.750(0.61)，1.760(0.78)，1.784(1.05)，1.794(1.28)，1.816(0.50)，1.837(0.50)，1.843(0.57)，1.874(0.43)，1.979(0.82)，2.012(1.26)，2.024(0.52)，2.032(0.55)，2.044(0.95)，2.057
(0.40)，2.122(0.46)，2.148(0.80)，2.156(1.00)，2.164(1.00)，2.173(0.67)，2.181(0.70)，2.190(0.69)，2.199(0.54)，2.207(0.59)，2.225(0.71)，2.242(0.64)，2.259(0.74)，2.275(0.64)，2.294(0.45)，2.310(0.65)，2.319(0.47)，2.329(0.48)，2.338(0.58)，2.348(0.54)，3.602(0.89)，3.631(16.00)，3.642(4.12)，3.652(14.26)，3.902(1.14)，3.911(2.10)，3.920(1.33)，3.943(0.45)，4.069(1.14)，4.078(1.82)，4.086(0.98)，4.492(0.55)，5.674(0.91)。
[1734]
实施例112a
[1735]
(1r，3s)-3-[(2s，5r)-3，6-二甲氧基-5-(丙烷-2-基)-2，5-二氢吡嗪-2-基]环己-1-醇(存在2种立体异构体)
[1736][1737]
将(3s)-3-[(2s，5r)-3，6-二甲氧基-5-(丙烷-2-基)-2，5-二氢吡嗪-2-基]环己-1-酮(实施例111a，5.70g，20.3mmol)溶于甲醇(50ml)中并冷却至0℃。加入四氢硼酸钠(769mg，20.3mmol)并将反应混合物在室温下搅拌过夜。加入另外的四氢硼酸钠(769mg，20.3mmol)并在室温下继续搅拌。该步骤用0.5当量四氢硼酸钠再重复2次。将甲醇蒸发并用水和乙酸乙酯稀释残余物。搅拌数分钟后分层。将水层用乙酸乙酯萃取。将合并的有机层用盐水洗涤，用无水硫酸镁干燥，过滤，将残余物减压浓缩，得到5.7g黄色油状物。通过硅胶快速色谱法(梯度环己烷-环己烷乙酸乙酯5％-30％)纯化粗产物，得到4.95g(产率86％)目标化合物。
[1738]
lc-ms(方法10)：rt＝1.87min；ms(esi pos)：m/z＝283.2[m+h]+；rt＝1.91min；ms(esi pos)：m/z＝283.2[m+h]
+
[1739]1h-nmr(400mhz，dmso-d6)δ[ppm]：0.589(1.83)，0.600(6.10)，0.605(2.52)，0.617(6.02)，0.739(0.91)，0.768(0.96)，0.798(0.42)，0.898(0.47)，0.934(0.50)，0.997(6.80)，1.014(7.00)，1.157(0.53)，1.175(0.92)，1.193(0.73)，1.203(0.72)，1.211(0.59)，1.227(0.47)，1.235(0.72)，1.243(0.51)，1.313(0.52)，1.321(0.63)，1.352(0.99)，1.398(2.43)，1.485(0.59)，1.515(0.56)，1.668(0.44)，1.676(0.56)，1.684(0.44)，1.708(0.51)，1.745(0.57)，1.774(0.54)，1.879(0.58)，1.887(0.56)，1.988(1.39)，2.185(0.54)，2.193(0.57)，2.202(0.73)，2.210(0.75)，2.219(0.55)，2.227(0.55)，3.611(7.06)，3.617(3.03)，3.622(16.00)，3.629(14.28)，3.845(0.55)，3.854(0.50)，3.862(1.17)，3.871(2.39)，3.880(1.79)，3.933(1.11)，3.942(1.74)，3.951(0.86)，4.215(0.59)，4.223(0.57)，4.431(2.16)，4.443(2.10)。
[1740]
实施例113a
[1741]
(2s)-氨基[(1s)-3-羟基环己基]乙酸甲酯(存在2种立体异构体)
[1742][1743]
将(3s)-3-[(2s，5r)-5-异丙基-3，6-二甲氧基-2，5-二氢吡嗪-2-基]环己醇(实施例112a，4.95g，17.5mmol)溶于甲醇(45ml)中，并将溶液冷却至0℃。加入10％盐酸水溶液(15ml)，将反应混合物在0℃下短时间搅拌，然后在室温下搅拌3小时。浓缩反应混合物，用dcm稀释残余物，然后加入碳酸钠水溶液(150ml，2.0m，300mmol)。将混合物搅拌，然后分层。将水层用dcm萃取两次。将合并的有机层用无水硫酸镁干燥，过滤，然后浓缩。通过硅胶快速色谱法(dcm：甲醇95+5)纯化粗产物，得到1.92g(产率58％)目标化合物。
[1744]1h-nmr(400mhz，dmso-d6)δ[ppm]：-0.008(1.04)，0.008(0.93)，0.760(0.69)，0.777(0.71)，0.834(0.61)，0.867(1.92)，0.875(1.16)，0.885(1.54)，0.892(1.18)，0.910(0.45)，0.922(0.61)，0.942(1.05)，0.951(0.95)，0.973(1.17)，0.981(1.06)，1.003(0.54)，1.012(0.50)，1.157(0.67)，1.165(0.41)，1.190(0.65)，1.198(0.44)，1.223(0.42)，1.375(0.69)，1.407(0.79)，1.498(0.52)，1.513(0.89)，1.519(0.95)，1.527(0.74)，1.549(0.69)，1.633(2.72)，1.671(0.69)，1.680(0.78)，1.753(1.26)，1.783(1.67)，1.959(0.49)，2.086(0.85)，3.096(0.46)，3.110(0.48)，3.138(1.12)，3.151(1.10)，3.162(1.07)，3.175(1.02)，3.276(0.43)，3.288(0.55)，3.593(0.71)，3.603(4.85)，3.612(16.00)，3.626(1.87)，3.633(0.96)，3.637(1.57)，4.232(0.60)，4.240(0.55)，4.481(1.83)，4.492(1.73)，5.754(0.68)。
[1745]
实施例114a
[1746]
(2s)-2-{[(9h-芴-9-基甲氧基)羰基]氨基}-2-[(1s)-3-羟基环己基]乙酸(存在2种立体异构体)
[1747][1748]
将(2s)-氨基[(1s)-3-羟基环己基]乙酸甲酯(实施例113a，1.92g，10.3mmol)加入甲醇(40ml)中并将溶液冷却至0℃。加入氢氧化钠溶液(10ml，1.0m，10mmol)并将反应混合物在室温下搅拌1.5小时，然后在50℃下搅拌1小时。向溶液中加入水(37ml)、碳酸氢钠(861mg，10.3mmol)和碳酸钠(1.43g，13.5mmol)。蒸发甲醇并用1，4-二噁烷(30ml)稀释水层。将悬浮液冷却至0℃并加入(9h-芴-9-基)氯甲酸甲酯(cas-rn：28920-43-6，3.98g，15.4mmol)。将混合物在室温下搅拌过夜。加入水和mtbe并分离有机层。将水层酸化并用dcm萃取3次。将合并的有机层用盐水洗涤，经无水硫酸镁干燥并过滤。通过硅胶快速色谱法(dcm：甲醇/hoac 95+5+1)纯化粗产物，得到2.22g(产率55％)目标化合物。
[1749]
lc-ms(方法10)：rt＝1.62min；ms(esi pos)：m/z＝396.18[m+h]+；rt＝1.67min；ms(esi pos)：m/z＝396.18[m+h]
+
[1750]
实施例115a
[1751]
(2s)-2-({[(9h-芴-9-基)甲氧基]羰基}氨基)-2-[(1s，3r)-3-羟基环己基]乙酸(非对映异构体1)
[1752][1753]
非对映异构体1
[1754]
将(2s)-{[(9h-芴-9-基甲氧基)羰基]氨基}[(1s)-3-羟基环己基]乙酸(实施例114a，2.22g)使用实施例96a中描述的方法通过手性色谱纯化得到890mg(纯度100％，产率40％，99％ee)非对映异构体1。
[1755]
lc-ms(方法10)：rt＝1.62min；ms(esi pos)：m/z＝396.2[m+h]
+
[1756]
h-nmr(400mhz，dmso-d6)δ[ppm]：0.878(0.88)，0.909(1.80)，0.940(2.23)，0.962(1.87)，0.986(2.99)，1.025(4.63)，1.053(3.69)，1.083(1.14)，1.151(1.18)，1.184(2.16)，1.217(1.71)，1.249(0.53)，1.492(2.55)，1.523(2.32)，1.668(2.86)，1.701(2.42)，1.779(6.54)，1.802(4.90)，2.073(4.22)，3.875(0.46)，3.900(3.08)，3.916(3.51)，3.921(3.52)，3.936(2.67)，4.197(1.31)，4.211(3.35)，4.223(9.23)，4.238(12.01)，4.242(10.59)，4.253(6.34)，4.270(3.91)，4.296(0.72)，4.563(2.04)，7.312(6.21)，7.331(14.61)，7.349(9.50)，7.402(9.30)，7.420(15.31)，7.439(6.83)，7.603(4.81)，7.624(4.95)，7.752(11.74)，7.770(10.65)，7.884(16.00)，7.903(14.82)，8.155(0.69)。
[1757]
该氨基酸用于spps。
[1758]
实施例116a
[1759]
(2s)-2-({[(9h-芴-9-基)甲氧基]羰基}氨基)-2-[(1s，3s)-3-羟基环己基]乙酸(非对映异构体2)
[1760][1761]
在(2s)-({[(9h-芴-9-基)甲氧基]羰基}氨基)[(1s，3s)-3-羟基环己基]乙酸(实施例114a)的非对映异构混合物的手性色谱过程中也分离出280mg(95％纯度，12％产率)非
对映异构体2。
[1762]
lc-ms(方法10)：rt＝1.67min；ms(esi pos)：m/z＝396.2[m+h]
+
[1763]1h-nmr(400mhz，dmso-d6)δ[ppm]：0.862(0.81)，0.879(0.71)，1.024(0.76)，1.055(1.68)，1.084(1.84)，1.113(1.00)，1.274(1.39)，1.308(2.53)，1.339(1.79)，1.404(4.60)，1.430(3.90)，1.498(3.23)，1.531(6.31)，1.566(4.20)，1.609(2.04)，1.640(1.55)，2.179(1.80)，2.328(0.51)，2.670(0.47)，3.820(0.62)，3.839(0.86)，3.858(0.76)，3.904(4.71)，3.920(3.46)，3.925(3.34)，3.941(2.46)，4.195(1.38)，4.210(3.69)，4.223(9.20)，4.238(10.72)，4.244(8.66)，4.254(7.18)，4.272(6.16)，7.309(5.80)，7.328(13.47)，7.346(8.67)，7.400(9.17)，7.419(15.07)，7.437(6.77)，7.487(3.68)，7.508(3.60)，7.546(0.67)，7.637(0.61)，7.748(11.33)，7.767(10.18)，7.883(16.00)，7.901(14.74)。
[1764]
该氨基酸用于spps。
[1765]
实施例117a
[1766]
3-({[(9h-芴-9-基甲氧基)羰基]氨基}甲基)环己烷羧酸(外消旋物)
[1767][1768]
将3-{[(叔丁氧羰基)氨基]甲基}环己烷羧酸(外消旋物)(cas rn：145149-55-9，1.00g，3.89mmol)溶于二氯甲烷(20ml，310mmol)中，加入三氟乙酸(20ml，260mmol)，并将反应混合物在室温下搅拌30分钟。蒸发溶液并将残余物溶于丙酮(15ml)中。加入水(10ml)、碳酸氢钠(6.53g，77.7mmol)和1-({[(9h-芴-9-基)甲氧基]羰基}氧基)吡咯烷-2，5-二酮(cas-rn：82911-69-11.38g，4.08mmol)。将悬浮液在室温下搅拌过夜。加入碳酸氢钠(6.53g，77.7mmol)并使反应混合物在室温下搅拌1小时。将悬浮液用水稀释并用mtbe萃取。水层用盐酸水溶液(1m)酸化，然后用乙酸乙酯萃取3次。将合并的有机层用盐水洗涤，用硫酸镁干燥，过滤，然后浓缩并蒸发，得到含有产物的三个级分：130mg(纯度96％，产率8％)，127mg(纯度96％，产率8％)，51.0mg(产率3％)。
[1769]
lc-ms(方法9)：rt＝1.01min；ms(esi pos)：m/z＝380[m+h]
+
[1770]1h-nmr(400mhz，dmso-d6)δ[ppm]：0.736(0.49)，0.759(1.44)，0.790(1.73)，0.821(0.80)，0.851(0.96)，0.882(2.75)，0.913(2.99)，0.944(1.23)，1.083(0.45)，1.120(0.52)，1.153(1.38)，1.182(3.81)，1.206(3.18)，1.235(1.28)，1.418(1.48)，1.598(1.97)，1.630(2.23)，1.717(2.24)，1.739(1.48)，1.747(1.53)，1.835(1.93)，1.862(3.95)，1.897(2.04)，2.074(2.00)，2.123(1.19)，2.130(1.10)，2.152(2.02)，2.174(0.85)，2.181(0.95)，2.524(1.06)，2.785(0.60)，2.801(1.06)，2.818(2.22)，2.835(3.08)，2.849(2.89)，2.862(3.29)，2.878(2.21)，2.895(1.16)，2.911(0.57)，4.188(1.46)，4.206(3.84)，4.223(3.22)，4.238(0.88)，4.253(0.91)，4.287(11.07)，4.304
(6.87)，4.333(0.64)，4.351(0.40)，4.451(0.68)，7.306(6.09)，7.324(16.00)，7.341(10.19)，7.392(6.85)，7.410(10.96)，7.429(4.86)，7.459(0.43)，7.626(0.73)，7.643(0.75)，7.683(9.67)，7.702(8.66)，7.875(11.34)，7.894(10.10)，12.028(1.95)。
[1771]
该氨基酸用于spps。
[1772]
实施例118a
[1773]
(2s)-2-(吗啉-4-基)丙酸苄酯
[1774][1775]
将l-丙氨酸(589mg，6.61mmol)、1-溴-2-(2-溴乙氧基)乙烷(910μl，7.3mmol)和碳酸钠溶于乙醇中，并将溶液回流2天。使悬浮液达到室温并将悬浮液过滤。蒸发滤液，悬浮于乙醇(30ml)中，加入3m盐酸调节ph(至ph＝3)。将悬浮液过滤，蒸发滤液。将残余物溶于dmf(20ml)中。加入碳酸铯(1.08g，3.30mmol)和(溴甲基)苯(1.6ml，13mmol)并将混合物在室温下搅拌2天。然后加入水，然后通过反相hplc纯化溶液(柱：reprosil；c18；10μm；125x30mm；洗脱液含0.1％hcooh的acn/h2o改性剂；流速：75ml/min；梯度：0-5.50min 10/90；进样直至3.00min；5.50-17.65min梯度至95/5；17.65-19.48min 95/5；19.48-19.66min梯度至10/90；19.66-20.72min 10/90。合并所需级分并冻干以得到800mg(98％纯度，48％产率)为无色油状物的目标化合物；ee＞99％。
[1776]
lc-ms(方法9)：rt＝0.51min；ms(esi pos)：m/z＝250[m+h]
+
[1777]1h-nmr(500mhz，dmso-d6)δ[ppm]：1.191(10.46)，1.205(10.52)，2.462(0.66)，2.469(0.77)，2.473(0.76)，2.485(1.55)，2.521(1.43)，2.562(0.63)，3.330(0.93)，3.344(2.66)，3.358(2.62)，3.372(0.86)，3.499(0.46)，3.506(0.63)，3.511(0.45)，3.521(2.34)，3.530(3.52)，3.532(3.50)，3.538(3.54)，3.549(2.18)，3.564(0.56)，5.101(0.60)，5.126(5.99)，5.131(5.75)，5.156(0.57)，7.323(0.69)，7.327(0.52)，7.332(1.27)，7.341(1.23)，7.343(0.94)，7.350(1.14)，7.358(0.50)，7.369(1.15)，7.377(16.00)，7.386(6.48)，7.392(0.46)。
[1778]
实施例119a
[1779]
(2s)-2-(吗啉-4-基)丙酸
[1780][1781]
在氩气下将钯(10％于活性炭上)(100mg)用甲醇润湿。之后，将(2s)-2-(吗啉-4-基)丙酸苄酯(实施例118a，800mg，3.21mmol)溶于甲醇(100ml)中，并在氩气下将湿润的钯碳加入到溶液中。然后将悬浮液在环境压力和氢气气氛下氢化2小时。用氩气吹扫容器中的氢气并将悬浮液通过硅藻土过滤。蒸发滤液，将残余物溶于mecn/h2o中并冻干，提供501mg
(＞99％纯度，98％产率)为浅棕色固体的目标化合物。
[1782]
lc-ms(方法9)：rt＝0.16min；ms(esi pos)：m/z＝160[m+h]
+
[1783]1h-nmr(500mhz，氧化氘)δ[ppm]：1.519(16.00)，1.534(15.96)，3.695(1.39)，3.709(4.02)，3.724(3.89)，3.738(1.30)。
[1784]
实施例120a
[1785]
1-(叔丁氧基羰基)-4-亚乙基-l-脯氨酸
[1786][1787]
将甲基(三苯基)溴化鏻(34.7g，97.1mmol)悬浮于400ml thf中。在室温下滴加khmds的甲苯溶液(146.6ml，15％w/v，97.1mmol)并在室温下搅拌1小时。之后，将溶液冷却至0℃，并分次加入1-(叔丁氧基羰基)-4-氧代-l-脯氨酸(11.1g，48.6mmol)。将混合物在室温下搅拌2.5小时。向反应混合物中加入水。将混合物用10％柠檬酸溶液制成微酸性，并用乙酸乙酯萃取3次。将合并的乙酸乙酯层用饱和氯化钠水溶液洗涤，用硫酸镁干燥，然后真空干燥，得到浓稠的橙色树脂。粗产物无需进一步纯化即可用于下一步。
[1788]
实施例121a
[1789]
2-甲基(2s)-4-亚甲基吡咯烷-1，2-二羧酸1-叔丁基酯
[1790][1791]
将粗1-(叔丁氧基羰基)-4-亚乙基-l-脯氨酸(实施例120a)(11.0g，48.6mmol)溶于dmf(60ml)中。加入碳酸钾(10.1g，72.9mmol)，然后加入碘甲烷(4.5ml，73mmol)，然后将混合物在室温下搅拌过夜。旋转蒸发除去dmf，加入乙酸乙酯，然后将混合物用水洗涤一次。将水相用乙酸乙酯再萃取一次。将合并的有机相用饱和氯化钠水溶液洗涤，用硫酸镁干燥，然后真空干燥，得到粗产物。将粗产物溶于dcm中并通过正相色谱法使用biotage isolara快速色谱系统纯化，使用环己烷-乙酸乙酯(85/15)洗脱液，得到10.2g(80％)为黄色油状物的目标化合物。
[1792]
lc-ms(方法10)：rt＝1.77min；ms(esi pos)：m/z＝186m-c4h8
+
[1793]1h-nmr(500mhz，dmso-d6)δ[ppm]：1.339(16.00)，1.405(10.53)，3.313(10.02)，3.627(3.90)，3.938(2.21)，3.967(0.60)，4.331(0.51)，4.337(0.54)，4.350(0.57)，4.356(0.59)，4.363(0.47)，4.367(0.42)，4.992(1.33)，5.019(1.17)。
[1794]
实施例122a
[1795]
6-甲基(6s)-5-氮杂螺[2.4]庚烷-5，6-二羧酸5-叔丁基酯
[1796][1797]
在氩气下，将二乙基锌(22ml，1.0m的己烷溶液，22mmol)溶于无水dcm(27ml)中。将溶液冷却至5℃，然后在1小时内滴加tfa(1.7ml，22mmol)于dcm(17ml)中的溶液。将溶液在5℃下再搅拌30分钟。快速滴加二碘甲烷(1.8ml，22mmol)于无水dcm(5ml)中的溶液，并将所得溶液在5℃下搅拌30分钟。之后，将2-甲基(2s)-4-亚甲基吡咯烷-1，2-二羧酸1-叔丁基酯(实施例121a)(2.70g，11.2mmol)于无水dcm(5ml)中的溶液加入到反应混合物中。将反应混合物在解冻的冰浴中搅拌90小时，然后用饱和氯化铵水溶液猝灭。分离各相，将水相用dcm再萃取一次。合并有机相，用硫酸镁干燥，然后蒸发，得到1.57g为黄色油状的粗产物。将该油状物溶于乙酸乙酯(54ml)中，依次加入二碳酸二叔丁酯(2.6ml，11mmol)和三乙胺(3.1ml，22mmol)，然后将反应混合物在室温下搅拌过夜。使用tlc(石油醚/乙酸乙酯10/1；用茚三酮染色)控制反应。使用biotage isolara快速色谱系统(100g biotage cartridge ultra)通过正相色谱纯化粗产物，使用石油醚-乙酸乙酯(ea)(2％至18％ea)的洗脱液梯度，得到1.02g为无色油状物的目标化合物。
[1798]
实施例123a
[1799]
(6s)-5-(叔丁氧基羰基)-5-氮杂螺[2.4]庚烷-6-羧酸
[1800][1801]
将6-甲基(6s)-5-氮杂螺[2.4]庚烷-5，6-二羧酸5-叔丁基酯(实施例122a)(2.50g，9.79mmol)溶于50％thf/水(40ml)中。加入氢氧化锂(703mg，29.4mmol)，并将反应混合物在室温下搅拌过夜。使用旋转蒸发器除去thf，并用另外的水(20ml)水稀释水溶液并用mtbe洗涤一次。将分离的水相用1m盐酸(30ml)酸化，然后用dcm萃取两次。将合并的有机相用硫酸镁干燥，过滤，然后浓缩，得到2.4g为无色油状物的目标化合物。
[1802]
实施例124a
[1803]
(6s)-5-氮杂螺[2.4]庚烷-6-羧酸
[1804][1805]
将(6s)-5-(叔丁氧基羰基)-5-氮杂螺[2.4]庚烷-6-羧酸(实施例123a)(2.36g，9.79mmol)溶于dcm(50ml)中。加入三氟乙酸(10ml，250mmol)，并将反应混合物在室温下搅拌2小时。使用tlc(dcm/meoh 9/1)进行反应控制。蒸发溶液，真空干燥粗产物，得到为棕色残余物的目标化合物。这直接用于下一步(fmoc保护，参见实施例82a)。
[1806]
实施例15a
[1807]
(2s，sr)-2-[(2，5-二氟苯基)甲基]-3，6-二甲氧基-5-(丙烷-2-基)-2，5-二氢吡嗪
[1808][1809]
反应在氩气下进行。将(2r)-3，6-二甲氧基-2-(丙烷-2-基)-2，5-二氢吡嗪(cas-rn：109838-85-9)(2.9ml，16mmol)溶于无水thf(40ml)，并将溶液冷却至-78℃。在该温度下，缓慢滴加正丁基锂溶液(10ml，1.6m的己烷溶液，16mmol)，并将所得溶液在-78℃下搅拌15分钟。然后加入2-(溴甲基)-1，4-二氟苯(4.05g，19.5mmol)于无水thf(15ml)中的溶液并继续搅拌直至反应达到室温。将反应混合物在室温下再搅拌一小时，同时通过hplc监测反应进程。将混合物用水淬灭并用乙酸乙酯萃取两次。将合并的有机相用饱和氯化钠水溶液洗涤一次，用硫酸镁干燥，然后浓缩，得到5.46g黄色粗油状物。使用bio-tage isolara快速色谱系统(100g biotage cartridge ultra)通过正相色谱纯化油状物，使用环己烷-乙酸乙酯(ea)(95/5)的洗脱液，得到4.16g(82％)为油状物的目标化合物。
[1810]
lc-ms(方法10)：r
t
＝2.44min；ms(esi pos)：m/z＝311[m+h]
+
[1811]1h-nmr(400mhz，dmso-d6)δ[ppm]：0.563(6.79)，0.580(6.97)，0.933(6.65)，0.951(6.88)，2.103(0.58)，2.111(0.61)，2.120(0.78)，2.129(0.79)，2.137(0.59)，2.145(0.57)，2.864(0.79)，2.882(0.83)，2.898(1.08)，2.915(1.09)，3.089(1.06)，3.101(1.10)，3.123(0.82)，3.134(0.81)，3.313(7.20)，3.518(1.28)，3.527(2.46)，3.535(1.37)，3.566(16.00)，4.293(0.58)，4.304(1.07)，4.313(1.08)，4.321(1.01)，4.330(0.58)，6.992(0.47)，7.000(0.66)，7.005(0.63)，7.015(1.06)，7.023(0.71)，7.028(0.64)，7.037(0.63)，7.075(0.63)，7.084(0.91)，7.095(0.74)，7.105(0.66)，7.131(0.68)，7.143(0.73)，7.154(1.05)，7.166(1.04)，7.177(0.45)，7.189(0.40)。
[1812]
实施例126a
[1813]
2，5-二氟-l-苯丙氨酸甲酯
[1814][1815]
将(2s，5r)-2-[(2，5-二氟苯基)甲基]-3，6-二甲氧基-5-(丙烷-2-基)-2，5-二氢吡嗪(实施例125a)(4.15g，13.4mmol)溶于甲醇(35ml)中并将溶液冷却至0℃。加入10％盐酸水溶液(12ml)并将溶液在0℃下搅拌几分钟。然后使反应溶液达到室温，然后在该温度下
搅拌三小时。蒸发甲醇。将残余物用dcm稀释，加入2m碳酸钠水溶液(120ml)并将所得混合物剧烈搅拌数分钟。分离各层，将水相用dcm萃取两次。合并的有机相用硫酸镁干燥，过滤，然后浓缩，得到3.97g无色液体。使用biotage isolara快速色谱系统(100g biotage cartridge ultra)通过正相色谱纯化粗液体，使用环己烷-乙酸乙酯(ea)(10％至75％ea)的梯度洗脱液，提供2.27g(79％)为无色液体的目标化合物。
[1816]
lc-ms(方法13)：rt＝1.20min；ms(esi pos)：m/z＝216[m+h]
+
[1817]1h-nmr(400mhz，dmso-d6)δ[ppm]：1.833(16.00)，2.733(3.07)，2.753(3.26)，2.767(4.81)，2.787(5.0d，2.889(4.71)，2.904(4.91)，2.923(3.10)，2.938(3.19)，3.315(15.20)，3.401(0.42)，3.553(5.22)，3.568(6.29)，3.572(6.60)，3.768(0.41)，7.060(0.89)，7.069(1.71)，7.081(2.21)，7.090(4.07)，7.101(3.20)，7.111(2.84)，7.120(1.89)，7.151(5.97)，7.163(5.82)，7.174(9.84)，7.186(7.52)，7.196(4.42)，7.208(2.10)。
[1818]
实施例127a
[1819]
(2r)-2-氨基-3-[[(2r)-2-氨基-3-叔丁氧基-3-氧代-丙基]二硫烷基]丙酸叔丁酯
[1820][1821]
在0℃下向l-胱氨酸(cas rn：56-89-3)(10.00g，41.61mmol)在乙酸叔丁酯(63.22g，544.24mmol，73ml)中的悬浮液中在0.5小时内滴加hclo4(18.26g，127.23mmol，11ml，纯度70％)(70％的水溶液)，然后将溶液在20℃下搅拌17小时。加入冰，溶液无需进一步纯化即可用于下一步(理论上为14.67g)。
[1822]
实施例128a
[1823]
(2r)-3-[[(2r)-3-叔丁氧基-2-(叔丁氧基羰基氨基)-3-氧代-丙基]二硫烷基]-2-(叔丁氧基羰基氨基)丙酸叔丁酯
[1824][1825]
在0℃下向在水(200ml)和ea(200ml)中的(2r)-2-氨基-3-[[(2r)-2-氨基-3-叔丁氧基-3-氧代-丙基]二硫烷基]丙酸叔丁酯(理论上14.67g，来自实施例127a)的混合物中加入na2co3(30.00g，283.08mmol)和boc2o(27.25g，124.85mmol)，将混合物(ph为8-9)在20℃下搅拌17小时。将混合物用ea(100ml)和水(200ml)稀释。分离有机层，将水层用ea(200ml)萃取。将合并的有机层用盐水(200ml)洗涤，浓缩得到残余物，将残余物通过硅胶色谱法
(pe/ea＝1/0至1/1)纯化得到两批目标化合物：8.5g为浅棕色油状物的粗品和6.5g为浅棕色油状物的粗品。
[1826]1h-nmr(400mhz，cdcl3)δ[ppm]：1.51，1.61，1.62.1.64，3.11，3.12，3.14，3.16，3.19，3.203，3.23，3.24，4.44，4.46，4.48，4.49，5.35，5.37。
[1827]
实施例129a
[1828]
(2r)-2-(叔丁氧基羰基氨基)-3-硫烷基-丙酸叔丁酯
[1829][1830]
在0℃下向在thf(150ml)和水(15ml)中的(2r)-3-[[(2r)-3-叔丁氧基-2-(叔丁氧基羰基氨基)-3-氧代-丙基]二硫烷基]-2-(叔丁氧基羰基氨基)丙酸叔丁酯(8.5g，粗品，来自实施实施例128a)的溶液中在0.5小时内加入三丁基膦(3.77g，4.6ml)，然后将溶液在20℃下搅拌2h。将混合物与由6.5g稀有材料(来自实施例128a)制备的另一批进行混合(work up)。将两种反应混合物倒入水(300ml)中并用乙酸乙酯(150ml x 2)萃取。将合并的有机相用盐水(300ml)洗涤，用无水na2so4干燥，过滤并真空浓缩。通过硅胶色谱法(pe/ea＝40/1至10/1)纯化残余物以得到12.5g为无色油状物的目标化合物，其以纯净物形式使用。还获得了含有残留三丁基膦的6.5g不纯批次但被丢弃。
[1831]1h-nmr(400mhz，cdcl3)δ[ppm]：1.45，2.94，2.95，2.96，2.97，4.46，4.47，4.48，4.49，5.39，5.41。
[1832]
实施例130a
[1833]
(2r)-2-(叔丁氧基羰基氨基)-3-(三氟甲基硫烷基)丙酸叔丁酯
[1834][1835]
向3，3-二甲基-1-(三氟甲基)-1，2-benziodoxole(18g，54.53mmol)的meoh(150ml)溶液中在-78℃下在n2下历时30分钟加入(2r)-2-(叔丁氧基羰基氨基)-3-硫烷基-丙酸叔丁酯(14g，50.47mmol，来自实施例129a)的meoh(20ml)溶液，并将反应在该温度下搅拌1小时，直至它变成无色溶液。将反应混合物升温至20℃，搅拌1小时，浓缩得到残余物，将其通过硅胶色谱法(pe/ea＝1/0至40/1)纯化两次，得到13.2g为无色油状物的目标化合物。
[1836]1h-nmr(400mhz，cdcl3)δ[ppm]：1.47，3.26，3.28，3.30，3.31，3.45，3.46，3.48，3.50，4.47，4.48，5.34，5.35。
[1837]
实施例131a
[1838]
(2r)-2-氨基-3-(三氟甲基硫烷基)丙酸叔丁酯盐酸盐
[1839][1840]
向(2r)-2-(叔丁氧基羰基氨基)-3-(三氟甲基硫烷基)-丙酸叔丁酯(12.20g，35.32mmol，来自实施例130a)的dcm(10ml)溶液中加入hcl/二噁烷(4m，50ml)溶液并将反应在10℃下搅拌3小时。浓缩混合物，得到白色玻璃状固体，其直接用于下一步。
[1841]
实施例132a
[1842]
(2r)-2-(9h-芴-9-基甲氧基羰基氨基)-3-(三氟甲基硫烷基)-丙酸叔丁酯
[1843][1844]
向(2r)-2-氨基-3-(三氟甲基硫烷基)丙酸叔丁酯盐酸盐(来自实施例131a的粗品)在二噁烷(80ml)中的混合物中加入饱和nahco3(80ml)和fmoc-osu(19g，56.33mmol)，并将反应物(ph～7-8)在10℃下搅拌17小时。浓缩混合物，用水(100ml)稀释残余物，然后用ea(100ml x 2)萃取。将有机层用盐水(100ml)洗涤，浓缩，然后通过硅胶色谱法(pe/ea＝40/1～10/1)纯化，得到13g为无色油状物的目标化合物。
[1845]
lc-ms(方法15)：r
t
＝1.028min；ms(esi pos)：m/z＝490.2[m+na]
+
[1846]1h-nmr(400mhz，cdcl3)δ[ppm]：1.45，3.32，3.47，3.36，3，49，3.50，4.16，4.22，4.24，4.26，4.37，4.44，4.46，4.58，5.62，5.64，7.33，7.35，7.40，7.42，7.44，7.56，7.61，7.77，7.79。
[1847]
19
f-nmr：(376mhz，cdcl3)δ[ppm]：-40.85。
[1848]
实施例133a
[1849]
2r)-2-(9h-芴-9-基甲氧基羰基氨基)-3-(三氟甲基硫烷基)丙酸
[1850][1851]
向(2r)-2-(9h-芴-9-基甲氧基羰基氨基)-3-(三氟甲基硫烷基)-丙酸叔丁酯(13g，27.81mmol)的dcm(15ml)溶液中加入tfa(30ml)和茴香硫醚(15.75g，126.81mmol，
15ml)，并将反应混合物在10℃下搅拌17h。将混合物浓缩以得到残余物，将其用饱和nahco3溶液(100ml)稀释，然后用ea(50ml x 2)萃取。将有机层用1m hcl(50ml)洗涤，浓缩，然后通过硅胶色谱法(pe/ea＝10/1，然后用dcm/meoh＝40/1至5/1)纯化，得到10g为白色玻璃状固体的目标化合物，纯度：98.8％。1h-nmr表明产物含有乙酸乙酯，因此将固体重新溶于dcm(80ml)中，浓缩，然后在高真空下干燥，得到9.67g(23.22mmol，产率83.5％，纯度98.8％)为白色玻璃状固体的目标化合物。
[1852]
lc-ms(方法15)：r
t
＝0.895min；ms(esi pos)：m/z＝434.1[m+na]+
[1853]1h-nmr(400mhz，cdcl3)δ[ppm]：3.25，3.26，3.32，3.33，3.93，3.95，4.22，4.24，4.26，4.28，4.30，4.31，6.95，6.98，7.31，7.32，7.33，7.34，7.39，7，41，7.42，7.68，7.70，7.87，7.89。
[1854]
19
f-nmr：(376mhz，cdcl3)δ[ppm]：-40.89
[1855]
手性sfc：r
t
＝2.49min，99％ee
[1856]
手性sfc条件：ad-3_5cm_ipa(dea)_10_20_3ml_t35柱：chiralpak ad-3 50x4.6mm id.，3μm流动相：异丙醇(0.05％dea)在co2中的浓度为10％至20％，流速：3ml/min，波长：220nm。
[1857]
该氨基酸用于spps。该氨基酸也可商购获得(cas-rn：1994331-25-7。
[1858]
实施例134a
[1859]
(2s)-5-氧代吡咯烷-1，2-二羧酸二叔丁酯
[1860][1861]
向化合物(2s)-5-氧代吡咯烷-1，2-二羧酸叔丁酯(cas-rn：35418-16-7)(290g，1.57mol，1.00eq)和dmap(1.91g，15.66mmol，0.01eq)的ch3cn(2.00l)溶液中，在5℃下加入boc2o(341g，1.57mol，359ml，1.00eq)。加入后，将混合物在20℃下搅拌12小时。tlc显示原料完全消耗，形成两个新斑点(tlc)(pe/ea＝3/1，rf＝0.43，rf＝0.9)。在减压下浓缩反应混合物以除去ch3cn，并将残余物在dcm(1000ml)和水(1000ml)之间分配。将有机层用盐水(300ml)洗涤，用na2so4干燥，过滤并减压浓缩，得到粗产物。通过柱色谱法(sio2，pe/ea＝100/1至10/1)纯化残余物，得到为灰白色固体的目标化合物(260.00g，874.75mmol，产率55.72％，纯度96％)。
[1862]
lc-ms(方法15)：r
t
＝0.873min；ms(esi pos)：m/z＝308.0[m+na]
+
，331[m+2na]
+
[1863]1h-nmr(400mhz，cdcl3)δ[ppm]：1.44-1.42(d，j＝8.4，8h)，1.97-1.92(m，ih)，2.22-2.19(m，1h)，2.43-2.40(m，1h)，2.58-2.49(m，1h)，4.42-4.39(m，1h)。
[1864]
实施例135a
[1865]
(2s)-4，4-二烯丙基-5-氧代-吡咯烷-1，2-二羧酸二叔丁酯
[1866][1867]
在-73℃下，向(2s)-5-氧代吡咯烷-1，2-二羧酸二叔丁酯(61.9g，208mmol，1.00eq，来自实施例134a)的thf(40.0ml)溶液中滴加lihmds(1m，437ml，2.10eq)，然后在-73℃下搅拌1小时。向混合物中滴加化合物烯丙基溴(50.4g，416mmol，2.00eq)。加入后，将混合物在15℃下搅拌2小时。tlc显示化合物原料完全消耗，并形成四个新斑点(pe/ea＝3/1，rf＝0.9，rf＝0.8，rf＝0.7，rf＝0.1)。将反应混合物用饱和氯化铵水溶液(1000ml)猝灭，用dcm(500ml x 3)萃取，用硫酸钠干燥，过滤，然后减压浓缩，得到粗残余物。通过柱色谱法(sio2，pe/ea＝100/1至30/1)纯化残余物，得到为无色油状物的目标化合物(100g，产率38％，纯度86％)。
[1868]
lc-ms(方法15)：r
t
＝1.044min；ms(esi pos)：m/z＝411.4[m+2na]
+
[1869]1h-nmr(400mhz，cdcl3)δ[ppm]：1.49-1.43(d，j＝8.4，8h)，1.87-1.82(m，ih)，2.22-2.18(m，3h)，
[1870]
实施例136a
[1871]
(2s)-4，4-二烯丙基吡咯烷-1，2-二羧酸二叔丁酯
[1872][1873]
在-78℃下，向(2s)-4，4-二烯丙基-5-氧代-吡咯烷-1，2-二羧酸二叔丁酯(80.0g，188mmol，1.00eq，来自实施例135a)的thf(300ml)溶液中加入libhet3(1m，225ml，1.20eq)。加入后，将混合物在-78℃下搅拌3小时。lcms显示检测到所需的ms。tlc显示形成两个新斑点(pe/ea＝3/1，rf＝0.65，rf＝0.8)。在0℃下用饱和碳酸钠水溶液(50ml)将反应混合物淬灭，然后在0℃下滴加30％h2o2(1ml)。在减压下浓缩混合物以除去thf，然后将残余物用水(1000ml)和dcm(1000ml)稀释。将水相用dcm(300ml x 3)萃取。将合并的有机层用硫酸钠干燥，过滤，然后减压浓缩，得到粗产物。通过柱色谱法(sio2，pe/ea＝80/1至30/1)纯化粗残余物，得到为无色油状物的目标化合物(56.0g，产率69％，纯度85％)。
[1874]
lc-ms(方法15)：r
t
＝1.192min；ms(esi pos)：m/z＝390.3[m+k]+
[1875]1h-nmr(400mhz，cdcl3)δ[ppm]：1.53-1.47(m，18h)，2.13-1.98(m，2h)，2.22-2.15(m，3h)，2.39-2.24(m，ih)，2.92-2.91(m，1h)，4.22-4.08(m，1h)，5.18-5.06(m，5h)，5.85-5.77(m，2h)。
[1876]
实施例137a
[1877]
(3s)-2-氮杂螺[4.4]壬-7-烯-2，3-二羧酸二叔丁酯
[1878][1879]
在34℃下，向grubb的第一代催化剂(cas rn：172222-30-9)(2.85g，3.47mmol，0.05eq)的dcm(400.00ml)溶液中滴加(2s)-4，4-二烯丙基吡咯烷-1，2-二羧酸二叔丁酯(25.0g，69.4mmol，1.00eq，来自实施例136a)。加入完成后，将混合物在34℃下在n2下搅拌1小时。tlc显示形成了两个新斑点(pe/ea＝5/1，rf＝0.6，rf＝0.7)。过滤反应混合物并减压浓缩，得到粗产物。通过柱色谱法(sio2，pe/ea＝1/0至80/1)纯化残余物以提供为无色油状物的目标化合物(12.0g)。
[1880]1h-nmr(400mhz，cdcl3)δ[ppm]：1.46-1.43(m，18h)，1.92-1.87(m，1h)，2.45-2.22(m，5h)，3.49-3.29(m，2h)，4.21-4.19(m，1h)，5.64(s，2h)o
[1881]
实施例138a
[1882]
(3s)-2-氮杂螺[4.4]壬烷-2，3-二羧酸二叔丁酯
[1883][1884]
向(3s)-2-氮杂螺[4.4]壬-7-烯-2，3-二羧酸二叔丁酯(12.0g，37.1mmol，1.0eq，来自实施例137a)的etoh(100ml)溶液中在n2气氛下加入pd/c(10％，0.1g)。将悬浮液脱气并用h2气体吹扫3次。将混合物在h2(15psi)和25℃下搅拌16小时。过滤部分悬浮液，浓缩滤液，进行质子nmr，这表明形成了所需的产物。过滤反应混合物，浓缩滤液，得到10.0g(粗品)为白色固体的目标化合物。
[1885]1h-nmr(400mhz，cdcl3)δ[ppm]：4.12-4.02(m，1h)，3.65-3.60(m，2h)，3.12-3.38(m，5h)，2.11-2.06(m，ih)，1.80-1.77(m，1h)，1.57-1.56(m，6h)，1.40-1.36(m，18h)。
[1886]
实施例139a
[1887]
(3s)-2-氮杂螺[4.4]壬烷-3-羧酸
[1888][1889]
将化合物(3s)-2-氮杂螺[4.4]壬烷-2，3-二羧酸二叔丁酯(12g，36.8mmol，1eq，来自实施例138a)加入hcl/etoac(150ml)的溶液中，然后将混合物在15℃下搅拌1小时。lc-ms分析显示已消耗原料，并且找到了所需的目标质量。真空浓缩反应混合物以除去溶剂，得到7.5g(36.4mmol，产率99％)为白色固体的为盐酸盐的粗目标化合物。
[1890]1h-nmr(400mhz，dmso)δ[ppm]：10.07(s，1h)，8.81(s，1h)，4.38-4.27(m，1h)，3.16-3.02(m，2h)，2.22-2.21(m，1h)，1.96-1.90(m，1h)，1.63-1.56(m，8h)。
[1891]
实施例140a
[1892]
(3s)-2-{[(9h-芴-9-基)甲氧基]羰基}-2-氮杂螺[4.4]壬烷-3-羧酸
[1893][1894]
向(3s)-2-氮杂螺[4.4]壬烷-3-羧酸(5.1g，24.8mmol，来自实施例139a)和fmoc-osu(10.0g，29.7mmol，1.2eq)在thf(70ml)和h2o(70ml)中的溶液中加入nahco3(8.5g，101mmol，3.94，4.08当量)。将混合物在15℃下搅拌1小时。lcms分析表明原料被消耗，获得了所需的目标质量。加入水(200ml)，然后用dcm(200ml x 2)萃取混合物。合并的有机层用盐水(100ml)洗涤，用na2so4干燥，过滤，然后浓缩。将粗产物纯化用于反相mplc(ea)，得到6.9g(17.5mmol，70％产率，99％纯度)为黄色固体的目标化合物。
[1895]
lc-ms(方法15)：r
t
＝2.501min；ms(esi pos)：m/z＝392.2[m+h]
+
[1896]1h-nmr(400mhz，cdcl3)δ[ppm]：7.80-7.79(d，j＝7.2，2h)，7.59-7.54(m，2h)，7.44-7.42(m，2h)，7.36-7.35(m，2h)，4.55-4.52(m，2h)，4.42-4.38(m，ih)，4.31-4.20(m，1h)，3.34-3.17(m，2h)，2.33-2.28(m，1h)，2.13-2.08(m，1h)，1.73-1.50(m，8h)。
[1897]
该氨基酸用于spps。该氨基酸也可商购获得(cas-rn：394734-78-2)。
[1898]
实施例141a
[1899]
(2s，4r)-4-(三氟甲基)吡咯烷-2-羧酸
[1900][1901]
向(2s，4r)-1-叔丁氧基羰基-4-(三氟甲基)吡咯烷-2-羧酸(7g，24.7mmol，1eq)的dcm(70ml)溶液中加入tfa(8.00ml，108mmol，4.37eq)。将混合物在10℃下搅拌4小时。lcms分析显示原料被消耗并且找到了所需的目标质量。真空浓缩反应混合物，粗产物直接用于下一步。获得为白色固体的目标化合物(7.34g，24.7mmol，产率100％，tfa盐)。
[1902]
lc-ms(方法15)：r
t
＝0.18min；ms(esi pos)：m/z＝184.1[m+h]
+
[1903]1h-nmr(400mhz，cdcl3)δ[ppm]：4.51-4.48(m，1h)，3.82(m，1h)，3.57-3.55(m，1h)，2.65-2.62(m，2h)，2.53-2.49(m，1h)。
[1904]
实施例142a
[1905]
(2s，4r)-1-(9h-芴-9-基甲氧基羰基)-4-(三氟甲基)吡咯烷-2-羧酸
[1906][1907]
向粗(2s，4r)-4-(三氟甲基)吡咯烷-2-羧酸(2g，6.73mmol，1eq，tfa盐，来自实施例141a)在h2o(70ml)和丙酮(70ml)中的溶液中加入na2co3(2.85g，26.9mmol，4eq)和fmoc-osu(2.72g，8.08mmol，1.2eq)。将混合物在10℃下搅拌12小时。lcms分析仅显示一个峰并且找到了所需的质量。tlc分析(dcm/meoh＝10/1)显示原料已消耗，并且出现主要斑点(rf＝0.4)。将hcl溶液(1m，30ml)加入混合物中直至ph＝2。将混合物用dcm(70ml x 2)萃取，并将合并的有机层用盐水(70ml)洗涤，用na2so4干燥，过滤，然后浓缩。通过柱色谱法(sio2，pe/ea＝10/1至5/1)纯化残余物，得到1.7g(61％，97％纯度)为黄色固体的目标化合物。
[1908]
lc-ms(方法15)：r
t
＝2.425min；ms(esi pos)：m/z＝406.2[m+h]
+
，406.2[m+na]
+
[1909]1h-nmr(400mhz，dmso)δ[ppm]：7.92-7.89(m，2h)，7.66-7.64(m，2h)，7.42-7.41(m，2h)，7.35-7.32(m，2h)，4.16-4.19(m，4h)，3.72-3.50(m，3h)，2.38-2.30(m，2h)，2.18(s，1h)。
[1910]
19
f-nmr(400mhz，dmso)δ[ppm]：-70.128，-70.275。
[1911]
手性sfc：r
t
＝2.33min，99％ee
[1912]
手性sfc条件：ad-3_5cm_ipa(dea)_10_20_3ml_t35柱：chiralpak ad-3 50x4.6mm i.d.，3μm流动相：异丙醇(0.05％dea)在co2中的浓度为10％至20％，流速：3ml/min，波长：220nm。
[1913]
该氨基酸用于spps。
[1914]
[1915]
[1916]
[1917]
[1918]
[1919]
[1920]
[1921]
[1922]
[1923]
[1924]
[1925]
[1926]
[1927]
[1928]
[1929]
[1930]
[1931]
[1932]
[1933]
[1934]
[1935]
[1936]
[1937]
[1938]
[1939]
[1940]
[1941]
[1942]
[1943]
[1944]
[1945]
[1946]
[1947]
[1948]
[1949]
[1950]
[1951]
[1952]
[1953]
[1954]
[1955]
[1956]
[1957]
[1958]
[1959]
[1960]
[1961]
[1962]
[1963]
[1964]
[1965]
[1966][1967]
表17：所选择肽的maldi质谱数据
[1968][1969]
在下文中，实施例29、44、45、67、75、109、166、185、347、443、466和499以其化学结构举例说明。本发明包括这些实施例的药学上可接受的盐、溶剂合物或盐的溶剂合物。化学结构显示为无盐形式。
[1970]
实施例29，序列：aic+srslp-(oic)-i-(pen)+ipd-oh(hcl盐)
[1971][1972]
实施例44，序列：
[1973]
((n-me)g)-ic+srs-((tbu)a)-ppi-(pen)+ip-(peg9(31个原子))-nh2
[1974][1975]
实施例45，序列：ai-c+srs-((tbu)a)-p-((6s)-5-氮杂螺[2.4]己烷-6-羧酸)-i-(pen)+ipd-nh2
[1976][1977]
实施例67，序列：((n-me)g)-ic+srslp-(oic)-i-(pen)+ip-nh2(hcl盐)
[1978][1979]
实施例75，序列：aic+srslp-(oic)-i-(pen)+ipd-nh2
[1980][1981]
实施例109，序列：((n-me)g)-ic+srslp-(oic)-i-(pen)+ip-nh2
[1982][1983]
实施例166，序列：
[1984]
(3-氨基-2，2-二甲基乙酸)-ic+srs-((tbu)a)-ppi-(pen)+ipd-nh2
[1985]
[1986]
实施例185，序列：aic+srslp-(oic)-i-((n-me)c)+ipd-nh2
[1987][1988]
实施例347，序列：ic+srslp-(oic)-i-(pen)+ipd-oh
[1989][1990]
实施例443，序列：((n-me)a)-ic+srs-((tbu)a)-p-((3r，6r)-1，1-二氟-5-氮杂螺[2.4]庚烷-6-羧酸(对映异构体1))-i-(pen)+ip-nh2
[1991][1992]
实施例466，序列：((n-me)g)-ic+srslp-(oic)-i-(pen)+ipdd-oh
[1993][1994]
实施例499，序列：aic+s-(arg(13c6，15n4))-slp-(oic)-i-(pen)+ipd-oh
[1995][1996]
生物体外测试
[1997]
1.测试化合物的丝氨酸蛋白酶谱
[1998]
将测试化合物在由不同的人丝氨酸蛋白酶(包括激肽释放酶，纤溶酶，fxia，凝血酶，因子xa、tpa和胰蛋白酶)组成的蛋白酶组中进行测试。
[1999]
测试说明
[2000]
测定了测试化合物的抑制效力和/或选择性。该测定基于氨甲基香豆素(amc)的荧光检测，氨甲基香豆素(amc)经蛋白酶催化裂解从荧光肽蛋白酶底物释放。活性蛋白酶或酶原，通常从人血浆中纯化或从人胰腺的胰蛋白酶中纯化，并且相应的底物为可商购的。
[2001]
丝氨酸蛋白酶测定包括以下酶和底物。所有酶和底物在测定缓冲液(50mm tris/hcl ph7.4、100mm nacl、5mm cacl2、0.1％bsa)中稀释。
[2002]
给出最终测定浓度：
[2003]
·
激肽释放酶(kordia；0.2nm)、h-pro-phe-arg-amc(bachem i-1295；5μm)
[2004]
·
纤溶酶(kordia；0.1μg/ml，1.2nm)、meosuc-ala-phe-lys-amc(bachem i-1275；50μm)
[2005]
·
因子xia(kordia；0.15nm)，boc-glu(obzl)-ala-arg-amc(bachem i-1575；5μm)
[2006]
·
凝血酶(kordia；0.02nm)、boc-asp(obzl)-pro-arg-amc(bachem i-1560；5μm)
[2007]
·
因子xa(kordia；1.3nm)，boc-ile-glu-gly-arg-amc(bachem i-1100；5μm)
[2008]
·
组织纤溶酶原激活剂(tpa、loxo；2nm)、ch3so2-d-phe-gly-arg-amc(penta-pharm 091-06；5μm)
[2009]
·
胰蛋白酶(sigma；0.042u/ml)，底物boc-ile-glu-gly-arg-amc(bachem i-1100；5μm)
[2010]
为了确定测试化合物的效力，酶和相应的底物稀释液用于进行蛋白酶测定：
[2011]
向含有1μl/孔系列稀释的测试或参考化合物的384孔微量滴定板(白色，greiner)中加入20μl测定缓冲液、20μl酶稀释液和20μl底物。对照反应不含测试化合物(仅dmso)。在室温下通常孵育30分钟(线性反应动力学)后，在微量滴定板荧光读数器(例如tecan safire ii)中测量荧光(ex360nm，em 465nm)。ic
50
值是通过将测试化合物浓度相对于蛋白酶活性百分比进行对数作图来确定的。
[2012]
2.生物化学人masp-1和masp-2测定
[2013]
2.1重组人masp1和masp2活性蛋白酶的重组表达和蛋白制备。
[2014]
将编码对应于具有c-末端his标签和n-末端ig-κ分泌信号的氨基酸297-699的片段的人masp1的截短cdna序列(seq id no：2)亚克隆到哺乳动物表达载体pcdna3.1(invitrogen)中。
[2015]
将编码对应于具有c-末端his标签和n-末端ig-κ分泌信号的氨基酸297-686的片段的人类masp1的截短cdna序列(seq id no：3)亚克隆到哺乳动物表达载体pcdna3.1(invitrogen)中。
[2016]
如制造商所述，使用lipofectamine试剂(thermo-fischer)将masp1或masp2表达截体转染到hek293(atcc编号crl-1573)细胞系中。将重组人masp1和masp2蛋白酶的成熟形式分泌到培养基中。如制造商所述，通过在ni-nta superflow树脂(qiagen)上进行亲和层析，从条件培养基中纯化masp1和masp2蛋白。
[2017]
2.2生物化学人masp1测定
[2018]
在hek 293细胞中产生的重组人masp1酶在反应缓冲液(50mm hepes ph 8，0；100mm nacl；0，01％chaps；0，5mm谷胱甘肽)中稀释至浓度为20nm并将25μl转移到384-孔白色微量滴定板(greiner bio one781075)的每个单孔中。将1μl抑制剂化合物溶液(以相应的浓度溶于dmso中)或作为对照的纯dmso加入到相同的孔中。通过加入25μl在反应缓冲液中的20μm fret底物abz-myggarrl-lys(dnp)-nh2；(abz-2-氨基苯甲酰基；dnp-2，4-二硝基苯基；由柏林的jerini peptide technologies定制合成)的溶液引发酶促反应。将微量滴定板在32℃的温度下孵育60-120分钟。在合适的荧光板读数器(例如tecan ultra)中使用320nm的激发波长和420nm的发射波长测量荧光强度的增加。从作为测试化合物浓度的函数的人masp1活性的抑制百分比计算ic50值。
[2019]
2.3生物化学人masp2测定
[2020]
在hek 293细胞中产生的重组人masp2酶在反应缓冲液(50mm hepes ph 8，0；100mm nacl；0，01％chaps；0，5mm谷胱甘肽)中稀释至浓度为20nm并将25μl转移到384-孔白色微量滴定板(greiner bio one 781075)的每个单孔中。将1μl抑制剂化合物溶液(以相应的浓度溶于dmso中)或作为对照的纯dmso加入到相同的孔中。通过加入25μl在反应缓冲液中的60μm fret底物dabcyl-kispqgygrr-glu(edans)-nh2；(dabcyl-4-((4-(二甲基a-氨基)苯基)偶氮)苯甲酸；edans-5-[(2-氨基乙基)氨基]萘-1-磺酰基；由柏林的jerini peptide technologies定制合成)的溶液引发酶促反应。将微量滴定板在32℃的温度下孵育60-120分钟。在合适的荧光板读数器(例如tecan ultra)中使用340nm的激发波长和490nm的发射波长测量荧光强度的增加。从作为测试化合物浓度的函数的人masp2活性的抑制百分比计算ic50值。
[2021]
3.c3沉积测定(人、大鼠、小鼠、狗、小型猪)
[2022]
c3沉积测定基本上如所描述的(参考)进行。将多孔板(greiner-nunc 384 maxi sorp#464718)在4℃下用来自酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)的甘露聚糖(sigma m7504，10μg/ml，在0.05m碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液中，ph 9.6)包被过夜。将孔用tbs洗涤3次，随后用50μl 1％的在tris缓冲盐水(tbs)中的牛血清白蛋白(bsa)在37℃下孵育2小时，以阻断非特异性结合。在该步骤和以下每个孵育步骤之后，将孔用c3洗涤缓冲液(tbs；0.05％tween 20；5mm cacl2)洗涤3次。接下来将孔在37℃下与50μl含有稀释血清的测试化合物的混合物在veronal缓冲液(veronal puffer(lonza 12624e))中孵育30分钟。在预测试中，血清以不会显示可检测的c3沉积到未包被的板的浓度使用。分别地，发现对人、大鼠、小鼠和狗血清的适当稀释度范围为1∶100-1∶200以及小型猪血清的适当稀释度范围为1∶20-1∶100。在典型实验中，化合物在1x10-9
和5x10-5
mol/l之间的浓度范围内进行测试。洗涤后，c3沉积通过以下步骤进行检测：与多克隆兔抗人c3抗体(dako(biozol)a0062)孵育1小时，然后洗涤并与过氧化物酶偶联的抗兔igg(sigma a1949)在37℃下孵育30分钟，随后洗涤并在黑暗中与tmb底物溶液孵育。当显色适当时，通过加入25μl终止溶液(sigma s5814)终止显色反应并在光度计上通过测量450nm波长处的吸收进行定量。抗体在补充有0.5％bsa的c3洗涤缓冲液中稀释。
[2023]
4.生物化学大鼠masp-1和masp-2测定
[2024]
4.1重组人和大鼠masp1和masp2活性蛋白酶的重组表达和蛋白制备。
[2025]
将编码对应于具有c-末端histag和n-末端ig-κ分泌信号的氨基酸302-704的片段的大鼠masp1的截短cdna序列(seq id no：4)亚克隆到哺乳动物表达载体pcdna3.1(invitrogen)中。
[2026]
将编码对应于具有c-末端his标签和n-末端ig-κ分泌信号的氨基酸296-685的片段的大鼠masp2的截短cdna序列(seq id no：5)亚克隆到哺乳动物表达载体pcdna3.1(invitrogen)中。
[2027]
如制造商所述，使用lipofectamine试剂(thermo-fischer)将masp1或masp2表达载体转染到hek293(atcc编号crl-1573)细胞系中。将成熟形式的重组大鼠masp1和masp2蛋白酶分泌到培养基中。如制造商所述，通过在ni-nta superflow树脂(qiagen)上的亲和层析从条件培养基中纯化masp1和masp2蛋白。
[2028]
4.2生物化学大鼠masp1测定。
[2029]
在hek 293细胞中产生的重组大鼠masp1酶在反应缓冲液(50mm hepes ph 8，0；100mm nacl；0，01％chaps；0，5mm谷胱甘肽)中稀释至浓度为4nm并将25μl转移到384-孔白色微量滴定板(greiner bio one 781075)的每个单孔中。将1μl抑制剂化合物溶液(以相应的浓度溶于dmso中)或作为对照的纯dmso加入到相同的孔中。通过加入25μl在反应缓冲液中的40μm fret底物dabcyl-myggarrl-glu(edans)-nh2；(dabcyl-4-((4-(二甲氨基)苯基)偶氮)苯甲酸；edans-5-[(2-氨基乙基)氨基]萘-1-硫烷基；由柏林的jerini peptide technologies定制合成)的溶液引发酶促反应。将微量滴定板在32℃的温度下孵育60-120分钟。在合适的荧光板读数器(例如tecan ultra)中使用340nm的激发波长和490nm的发射波长测量荧光强度的增加。从作为测试化合物浓度的函数的大鼠masp2活性的抑制百分比计算ic50值。
[2030]
4.3生物化学大鼠masp2测定。
[2031]
在hek 293细胞中产生的重组大鼠masp2酶在反应缓冲液(50mm hepes ph 8，0；100mm nacl；0，01％chaps；0，5mm谷胱甘肽)中稀释至浓度为20nm并将25μl转移至384-孔白色微量滴定板(greiner bio one 781075)的每个单孔中。将1μl抑制剂化合物溶液(以相应的浓度溶于dmso中)或作为对照的纯dmso加入到相同的孔中。通过加入25μl在反应缓冲液中的30μm fret底物abz-iegrtsed-(lys)dnp-nh2；(abz-2-氨基苯甲酰基；dnp-2，4-二硝基苯基；由柏林的jerini peptide technologies定制合成)的溶液引发酶促反应。将微量滴定板在32℃的温度下温育60-120分钟。在合适的荧光板读数器(例如tecan ultra)中使用320nm的激发波长和420nm的发射波长测量荧光强度的增加。从作为测试化合物浓度的函数的大鼠masp2活性的抑制百分比计算ic50。
[2032]
表18：参考肽的平均ic50
[2033][2034][2035]
表19.本发明的肽的平均ic50
[2036]
[2037]
[2038]
[2039]
[2040]
[2041]
[2042]
[2043]
[2044]
[2045]
[2046]
[2047]
[2048]
[2049][2050]
表20：参考肽的平均ic50
[2051][2052]
表21：本发明的肽的平均ic50
[2053]
[2054]
[2055]
[2056]
[2057]
[2058][2059]
4.大鼠单侧肾切除术后的肾缺血再灌注损伤(iri)
[2060]
所有程序均符合国家立法(德国动物保护法(dt.tierschutzgesetz))和欧盟关于将动物用于科学目的的指令，并获得拜耳ag机构动物护理办公室和地区主管当局(lanuv recklinghausen)的批准。标准实验室饮食和自来水可随意使用。在一个典型的实验中，使用的动物数量是n＝6至12。动物被随机分配到实验组。肾缺血再灌注损伤(iri)在雄性单侧肾切除的wistar大鼠中进行，其优选体重为250至350g。对于单侧肾切除术，大鼠吸入在空气中2的％异氟醚保持麻醉状态。是通过皮下注射400μl/kg的25％ketavet和8％rompun于0.9nacl中的混合物来提供镇痛。单侧肾切除术在通过背外侧腹壁中的小切口突出右肾并结扎其脚(peduncle)后进行。单侧肾切除术后，腹部切口通过外科缝合线分层闭合，使动物在iri前恢复7至8天。如上所述，在麻醉和镇痛下进行iri。剩余的左肾通过腹壁的小切口突出，并将肾脚的血管在典型的设置中用无创伤微血管钳夹住45分钟。在此期间，将肾脏与原位钳一起重新定位到腹腔中以确保热缺血。45分钟后，打开并移除夹子，并如上所述通过缝合线闭合切口。通过在手术前放置到颈静脉中的聚乙烯导管静脉内给予测试化合物或载体。
[2061]
将化合物溶于适当的载体中，并在iri之前进行预防性给药或在iri完成后进行治疗性给药。施用的典型剂量为0.1-30mg/kg i.v.。将不合化合物的载体给予作为对照的动物。假对照动物经历了上述的整个过程，而没有关闭用于诱导缺血的夹子。
[2062]
在iri后第1天和第8天在麻醉下采集血液样本。在典型的情况下，在iri后8天处死动物，肾脏被取样并冷冻在液氮中。在另一种典型情况下，在iri后1天处死动物。
[2063]
在血浆样本中测量以评估肾功能的典型实验室参数是肌酐和尿素。为了测定肌酐
清除率，将动物饲养在代谢笼中并收集尿液至少16小时。在测定尿体积流量(vu)和测定尿和血浆肌酐浓度(分别为[crea]u和[crea]pl)后，根据标准公式计算肌酐清除率(cl
crea
)：cl
crea
＝vu＊[crea]u/[crea]pl
[2064]
rna提取和定量实时聚合酶链式反应：通过trizol方法从组织样本中提取总rna。在bioan-alyzer(agilent)上检查获得的rna的完整性。对于逆转录，首先将1μg总rna用不含rnase的dnase i(gibco)在室温下消化15分钟，然后使用promiscript(promega)进行逆转录，根据试剂盒供应商的标准方案，总反应体积为40μl。通过加热15分钟至65℃使酶失活后，将获得的cdna用二次蒸馏水(bidest.water)稀释至最终体积为150μl，每次pcr反应选择4μl。如所述进行实时pcr，其包括将原始数据标准化为细胞溶质β-肌动蛋白作为管家基因(ellinghaus等，2005)。结果表达式以任意单位给出。所用的寡核苷酸引物和探针的序列在表1中给出。
[2065]
5.猪主动脉球囊闭塞后肾缺血再灌注损伤(iri)
[2066]
所有程序均符合国家立法(德国动物保护法)和欧盟关于将动物用于科学目的的指令，并获得拜耳ag机构动物护理办公室和地区主管当局(lanuv recklinghausen)的批准。将体重优选为12至16公斤的雌性哥廷根小型猪(ellegaard，丹麦)用于实验。动物被随机分配到实验组。
[2067]
应用微创方法并进行了所述修改(simon等人，effects of intravenous sulfide during porcine aortic occlusion-induced kidney ische-mia/reperfusion injury.shock.2011；35：156-163；matejkova等人，carbamylated erythropoietin-fc fusion protein and recombinant human erythro-poietin during porcine kidney ischemia/reperfusion injury.intensive care med.2011；39：497-510)。简而言之：通过在术前肌肉注射后连续静脉内输注和使猪保持麻醉。气管内插管后，使用儿科呼吸器(avance cs2，ge healthcare)对动物进行人工通气，氧气空气混合物的潮气量为6至8ml/kg，呼气末正压(peep)恒定为3至4cm h2o且频率为13至20min-1
。调整通气以将动脉paco2保持在基线处约40mmhg。将导管放置于右颈静脉用于药物和液体给药。林格-乳酸盐溶液以10ml/kg/h的恒定速率静脉输注。动物接受50ie/kg肝素静脉输注。通常，在将必要的探头和导管安装到适当的压力传感器和记录设备上后，测量以下心血管和呼吸参数：中心静脉压(通过左颈静脉)、动脉血压和心率(bp和hr；通过左颈动脉)和心输出量(co)和全身血管阻力(svr)，通过使用放置在右颈动脉中的连接pulsion 4f热稀释-导管(pv2014l08n)的系统(pulsion，德国)。通过combitrans换能器(braun，ref 5203660)将用于测量cvp、bp和hr的导管安装到ponemah记录系统上。将fogarty闭塞导管(8f/14f，edwards lifesiences，ref 6208014f)通过左股动脉插入到腹主动脉中，以便将带有充气球囊的尖端置于肾动脉的上游。通过腹部小切口将导管引入膀胱并连续收集尿液。定期采集动脉血样，测定肌酐、尿素、肝酶、血细胞和化合物浓度。在stat(nova biomedical)血气分析仪上定期测定动脉血样中的动脉po2、pco2和ph。使用装备有2.0至5.0mhz广谱凸面换能器(c1-5-rs，ref 5384874)的logiq兽医超声设备(通用电气(general electrics))通过多普勒超
声测定阻力指数来评估肾灌注。肾阻力指数(rri)是评估患者急性肾损伤严重程度的合适参数(darmon等人，diagnostic accuracy of doppler renal resistive index for reversibility of acute kidney injury in critically ill patients.intensive care med.2011；37(1)：68-76)。
[2068]
当心血管参数显示稳定的基线(通常是手术后60分钟的情况)时，开始记录并收集基线参数的样本。连续测量hr和mabp并记录平均超过2分钟的间隔。在实验结束时，通过放血处死猪。
[2069]
肾脏损伤是通过用盐水对fogarty球囊导管的球囊加压而引起的，盐水立即中断了流向肾脏和腹部器官的血流，并导致球囊上游的主动脉血压急剧升高。肾血管的多普勒超声检查进一步证实了血流停止。在典型的实验中，主动脉保持闭塞90到120分钟，直到通过给球囊放气再灌注。再灌注后，林格-乳酸输注速度加倍至20ml/kg/h，以稳定血压并利尿。再灌注后监测所有参数长达6小时。
[2070]
将化合物溶于适当的载体中，并在iri之前进行预防性给药或iri完成后进行治疗性给药。施用的典型剂量为0.1-10mg/kg静脉输注。在典型实验中，每个剂量组在最多6只动物测试最多三个剂量。将不含化合物的赋形剂给予作为对照的动物。假对照动物经历了上述的整个过程而没有诱导缺血。
[2071]
作为再灌注后肾功能的量度，优选但并非唯一地使用利尿、血清肌酐、血清钾、血清碳酸氢盐和通过多普勒超声检查确定的电阻指数的变化。
[2072]
表22：序列表
[2073]
ischemia/reperfusion injury.proc natl acad sci u s a.2011；108(18)：7523-8
[2097]
·
sebesta and seebach，helv.chim.acta 2003，86，4061-4072
[2098]
·
shuai-shuai sun，junyou chen，rui zhao，donald bierer，jun wang，ge-min fang，yi-ming li tetrahedron letters 2019，60，1197-1201
[2099]
·
sieve et al.，regulation and function of endothelial glycocalyx layer in vascular diseases.vascul pharmacol.2018；100：26-33
[2100]
·
simon et al.，effects of intravenous sulfide during porcine aortic occlusion-induced kidney ischemia/reperfusion injury.shock.2011；35：156-163
[2101]
·
t.peleg-shulman et al.，j.med.chem.，2004，47，4897-4904
[2102]
·
tao wang，jian fan，xiao-xu chen，rui zhao，yang xu，donald bierer，lei liu，yi-ming li，jing shi，ge-min fang org.lett.2018，20，6074-6078
[2103]
·
tao wang，yi-fu kong，yang xu，jian fan，hua-jian xu，donald bierer，jun wang，jing shi，yi-ming li tetrahedron letters 2017，58，3970-3973；
[2104]
·
yang xu，tao wang，chao-jian guan，yi-ming li，lei liu，jing shi，donald bierer tetrahedron letters 2017，58，1677-1680
[2105]
·
ye guo，de-meng sun，feng-liang wang，yao he，lei liu，chang-lin tian angew.chem.int.ed.2015，54，14276-14281