一种脂质体包封的重组兽用促生长蛋白及其制备方法和应用与流程

本发明属于基因重组
技术领域：
及药剂领域，具体涉及一种脂质体包封的重组兽用促生长蛋白(liposome-coatedveterinaryrecombinantgrowth-promotingprotein，l-vrgp)及其制备方法和应用。
背景技术：
：脂质体又称人工膜泡，是两性分子分散于水相时，分子的疏水尾部倾向于聚集在一起，避开水相，而亲水头部暴露在水相，形成具有双分子层结构的的封闭囊泡，无毒、无免疫原性，可用于转基因，或制备药物。原核表达是蛋白重组的一种方法类别，是指通过基因克隆技术，将外源目的基因，通过构建表达载体并导入表达菌株的方法，使其在特定原核生物或细胞内表达。其优点在于能够短时间内获得基因表达产物，而且所需的成本相对比较低廉。方法也比较简单，可以表达的蛋白也比较多，适合大规模生产工艺。促生长蛋白常见的有生长激素和胰岛素生长因子，两者均为蛋白类物质。生长激素，是由垂体前叶分泌的含个氨基酸的单链多肽，几乎对所有组织的生长都有刺激作用。其促进生长的生理生化机制在于调节动物的蛋白质、脂肪和糖代谢。胰岛素生长因子是一种结构上相关的多肽类生长因子，是一种广谱性的促生长因子，是一类多功能细胞增殖调控因子，在细胞的分化、增殖，个体的生长、发育中具有很重要的促进作用。胰岛素生长因子的特点是，血清中的浓度受生长激素调节。大量研究工作表明，外源生长激素能够提高动物生长速度和饲料转化率，减少体脂、提高饲料转化率，具有明显的经济效益和社会效益。目前有相关机构研制出了重组猪生长激素、鸡生长激素等，但多不能口服，也有公司研制出了含有转导蛋白的猪生长激素融合蛋白，但这种口服蛋白在胃肠道蛋白酶的作用下很快会被分解而丧失原有的生物学活性。技术实现要素：本发明的目的就在于为了解决上述问题，提供脂质体包封的重组兽用促生长蛋白及其制备方法和应用，以提供一种可以同时对猪和鸡的促生长起作用，且半衰期较长的新型兽用促生长蛋白。本发明通过以下技术方案来实现上述目的：本发明提供了重组兽用促生长蛋白，该重组兽用促生长蛋白的编码基因核苷酸序列如seqidno:1所示，为猪生长激素氨基酸全长序列和鸡生长激素氨基酸全长序列通过柔性linker序列连接后，进行序列优化后获得的一种融合蛋白。本发明还提供了一种脂质体包封的重组兽用促生长蛋白，即采用脂质体将重组的融合蛋白包封在其中，可避免胃肠道蛋白酶的分解，同时脂质体更重要的是具有促进吸收的作用可导引蛋白的穿肠吸收。作为本发明的进一步优化方案，所述脂质体为由大豆卵磷脂制备获得；利用大豆卵磷脂做脂质体材料，成本较低且安全性高。本发明还提供了上述脂质体包封的重组兽用促生长蛋白的制备方法，步骤包括：步骤s1：人工合成所述重组兽用促生长蛋白的编码基因，并将该基因连接到蛋白表达载体上，获得重组质粒；步骤s2：将重组质粒导入感受态细胞中，构建含有所述重组兽用促生长蛋白的编码基因的重组工程菌；步骤s3：利用重组工程菌进行发酵表达，纯化，获得重组兽用促生长蛋白；步骤s4：利用脂质体包封所述目的蛋白，获得脂质体包封的重组兽用促生长蛋白。作为本发明的进一步优化方案，所述蛋白表达载体为pet32a质粒，所述感受态细胞为rosetta(de3)感受态细胞。作为本发明的进一步优化方案，所述脂质体包封方法的步骤包括：步骤s401：将大豆卵磷脂和胆固醇溶于污水乙醇中，冰浴超声溶解，制成膜材溶液；步骤s402：用磷酸盐缓冲液溶解重组兽用促生长蛋白，获得蛋白溶解液；步骤s403：将膜材溶液和蛋白溶解液的温度调节一致后混合，蒸发去除乙醇，滤膜过滤，得到脂质体包封的重组兽用促生长蛋白。本发明还提供了上述脂质体包封的重组兽用促生长蛋白在用于制备畜禽用促生长饲料添加剂中的应用。作为本发明的进一步优化方案，所述畜禽包括猪或鸡。作为本发明的进一步优化方案，该脂质体包封的重组兽用促生长蛋白的饲料添加量为每100kg饲料添加10g。本发明的有益效果在于：本发明与现有技术相比有如下特点：1)本发明为基于猪生长激素和鸡生长激素所制备脂质体封包的融合蛋白，可同时对猪和鸡的生长起促进作用。2)本发明采用融合蛋白的形式，蛋白分子量较大约为50kd，可以较好的解决半衰期短的问题。3)本发明用重组的方式生产兽用促生长激素，较提取的方法简单且成本低，可以广泛应用于饲料添加剂。附图说明图1为重组兽用促生长蛋白wb验证图；图中，m：蛋白marker26616、泳道1：未进行优化的菌株产物使用猪生长激素抗体验证图、泳道2：序列优化后使用猪生长激素抗体验证图、泳道3：序列优化后使用鸡生长激素抗体验证图；图2为制备的重组促生长蛋白脂质体电镜照片；图3为大鼠血清重组兽用促生长蛋白浓度随时间变化图。具体实施方式下面对本申请作进一步详细描述，有必要在此指出的是，以下具体实施方式只用于对本申请进行进一步的说明，不能理解为对本申请保护范围的限制，该领域的技术人员可以根据上述申请内容对本申请作出一些非本质的改进和调整。实施例1：脂质体包封的重组兽用促生长蛋白的制备(1)重组兽用促生长蛋白的基因序列的获取：参考genbank登录号x53325.1，取猪生长激素氨基酸全长序列，参考genbank登录号m35609.1，取鸡生长激素氨基酸全长序列，上游添加酶切位点bamhⅰ、猪生长激素序列和鸡生长激素序列之间使用柔性linker以保护目的片段的空间结构，下游添加酶切位点ecorⅰ，并对序列进行优化，将经序列优化后的目的基因序列送华大基因合成，测序合格，获得如seqidno:1所示的目标基因序列，其中，柔性linker序列如seqidno：2所示。同时，取上述猪生长激素氨基酸全长序列和鸡生长激素氨基酸全长序列，上游添加酶切位点bamhⅰ、猪生长激素序列和鸡生长激素序列之间使用柔性linker以保护目的片段的空间结构，下游添加酶切位点ecorⅰ，作为对照序列，送华大基因合成。(2)工程菌构建：使用bamhⅰ和ecorⅰ两种内切酶对两个合成的基因及pet32a质粒进行双酶切，将双酶切产物使用连接酶连接，并导入rosetta(de3)感受态细胞中，涂布于氨苄lb平板上，37℃恒温培养，挑取氨苄lb平板上长出的菌落送华大基因测序鉴定目的基因，测序结果与目的基因一致，表示表达载体构建成功，记为vrgp工程菌。(3)发酵表达及纯化取经测序vrgp工程菌于摇床37℃，220r/min培养至od600为2左右，加入1‰的iptg，随即将摇床的温度调为32℃，约5小时后收获。7000rpm4℃离心15min，取上请即为目的蛋白vrgp粗制品。采用gechelatingsepharosefastflowni2+螯合填料装填gexk50自装柱，以3倍柱体积纯水清洗ni2+亲和层析柱，后配制3倍柱体积bindingbuffera(7.16g/lna2hpo4·12h2o，29.22g/lnacl，3.06g/l咪唑，ph8.0)过柱平衡并实时检测电导率及uv280nm吸收值，待二者皆稳定后开始上样。上样完毕后，继续以bindingbuffera平衡层析柱直至uv280nm吸收值稳定为止。配制elutionbuffera(7.16g/lna2hpo4·12h2o，29.22g/lnacl，34g/l咪唑，ph8.0)过柱进行洗脱，当uv280nm吸收值开始上升时收集洗脱液，直至吸收值下降至稳定水平时停止收集。以5倍柱体积超纯水清洗层析柱，后加入20％乙醇封存。将收集的洗脱液置于20倍柱体积pbs缓冲液中透析12h。使用冰乙酸快速调节ph值至5.0±0.2，12000rpm15min离心后收集上清。以流速5ml/min超纯水冲洗层析柱至出液端液体ph为中性。配制bindingbufferb(4.1g/l乙酸钠，ph5.0±0.2)平衡层析柱，至出液端液体ph与bindingbufferb一致。以流速3ml/min上样，待uv280nm吸收值开始上升时收样。上样结束后以bindingbufferb平衡层析柱至uv280nm吸收值下降时停止收样。以2倍柱体积2mnacl处理层析柱，再以2倍柱体积2mnacl-1mnaoh处理层析柱并加超纯水冲洗层析柱至ph中性，最后加入10mmnaoh封存。将上样前后平衡层析柱收集的样品进行无菌过滤处理，处理后样品即为纯化的目的蛋白，记为vrgp。使用biorbyt公司猪生长激素抗体(orb24331)、鸡生长激素抗体(orb176913)为第一抗体，使用biorbyt公司山羊抗鼠igg(hrp标记)为第二抗体做wb，如图1所示，本发明样本在50kd处有阳性条带，表明表达蛋白为猪生长激素和鸡生长激素的融合蛋白，而未优化的对照样本无条带，说明未优化的序列连接后并没有正常表达。(4)脂质体包封的重组兽用促生长蛋白的制备将纯度为98％的大豆卵磷脂100g和胆固醇60g溶于500ml无水乙醇中，300w冰浴超声10分钟，超声1s间歇1s，超声2次，溶解制成膜材溶液，并置于42℃水浴待用；取重组兽用促生长蛋白1g溶解于100mlph7.0的磷酸盐缓冲液中，置于37℃水浴。待两者温度达到后将两者混合搅拌10min，旋转蒸发除去乙醇。使用0.45μm滤膜过滤得到脂质体包封的重组兽用促生长蛋白，呈双层囊膜结构，其粒径约100nm，见图2。记为l-vrgp。实施例2：脂质体包封的重组兽用促生长蛋白口服后血清浓度检测选取健康雄性sd大鼠(购自安徽省实验动物中心)5只，体重约200克。禁食不禁水12h后取实施例1所制备的脂质体包封的重组兽用促生长蛋白pbs稀释至1mg/ml，每只大鼠灌胃给予1ml。分别于试验开始前(0h)和灌胃后1、3、5、7、12、18、24h鼠尾取血200μl，4℃放置1h，7000rpm离心15分钟分离血清，立即冻存于-70℃，最后一次采血后也冻存于-70℃2h以上冻实，保证所有血清在进行elisa检测时均冻融了1次。本重组蛋白为猪生长激素和鸡生长激素的融合蛋白，选择价格便宜的鸡生长激素elisa测定试剂盒biorbyt(orb439751)，按说明书操作，测定大鼠血清中鸡生长素的含量，即可表示重组兽用促生长蛋白在大鼠血清中的含量。sd大鼠口服脂质体包封的重组兽用促生长蛋白后1h血清中即可检出，至5小时达到峰值浓度(98ng/ml)，达到峰值后开始缓慢下降，半衰期大约22h，如表1和图1所示，可以看出，本申请的兽用促生长蛋白的半衰期比现有常规产品要长，提示饲喂周期可以1-2天1次。表1大鼠血清vrgp浓度随时间变化表时间(h)01357121824浓度(ng/ml)018659896756237实施例3：脂质体包封的重组兽用促生长蛋白促生长性能验证取实施例1制备的脂质体包封的重组兽用促生长蛋白，按100kg饲料添加10gl-vrgp进行配比搅拌混匀。饲料选用安徽新康饲料厂生产的猪通用型饲料和鸡通用型饲料。分别添加l-vrgp0.1mg/g的饲料记为饲料a，未添加l-vrgp的普通饲料记为饲料b，添加vrgp0.1mg/g的饲料记为饲料c。选取21日龄、体重在250±50g的白羽仔鸡30只，雌雄各半，随机分成3组，每组10只，做脚标。选取60日龄、体重在20±0.5kg的健康三元仔猪30头，公母各半，随机分成3组，每组10头，打耳标。a组：10只21日龄白羽鸡、10头60日龄猪，饲喂饲料a；b组：10只21日龄白羽鸡、10头60日龄猪，饲喂饲料b；c组：10只21日龄白羽鸡、10头60日龄猪，饲喂饲料c；于相同条养殖，鸡饲喂养殖14天，猪饲喂养殖30天。饲喂期内未出现死亡及发病情况，饲喂添加脂质体包封的重组兽用促生长激素饲料的a组：猪平均体重增加1.42kg/只/天，鸡平均体重增加40.4g/只/天；饲喂普通饲料的b组：猪平均体重增加0.74kg/只/天，鸡平均体重增加30.7g/只/天；饲喂添加重组兽用促生长激素饲料的c组：猪平均体重增加0.99kg/只/天，鸡平均体重增加35.9g/只/天。白羽仔鸡组：a组较b组日均增重增长31.6％，a组较c组日均增重增长12.6％。三元仔猪组：a组较b组日均增重增长91.9％，a组较c组日均增重增长43.4％；如下表所示。说明本发明脂质体包封的重组兽用促生长蛋白相比重组兽用促生长蛋白对猪和鸡都有较好的促生长的作用。表2生长性能统计表(三元仔猪：kg，白羽仔鸡：g)以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。序列表<110>安徽中起生物科技有限公司<120>一种脂质体包封的重组兽用促生长蛋白及其制备方法和应用<141>2021-01-15<160>2<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>1356<212>dna<213>人工序列()<400>1ggatccatggcggcgggcccgcgcaccagcgcgctgctggcgtttgcgctgctgtgcctg60ccgtggacccgcgaagtgggcgcgtttccggcgatgccgctgagcagcctgtttgcgaac120gcggtgctgcgcgcgcagcatctgcatcagctggcggcggatacctataaagaatttgaa180cgcgcgtatattccggaaggccagcgctatagcattcagaacgcgcaggcggcgttttgc240tttagcgaaaccattccggcgccgaccggcaaagatgaagcgcagcagcgcagcgatgtg300gaactgctgcgctttagcctgctgctgattcagagctggctgggcccggtgcagtttctg360agccgcgtgtttaccaacagcctggtgtttggcaccagcgatcgcgtgtatgaaaaactg420aaagatctggaagaaggcattcaggcgctgatgcgcgaactggaagatggcagcccgcgc480gcgggccagattctgaaacagacctatgataaatttgataccaacctgcgcagcgatgat540gcgctgctgaaaaactatggcctgctgagctgctttaaaaaagatctgcataaagcggaa600acctatctgcgcgtgatgaaatgccgccgctttgtggaaagcagctgcgcgtttggcggc660ggcggcagcggcggcggcggcagcggcggcggcggcagcatggcgccgggcagctggttt720agcccgctgctgattgcggtggtgaccctgggcctgccgcaggaagcggcggcgaccttt780ccggcgatgccgctgagcaacctgtttgcgaacgcggtgctgcgcgcgcagcatctgcat840ctgctggcggcggaaacctataaagaatttgaacgcacctatattccggaagatcagcgc900tataccaacaaaaacagccaggcggcgttttgctatagcgaaaccattccggcgccgacc960ggcaaagatgatgcgcagcagaaaagcgatatggaactgctgcgctttagcctggtgctg1020attcagagctggctgaccccggtgcagtatctgagcaaagtgtttaccaacaacctggtg1080tttggcaccagcgatcgcgtgtttgaaaaactgaaagatctggaagaaggcattcaggcg1140ctgatgcgcgaactggaagatcgcagcccgcgcggcccgcagctgctgcgcccgacctat1200gataaatttgatattcatctgcgcaacgaagatgcgctgctgaaaaactatggcctgctg1260agctgctttaaaaaagatctgcataaagtggaaacctatctgaaagtgatgaaatgccgc1320cgctttggcgaaagcaactgcaccatttaggaattc1356<210>2<211>60<212>dna<213>人工序列()<400>2ggcggcggcggcagcggcggcggcggcagcggcggcggcggcagcatggcgccgggcagc60当前第1页12