一种治疗糖尿病肾病的中药单体荭草素

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1.本发明属于中药技术领域，涉及一种治疗糖尿病肾病的中药单体荭草素。


背景技术：

2.糖尿病肾病(dn)是糖尿病的主要微血管并发症之一，也是终末期肾病最常见的病因之一。虽然dn的发病是有多种因素造成的，但越来越多的糖尿病患者和动物模型显示，糖尿病肾病过程中足细胞的结构和功能异常，在糖尿病肾病的肾损伤的发生发展中起着重要的作用。足细胞是一种高度分化及终末分化的上皮细胞，在肾小球基底膜(gbm)的转运、肾小球滤过屏障的维持和肾小球滤过的调节等方面发挥着重要作用。由于足细胞修复和再生能力有限，足细胞损伤的程度被认为是dn预后的主要决定因素。
3.目前，临床dn患者的治疗方案非常有限，主要包括严格控制血糖、低蛋白饮食、使用血管紧张素ⅱ1型受体拮抗剂、血管紧张素ⅱ转换酶抑制剂等药物
3.。然而，现在仍然缺乏有效的治疗药物来保护足细胞。
4.当前中药医学在糖尿病及其并发症的防治中得到了广泛的应用
]
。葫芦巴是重要的中药材，具有降糖、保肝、降血脂、减肥、抗癌、抗炎、抗氧化、多种药理作用。众所周知，葫芦巴已经被认为是治疗dn有效的药物，但是葫芦巴的单体对糖尿病肾病的作用还没有研究，也没有任何公开文献报道。荭草素作为葫芦巴的主要成分之一，是葫芦巴中一种可分离的生物活性物质，具有许多生物活性和治疗作用，包括抗炎、抗糖尿病、抗氧化和自噬诱导作用，被广泛应用于各种生物活性研究中，但是并未用于治疗糖尿病肾病。荭草素是葫芦巴的重要生物活性成分之一，荭草素本身具有抗炎、抗氧化等多种功能，而氧化应激途径在糖尿病和dn的发病中起着非常重要的作用。目前，在dn和足细胞中对荭草素的研究很少。因此，深入了解荭草素对足细胞的保护作用，为临床治疗dn提供新的药物具有重要意义。
5.目前，自噬和线粒体自噬已被证明是通过减少细胞凋亡维持糖尿病肾病足细胞内稳态的关键，而且已有证据表明，荭草素可以诱导自噬，但是它对足细胞自噬诱导的作用尚不清楚。现研究发现，自噬活动受损与足细胞损伤有关，足细胞表现出高度的基础自噬，说明自噬对维持足细胞的稳态非常重要。tharaux等人发现内皮细胞和足细胞自噬协同保护糖尿病诱导的肾小球，uzut等人证实足细胞自噬减少加重了2型糖尿病肾病模型的蛋白尿，dong,c.等人等还发现hg在早期导致足细胞自噬增加，这是1型糖尿病肾病模型在这些条件下的生存机制之一。自噬是一个过程，自噬溶酶体是由细胞质蛋白质或细胞器的吞噬作用形成，并将其包合到囊泡中，与溶酶体融合以降解包涵体的含量，为了了解细胞自身的代谢需要和一些细胞器的更新。自噬已被证明是保护肾脏最重要的机制之一。线粒体是双膜结合的细胞器，通常被认为是细胞的“动力单位”，除了心脏，肾脏被认为是每个组织中密度最大的地方，一些研究表明，糖尿病肾病的特征是线粒体含量和功能降低，线粒体是高度动态的细胞器，在维持体内平衡方面发挥着重要作用，它们是一类高度变形的细胞器，不断地经历融合和分裂。在生理条件下，线粒体的形状是正常的，呈杆状或椭圆形，但在包括各种肾脏疾病在内的压力下，线粒体的形状变得肿胀、破裂成圆形。自噬对线粒体的选择性清除作
用与线粒体的生物活性密切相关，维持线粒体的稳定性，才能满足机体代谢需要。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于针对现有技术存在的缺点，寻求提供一种治疗糖尿病肾病的中药单体-荭草素，通过验证荭草素减轻高糖所致足细胞损伤的假说及其相关机制，揭示了一种保护足细胞的新方法，发现糖尿病肾病对治疗dn的潜在价值。
7.为了实现上述目的，本发明所述荭草素的化学结构式为：
[0008][0009]
荭草素是一种黄酮类单体化合物，分子式为c
21h20o11
，分子量为448.38，能用于治疗糖尿病肾病。
[0010]
本发明所述荭草素通过自噬降低高糖引起的线粒体肿胀和断裂的比率来保护线粒体，从而通过修复线粒体跨膜电位保护足细胞，抑制高糖诱导的细胞凋亡，实现糖尿病肾病的治疗。
[0011]
本发明与现有技术相比，通过基于足细胞线粒体自噬异常，探讨荭草素调节线粒体自噬的分子机制，为中药复方或单体治疗dn的筛选提供新思路；研究创新性探索荭草素的药物靶标，为治疗糖尿病肾病的新型药物研发提供理论基础, 而且采用中药单体荭草素治疗糖尿病肾病，疗效好，无毒副作用，荭草素来源广泛易得，成本低。
附图说明：
[0012]
图1为本发明所述荭草素保护足细胞免受汞诱导的细胞死亡结果图，其中a、 b为足细胞暴露于汞中，并用荭草素(120μm)处理48小时的结果图，c为足细胞暴露于荭草素(20、40、80、160、320和640μm)中48小时。用cck-8 测定细胞活力，并与未处理的对照细胞相对表达结果图，d为mpc-5细胞暴露于hg中，用荭草素(40、80和120μm)处理48小时，用cck-8法检测细胞活力，并与未处理的对照细胞比较表达结果图，多组间比较采用单因素方差分析 (anova)与对照组相比，*p《0.05和**p《0.01；与hg组相比，
#
p《0.05和
##
p《0.01。
[0013]
图2为本发明所述荭草素恢复hg抑制自噬的结果图，其中a为荭草素的安全浓度范围约为0-120um，高于120um具有细胞毒性；b为荭草素对高糖条件下肾脏足细胞具有保护作用，其作用在40-120um是呈剂量依赖性，c-e为在有效浓度范围可以降低足细胞的凋亡率，多组间比较采用单因素方差分析(anova)， *p《0.05。
[0014]
图3为本发明实施例中jc-10染色观察线粒体去极化结果图。
[0015]
图4为本发明实施例中荭草素通过增强足细胞的自噬来保护线粒体的实验结果图，其中a为免疫荧光共聚焦显微镜观察hg组、orientin(120μm)组和 3-ma组足细胞线粒体和lc3的变化，b为lc3位于足细胞线粒体的外膜上结果图，对照组平均共定位系数：0.58
±
0.03，hg组平均共定位系数：0.13
±
0.06，orientin 组平均共定位系数：0.65
±
0.05，3ma组平均共定位系数：0.22
±
0.03，比例尺为5μm，共定位系数是2-3个独立实验(n＝28-30个总场/组)的综合结果。
具体实施方式：
[0016]
下面通过实施例并结合附图对本发明作进一步说明。
[0017]
实施例：
[0018]
本实施例选择的动物模型如下：选择雄性c57bl/6j，5～6周龄的小鼠，室温保持在25士2℃，湿度保持在(55士5)％，小鼠自由进食，自由饮水，每天保持12h的昼夜循环；开始实验前，小鼠正常饮食饮水，适应环境2周，将50 只小鼠中随机选取8含只作为正常对照组，其余42只小鼠，使用含量60％的高脂饲料喂养小鼠4周后，连续腹腔注射5次小剂量(40mg/kg)链脲佐菌素 (stz)，1周后测小鼠随机血糖，随机血糖＞16.7mmol/l为小鼠糖尿病模型造模成功；继续喂养小鼠2月后，测量小鼠尿微量蛋白/肌酐，尿蛋白微量/肌酐＞ 30mg/kg为糖尿病肾病造模成功；将造模成功作为对照组，使用40-120μm荭草素的为orientin组，添加自噬抑制剂3-ma的为3-ma组，先证实了高糖引起了自噬耗竭，随后导致足细胞凋亡和线粒体损伤，但荭草素可以改变这一结果，通过对自噬或线粒体自噬在mpc-5小鼠足细胞中的作用进行了实验研究，证实其对dn的足细胞可能是一种保护因子，具体实验过程为：
[0019]
(1)荭草素恢复高糖刺激的mpc-5细胞凋亡减少
[0020]
凋亡检测是检测荭草素是否能减少汞诱导的mpc-5细胞凋亡的重要方法之一，高糖导致足细胞凋亡增加，但荭草素(120μm)逆转了这些结果(图1a， b)，然后采用cck-8法检测荭草素对hg诱导的mpc-5细胞的细胞毒作用及其对mpc-5细胞凋亡的影响，采用不同浓度的荭草素(20μm到640μm)处理 mpc-5细胞，可以观察到40-120μm的荭草素对mpc-5细胞没有明显的毒性作用，然而，当用160μm荭草素处理时，细胞存活率显著降低(图1c)，再用 cck-8检测试剂盒检测体外培养48h后的足细胞活力，以评价荭草素对hg所致足细胞损伤的保护作用，如图1d所示，与对照组相比，hg组细胞活力显著降低，而荭草素(40-120μm)呈剂量依赖性逆转，基于这些发现，在随后的实验中使用浓度为120μm的荭草素。
[0021]
(2)荭草素恢复了hg抑制的自噬
[0022]
为探讨荭草素(120μm)诱导的lc3的形成，将gfp-lc3质粒转染mpc-5 细胞，与对照组相比，高糖处理后细胞内gfp-lc3点状细胞数量明显减少，然而荭草素扭转了这种现象，而且自噬抑制剂3-ma逆转了orientin诱导的自噬增加。western blot显示高糖降低了lc3-i i/lc3-i的表达，但增加了p62的表达(图 2a，b)，lc3是自噬形成的重要生物标志物之一，p62是自噬降解的生物标志物之一，根据这些结果能够知道高糖可以降低自噬，而荭草素可以恢复自噬。为了揭示荭草素对mpc-5细胞的保护是否与自噬有关，采用了自噬抑制剂3-ma 进行实验，在治疗组中，荭草素增加了高糖诱导的lc3，降低了p62的表达，然而，当添加3-ma时，结果正好相反，这些结果说明，荭草素对高糖诱导的细胞凋亡的保护作用可能与自噬的增强有关(图2c-e)。
[0023]
(3)荭草素通过修复线粒体跨膜电位保护足细胞
[0024]
采用jc-10染色法检测线粒体膜电位，观察到高糖显著增加去极化线粒体中的细胞数量，而荭草素(120μm)可逆转这种现象，如图3a，b所示，采用绿色荧光法检测线粒体去
极化的细胞，并以总细胞的百分比(bar＝50μm)量化(数据用独立实验的平均值
±
sem表示)，多组间比较采用单因素方差分析 (anova)，与高糖组相比，*p《0.05和**p《0.01。
[0025]
(4)荭草素通过恢复自噬来保护线粒体
[0026]
通过免疫荧光染色分析荭草素对线粒体的保护作用及其与自噬的关系，与对照组相比，高糖组线粒体肿胀率、断裂率和圆度较高，而荭草素组明显减轻了 hg所致的线粒体损伤。3-ma的治疗消除了荭草素对线粒体的保护作用(图4a)，这些结果表明，随着自噬作用的增强，线粒体损伤减轻；在mpc-5细胞中，tom 20分布在与gfp-lc3共定位的线粒体外膜上(图4b)，共聚焦图像还将lc3 定位在线粒体外膜上，荭草素可以恢复hg减少的共聚焦，提示荭草素通过增强 mpc-5细胞的自噬作用保护线粒体。