一种靶向IL-16基因的sgRNA、质粒组及基因敲除方法和应用与流程

本发明涉及基因工程
技术领域：
，特别是涉及一种靶向il-16基因的sgrna、质粒组及基因敲除方法和应用。
背景技术：
：il-16也被称为淋巴细胞趋化因子。目前，尚未发现与其同家族的其它细胞因子，在不同物种间，其具有高度保守性。人的il-16基因全长153kbp，位于人类基因位于15q26.3染色体上。il-16前体蛋白其含有631个氨基酸，分子量为80kda。一旦被激活，储存在细胞中的前体il-16就会被caspase-3分子切割，含有n末端结构域的部分形成分子量为60kda的非分泌型蛋白；含有c末端结构域的部分形成分子量为20kda分泌型蛋白。在淋巴细胞中，含有n末端结构域的分子可以和转录因子结合，进而影响细胞周期。而成熟的含有c末端结构域的il-16可以从细胞中分泌，和相应的配体结合。il-16表达水平在各种疾病的发病机制中起着重要的作用，如骨质疏松症、肾细胞癌、阿尔茨海默病、炎症性肠病等。但现有技术中还未有关于稳定敲除白血病肿瘤细胞内的il-16基因对其影响的报道。技术实现要素：为了解决上述问题，本发明提供了一种靶向il-16基因的sgrna、质粒组及基因敲除方法和应用。本发明提供的靶向il-16基因的sgrna能够稳定敲除白血病肿瘤细胞内的il-16基因，从而使得白血病肿瘤细胞停滞于g0期，进而影响肿瘤细胞的增殖。为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：本发明提供一种靶向il-16基因的sgrna，所述sgrna包括sgrna1或sgrna2；所述sgrna1包括sgrna1-s和sgrna1-a；所述sgrna1-s的核苷酸序列如seqidno.1所示，所述sgrna1-a的核苷酸序列如seqidno.2所示；所述sgrna2包括sgrna2-s和sgrna2-a；所述sgrna2-s的核苷酸序列如seqidno.3所示，所述sgrna2-a的核苷酸序列如seqidno.4所示。本发明还提供一种用于敲除il-16基因的质粒组，所述质粒组包括sgrna1质粒组或sgrna2质粒组；所述sgrna1质粒组包括sgrna1-s质粒和sgrna1-a质粒；所述sgrna1-s质粒包括上述方案所述的sgrna1-s和px330质粒；所述sgrna1-a质粒包括上述方案所述的sgrna1-a和px330质粒；所述sgrna2质粒组包括sgrna2-s质粒和sgrna2-a质粒；所述sgrna2-s质粒包括上述方案所述的sgrna2-s和px330质粒；所述sgrna2-a质粒包括上述方案所述的sgrna2-a和px330质粒。优选的，所述px330质粒包括经bbsⅰ酶后的px330大片段质粒。优选的，所述sgrna1-s、sgrna1-a、sgrna2-s或sgrna2-a与px330质粒的摩尔比独立为10:1。优选的，所述sgrna1-s和sgrna1-a的摩尔比为1:1；所述sgrna2-s和sgrna2-a的摩尔比为1:1。本发明还提供一种利用crispr/cas9系统敲除肿瘤细胞中il-16基因的方法，包括以下步骤：将上述方案所述质粒组导入肿瘤细胞中，得到敲除il-16基因的肿瘤细胞。优选的，所述肿瘤细胞包括白血病肿瘤细胞；所述白血病包括急性髓系白血病、急性淋系白血病和慢性髓系白血病。本发明提供一种利用上述方案所述方法构建得到的il-16基因敲除的白血病细胞系。本发明还提供了上述方案所述sgrna或上述方案所述的质粒组在制备抑制肿瘤增殖药物中的应用。本发明还提供了上述方案所述sgrna或上述方案所述的质粒组在制备治疗白血病药物中的应用；所述白血病包括急性髓系白血病、急性淋系白血病和慢性髓系白血病。本发明提供了一种靶向il-16基因的sgrna，所述sgrna包括sgrna1或sgrna2；所述sgrna1包括sgrna1-s和sgrna1-a；所述sgrna1-s的核苷酸序列如seqidno.1所示，所述sgrna1-a的核苷酸序列如seqidno.2所示；所述sgrna2包括sgrna2-s和sgrna2-a；所述sgrna2-s的核苷酸序列如seqidno.3所示，所述sgrna2-a的核苷酸序列如seqidno.4所示。本发明提供的靶向il-16基因的sgrna能够稳定敲除白血病肿瘤细胞内的il-16基因，从而使得白血病肿瘤细胞停滞于g0期，进而影响肿瘤细胞的增殖。附图说明图1为应用例2中不同质粒组对于il-16基因的敲除效果图；图2为应用例5中敲除il-16基因对急性髓系白血病细胞系的影响图；图3为应用例5中敲除il-16基因对慢性髓系白血病细胞系的影响图；图4为应用例5中敲除il-16基因对急性淋系白血病细胞系的影响图；图5为应用例5中敲除il-16基因对急性髓系白血病细胞系细胞周期的影响图；图6为应用例5中敲除il-16基因对慢性髓系白血病细胞系细胞周期的影响图；图7为应用例5中敲除il-16基因对急性淋系白血病细胞系细胞周期的影响图；图8为应用例6中接种敲除il-16基因的急性髓系白血病细胞对小鼠存活时间的影响图；图9为应用例6中接种敲除il-16基因的慢性髓系白血病细胞对小鼠存活时间的影响图；图10为应用例6中接种敲除il-16基因的急性淋系白血病细胞对小鼠存活时间的影响图。具体实施方式如无特殊要求，本发明所用试剂均为本领域技术人员常规购买所得。本发明提供了一种靶向il-16基因的sgrna，所述sgrna包括sgrna1或sgrna2；所述sgrna1包括sgrna1-s和sgrna1-a；所述sgrna1-s的核苷酸序列如seqidno.1所示，所述sgrna1-a的核苷酸序列如seqidno.2所示；所述sgrna2包括sgrna2-s和sgrna2-a；所述sgrna2-s的核苷酸序列如seqidno.3所示，所述sgrna2-a的核苷酸序列如seqidno.4所示。本发明根据il-16基因(geneid是ncbigeneid:3603)序列特点设计sgrna1和sgrna2，用于il-16基因的敲除。在本发明中，所述sgrna1-s的核苷酸序列如seqidno.1所示，具体如下：caccgcagctggcagacacatcgg；所述sgrna1-a的核苷酸序列如seqidno.2所示，具体如下：aaacccgatgtgtctgccagctgc；所述sgrna2-s的核苷酸序列如seqidno.3所示，具体如下：caccgctgctcaactccaagcagc；所述sgrna2-a的核苷酸序列如seqidno.4所示，具体如下aaacgctgcttggagttgagcagc；所述核苷酸序列seqidno.1～4中下划线处为bbsⅰ酶的酶切位点的核苷酸序列。本发明提供了一种用于敲除il-16基因的质粒组，所述质粒组包括sgrna1质粒组或sgrna2质粒组；所述sgrna1质粒组包括sgrna1-s质粒和sgrna1-a质粒；所述sgrna1-s质粒包括权利要求1所述的sgrna1-s和px330质粒；所述sgrna1-a质粒包括权利要求1所述的sgrna1-a和px330质粒；所述sgrna2质粒组包括sgrna2-s质粒和sgrna2-a质粒；所述sgrna2-s质粒包括权利要求1所述的sgrna2-s和px330质粒；所述sgrna2-a质粒包括权利要求1所述的sgrna2-a和px330质粒。在本发明中，所述px330质粒优选包括经bbsⅰ酶后的px330大片段质粒；所述sgrna1-s、sgrna1-a、sgrna2-s或sgrna2-a与px330质粒的摩尔比独立优选为10:1；所述sgrna1-s和sgrna1-a的摩尔比优选为1:1；所述sgrna2-s和sgrna2-a的摩尔比优选为1:1；所述sgrna1-s、sgrna1-a、sgrna2-s或sgrna2-a与px330质粒连接前优选进行退火处理；所述退火的反应体系以10μl计，优选包括退火pbbuffer1μl，sgrna1-s和sgrna1-a各1μl，或sgrna2-s和sgrna2-a各1μl；所述sgrna1-s、sgrna1-a、sgrna2-s和sgrna2-a的浓度均优选为100μmol·l-1；所述退火的反应条件优选为95℃退火5min。本发明还提供一种利用crispr/cas9系统敲除肿瘤细胞中il-16基因的方法，包括以下步骤：将上述方案所述质粒组导入肿瘤细胞中，得到敲除il-16基因的肿瘤细胞。本发明将上述方案所述质粒组导入肿瘤细胞中，得到敲除il-16基因的肿瘤细胞。在本发明中，所述肿瘤细胞优选包括白血病肿瘤细胞；所述白血病优选包括急性髓系白血病、急性淋系白血病和慢性髓系白血病。本发明还提供了一种利用利用上述方案所述方法构建得到的il-16基因敲除的白血病细胞系。本发明还提供了上述方案所述sgrna或上述方案所述质粒组在制备抑制肿瘤增殖药物中的应用。本发明还提供了上述方案所述sgrna或上述方案所述的质粒组在制备治疗白血病药物中的应用；所述白血病包括急性髓系白血病、急性淋系白血病和慢性髓系白血病。本发明通过利用上述方案所述sgrna或上述方案所述的融合载体可以稳定敲除白血病肿瘤细胞中的il-16基因，从而使得肿瘤细胞停滞于g0期，进而影响肿瘤细胞的增殖。为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的一种靶向il-16基因的sgrna、方法及其应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。实施例1一种用于敲除il-16基因的质粒组，构建方法如下：(1)将px330用bbsⅰ酶切后，胶回收主要大片段备用。(2)设计得到的sgrna，具体如下：sgrna1-s：caccgcagctggcagacacatcgg(seqidno.1)；sgrna1-a：aaacccgatgtgtctgccagctgc(seqidno.2)；将sgrna1-s和sgrna1-a分别退火形成含有bbsⅰ粘性末端的双链结构。10μl体系，内含退火pbbuffer1μl，sgrna1-s和sgrna1-a各1μl(浓度为100μmol·l-1)，95℃退火5min，备用。(3)连接：10μl体系，内含载体50ng，插入片段与载体摩尔比10:1，t4buffer1μl，t4连接酶1μl，16℃过夜。(4)将连接产物转化，挑取克隆进行测序鉴定，得到sgrna1-s质粒和sgrna1-a质粒。感受态细胞的制备(1)划线涂板：用灭菌的接种环蘸取少量e.colidh5α菌液，在不含抗生素的lb琼脂平板上划线，使菌液逐渐稀释，倒置放于37℃细菌培养箱，过夜培养12～14h。(2)挑取单菌落，接种到5ml不含抗生素的lb培养基中，37℃，250rpm摇过夜。(3)取2ml浑浊的菌液接种到200ml不含抗生素的lb培养基中，37℃振荡培养2～3h，每半小时测一次od600，使其达到0.4～0.6。(4)将该菌液冰浴20min，将冰浴后的菌液转移至预冷的50ml离心管中，4℃，4000rpm，10min离心。(5)弃上清。用20ml预冷的0.1mcacl2溶液重悬细菌沉淀。4℃，4000rpm，10min离心。(6)弃上清。按每50ml菌液加入2ml预冷的含20％无菌甘油的0.1mcacl2溶液重悬细胞沉淀。(7)分装(50μl/管)，快速放于液氮中冷冻，再放入-80℃保存。质粒的快速热激活转化(1)将50μle.colidh5α感受态细胞放到冰上融化，加入1～10ng质粒，轻柔混匀。(2)将感受态细胞与质粒的混合液放到冰上，静置30min。(3)将上述混合液在42℃水浴中进行热激活(90s)，热激后迅速放到冰上，静置2min。(4)取适量热激后的感受态细胞均匀涂到有抗生素的lb琼脂平板上。(5)将lb平板倒置放于37℃细菌培养箱，培养12～16h。可以见到许多独立的细菌菌落。质粒的小提(1)挑取转化后的单菌落，接种到3～5ml含有抗生素的lb培养基中，37℃剧烈振摇下培养过夜。(2)12000rpm，1min离心，收集细菌沉淀。加入250μlp1buffer(50mmtriscl，10mmedta，100μg/mlrnasea)，振荡混匀。(3)加入250μlp2buffer(200mmnaoh，1％sds)，轻柔颠倒混匀。(4)加入350μln3buffer(3.0mnaac，ph5.5)，轻柔颠倒混匀。(5)13000rpm，10min离心。(6)小心吸取上清，加入qiaprep离心柱中。12000rpm，1min离心，弃废液。(7)加入0.75mlpebuffer(1.0mnacl，50mmmops，15％异丙醇)漂洗，12000rpm，1min离心，弃废液。(8)12000rpm，2min离心，以去除残留的漂洗液。(9)加入50μlebbuffer(10mmtriscl，ph8.5)，室温放置1min。12000rpm，1min离心洗脱质粒。质粒的中提或大提(1)挑取转化后的单菌落，接种到3～5ml含有抗生素的lb培养基中，37℃剧烈振摇下培养8h。(2)按1/500到1/1000的比例将菌液接种到含有抗生素的lb培养基中，37℃剧烈振摇下培养12～16h。(3)4℃，6000g，15min离心，收集菌体。(4)用4ml(中提)或10ml(大提)p1buffer(50mmtriscl，10mmedta，100μg/mlrnasea)重悬细菌沉淀。(5)加入4ml(中提)或10ml(大提)p2buffer(200mmnaoh，1％sds)，轻柔混匀，室温放置5min。(6)加入4ml(中提)或10ml(大提)预冷的p3buffer(3.0mnaac，ph5.5)，轻柔混匀，冰上放置20min。(7)4℃，20000g，30min离心。重复一次。(8)将4ml(中提)或10ml(大提)qbtbuffer(750mmnacl，50mmmops，15％异丙醇，0.15％tritonx-100)加到qiagen-tip进行柱平衡。(9)将离心后的上清液加入到平衡好的qiagen-tip柱子中。液体在重力的作用下流出。(10)用10ml(中提)或30ml(大提)qcbuffer(1.0mnacl，50mmmops，15％异丙醇)漂洗qiagen-tip柱子。重复一次。(11)用5ml(中提)或15ml(大提)qfbuffer(1.25mnacl，50mmtriscl，15％异丙醇)洗脱质粒。(12)向洗脱后的质粒中加入3.5ml(中提)或10.5ml(大提)异丙醇。混匀后，4℃，8000g，40min离心。管底部可以见到dna沉淀。13)弃上清。加入2ml(中提)或5ml(大提)70％乙醇漂洗沉淀。4℃，6000g，60min离心。(13)弃上清。室温干燥5～10min。加入tebuffer(10mmtriscl，ph8.0)溶解质粒。实施例2采用实施例1相同的方法构建质粒组，唯一区别在于，sgrna，具体如下：sgrna2-s：caccgctgctcaactccaagcagc(seqidno.3)；sgrna2-a：aaacgctgcttggagttgagcagc(seqidno.4)。对比例1采用实施例1相同的方法构建质粒组，唯一区别在于，sgrna，具体如下：sgrna3-s：caccgatgctcaactccaagcagc(seqidno.5)；sgrna3-a：aaacgatgcttcgagttgacctgc(seqidno.6)。对比例2采用实施例1相同的方法构建质粒组，唯一区别在于，sgrna，具体如下：sgrna4-s：caccgatgctcatctcgaaccagc(seqidno.7)；sgrna4-a：aaacgaagcttgcagttgtcgagc(seqidno.8)。对比例3采用实施例1相同的方法构建质粒组，唯一区别在于，sgrna，具体如下：sgrna5-s：caccgaaggacaaccttaagcagc(seqidno.9)；sgrna5-a：aaacgatccatgcagatgaccagc(seqidno.10)。对比例4采用实施例1相同的方法构建质粒组，唯一区别在于，sgrna，具体如下：sgrna6-s：caccgatgctcttctggaagcagc(seqidno.11)；sgrna6-a：aaacgatgcatggagatgaccacc(seqidno.12)。应用例1质粒的鉴定质粒的质量检测使用nanophotometertmpearl(implen)超微量紫外可见分光光度计分别测定实施例1和2和对比例1～4质粒浓度及纯度。记录质粒浓度、od260/280比值。结果见表1。表1不同序列对质粒浓度、od260/280比值质粒质粒浓度od260/280对比例10.512/0.5891.80/1.76对比例20.419/0.6271.75/1.75对比例30.523/0.6781.74/1.71对比例40.589/0.5781.80/1.68实施例10.612/0.6121.81/1.79实施例20.718/0.7111.80/1.69质粒电转进入肿瘤细胞(1)将处于对数生长期的急性髓系白血病肿瘤细胞消化后，270g，3min离心。(2)pbs洗一遍，270g，3min离心。重复一次。(3)细胞计数。按1×107个细胞/800μl的密度，用pbs重悬细胞沉淀。(4)向细胞悬液中加入实施例1制备的sgrna1-a质粒和sgrna1-s质粒各3μg，混匀后，转入电转杯。(5)电穿孔：以230v、500μf、800ω的条件进行esc的电穿孔。(6)电穿孔后，将esc室温静置2min，加入细胞培养基后，静置3min。(8)将电穿孔后的细胞接种到铺有饲养层细胞的10cm细胞培养皿中。37℃，5％co2条件下培养。(9)培养24h后，加g418药物进行克隆的筛选，得到il-16敲除的急性髓系白血病肿瘤细胞系。应用例2采用应用例1相似的方法将实施例2和对比例1～4制备的质粒电转进入急性髓系白血病肿瘤细胞。elisa对敲除效果检测1.将1×105白血病肿瘤细胞系铺于24孔板中，24h后收集细胞培养上清。2.将捕获抗体包被过夜(96孔细胞elisa板)；洗板3次，封闭室温1h；洗板3次，加入培养上清100ul/孔，室温2h；洗板3～5次，加检测抗体，室温1h；洗板3～5次，加hrp过氧化物酶，室温30min；洗板3～5次，加tmb室温15min；加终止液，50μl/孔，上机检测。检测结果见图1和表1。表1不同质粒组对于il-16基因敲除的效果注：表1中的1、2和3表示同一次实验中三个重复实验，其中图1是以三个重复实验的平均值绘制的柱状图。由图1可知，本发明实施例1和2制备的质粒对于il-16基因的敲除效率最高。应用例3采用应用例相同的方法制备il-16敲除的急性淋系白血病肿瘤细胞系和慢性髓系白血病肿瘤细胞系。应用例4采用相似的方法制备il-16敲除的急性淋系白血病肿瘤细胞系和慢性髓系白血病肿瘤细胞系，唯一区别在于，步骤(4)加入的质粒为实施例2制备的sgrna2-a质粒和sgrna2-s质粒。应用例5cck-8检测il-16基因敲除对肿瘤细胞系增殖能力影响1、按照2×104每孔接种(nb4、nalm-6、k562)细胞到96孔细胞培养板内。2、将培养板在培养箱孵育24h、48h及72h。3、向每孔加入10μlcck-8溶液。4、将培养板在培养箱内孵育1小时。5、用酶标仪测定在450nm处的吸光度。24h、48h及72h通过cck-8以及计数的方法检测对肿瘤细胞系nb4(急性髓系白血病细胞系)、k562(慢性髓系白血病)和nalm-6(急性淋系白血病)增殖效果影响，结果见图2～4和表2～4；利用流式检测il-16基因敲除对肿瘤细胞系细胞周期的影响，结果见图5～7和表5～7；其中对照组为未进行il-16基因敲除的细胞系，序列一组为利用实施例1的质粒组进行il-16基因敲除的细胞系，序列二组为利用实施例2的质粒组进行il-16基因敲除的细胞系。表2敲除il-16基因对急性髓系白血病细胞系的影响注：表2中的1和2表示同一次实验中两个重复，其中图2是以两个重复的平均值绘制的柱状图。表3敲除il-16基因对慢性髓系白血病细胞系的影响注：表3中的1和2表示同一次实验中两个重复，其中图3是以两个重复的平均值绘制的柱状图。表4敲除il-16基因对急性淋系白血病细胞系的影响注：表4中的1和2表示同一次实验中两个重复，其中图4是以两个重复的平均值绘制的柱状图。表5敲除il-16基因对急性髓系白血病细胞系的影响注：表5中的1和2表示同一次实验中两个重复，其中图5是以两个重复的平均值绘制的柱状图。表6敲除il-16基因对慢性髓系白血病细胞系的影响注：表6中的1和2表示同一次实验中两个重复，其中图6是以两个重复的平均值绘制的柱状图。表7敲除il-16基因对急性淋系白血病细胞系的影响注：表7中的1和2表示同一次实验中两个重复，其中图7是以两个重复的平均值绘制的柱状图由图2～4和表2～4可以看出敲除il-16基因后，可以明显抑制急性髓系白血病肿瘤细胞、急性淋系白血病肿瘤细胞或慢性髓系白血病肿瘤细胞的增殖。由图5～7和表5～7可以看出敲除il-16基因后，可以使细胞集中在细胞周期g0/1期，从而影响急性髓系白血病肿瘤细胞、急性淋系白血病肿瘤细胞或慢性髓系白血病肿瘤细胞的增殖。应用例6体内评价il-16基因敲除，对荷瘤小鼠存活率影响1.nod/scid小鼠(雌性，4～6周)，分别尾静脉注射5×105个肿瘤细胞系细胞。2.三天后，进行化疗，化疗方案为长春新碱(0.5mg/kg，每周1次)、地塞米松(2mg/kg，每周5天)和l-天冬酰胺酶(1000iu/kg，每周5天，2周)。3.记录小鼠存活情况。实验结果见图8～10和表8～10，其中对照组为未进行il-16基因敲除的细胞系细胞，序列一组为利用实施例1的质粒组进行il-16基因敲除的细胞系细胞，序列二组为利用实施例2的质粒组进行il-16基因敲除的细胞系细胞。表8接种敲除il-16基因的急性髓系白血病细胞对小鼠存活时间的影响注：表8中的死亡天数表示注射细胞第几天后出现小鼠死亡事件，1代表出现死亡，0代表没发生死亡，“-”代表小鼠全部死亡。表9接种敲除il-16基因的慢性髓系白血病细胞对小鼠存活时间的影响死亡天数对照组序列一组序列二组1710020100220102500126100291003110133-0135-0138-1140-0043-1145-1-46-1-47---注：表9中的死亡天数表示注射细胞第几天后出现小鼠死亡事件，1代表出现死亡，0代表没发生死亡，“-”代表小鼠全部死亡。表10接种敲除il-16基因的急性淋系白血病细胞对小鼠存活时间的影响注：表10中的死亡天数表示注射细胞第几天后出现小鼠死亡事件，1代表出现死亡，0代表没发生死亡，“-”代表小鼠全部死亡。由图8～10和表8～10可以看出，il-16基因敲除后，急性髓系白血病肿瘤细胞、急性淋系白血病肿瘤细胞或慢性髓系白血病肿瘤细胞增殖效果明显减弱，致死性明显降低。综上所述，本发明提供的靶向il-16基因的sgrna能够稳定敲除白血病肿瘤细胞内的il-16基因；而且利用本发明提供的sgrna敲除白血病肿瘤细胞内的il-16基因后，可以使细胞集中在细胞周期g0/1期，从而影响急性髓系白血病肿瘤细胞、急性淋系白血病肿瘤细胞或慢性髓系白血病肿瘤细胞的增殖，进而提高对急性髓系白血病、急性淋系白血病和慢性髓系白血病的治疗效果。虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可以做各种改动和修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。序列表<110>中国人民解放军总医院第五医学中心<120>一种靶向il-16基因的sgrna、质粒组及基因敲除方法和应用<160>12<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>24<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1caccgcagctggcagacacatcgg24<210>2<211>24<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2aaacccgatgtgtctgccagctgc24<210>3<211>24<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>3caccgctgctcaactccaagcagc24<210>4<211>24<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>4aaacgctgcttggagttgagcagc24<210>5<211>24<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>5caccgatgctcaactccaagcagc24<210>6<211>24<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>6aaacgatgcttcgagttgacctgc24<210>7<211>24<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>7caccgatgctcatctcgaaccagc24<210>8<211>24<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>8aaacgaagcttgcagttgtcgagc24<210>9<211>24<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>9caccgaaggacaaccttaagcagc24<210>10<211>24<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>10aaacgatccatgcagatgaccagc24<210>11<211>24<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>11caccgatgctcttctggaagcagc24<210>12<211>24<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>12aaacgatgcatggagatgaccacc24当前第1页12