一种高敏感性和特异性强的日本血吸虫检测引物、探针、试剂盒及其应用

1.本发明涉及基因检测技术领域，具体涉及日本血吸虫核酸特异性基因g01的lfd
‑
rpa的检测方法的建立，及其在检测日本血吸虫游离核酸中的应用。


背景技术：

2.日本血吸虫（又称日本裂体吸虫）属于扁形动物门（platyhelminihes）、吸虫纲(trematoda)、复殖目（digenea）、裂体亚目（schistosomatata）、裂体超科（schistosomatoidea）、裂体科(schistosomatidae)、裂体亚科(schistosomatinae)、裂体属(schistosoma)。日本血吸虫生活史包括虫卵、毛蚴、母胞蚴、子胞蚴、尾蚴、童虫和成虫七个阶段，需要中间宿主钉螺（oncomelania）和终末宿主（40余种哺乳动物）、且需要经过无性繁殖和有性繁殖的交替才能完成生活史循环。日本血吸虫成虫寄生在终末宿主的门静脉和肠系膜静脉，雌雄虫交配后产卵，虫卵随血流到肝脏或沉积在肠壁，经过数天发育为成熟虫卵，虫卵落入肠腔并随着粪便排出体外。虫卵在适宜环境下孵出毛蚴，毛蚴在水中侵入中间宿主钉螺，在钉螺体内发育至尾蚴阶段，然后成熟的尾蚴被不断逸出，与人或哺乳动物的皮肤接触即可感染。日本血吸虫终末宿主众多，包括人、黄牛、水牛、绵羊、山羊、猪、马等40多种哺乳动物，可对人类健康和畜牧业发展造成严重危害。
3.在我国，日本血吸虫病主要流行于长江流域的安徽、江苏、湖北、湖南、江西、四川等省份。其终末宿主黄牛、水牛、绵羊、山羊等家畜是日本血吸虫病传播的主要传染源，因此，做好家畜血吸虫病防治工作是我国早日消除日本血吸虫病的保证。目前，我国日本血吸虫病呈低度流行，这对该病诊断方法的敏感性、特异性、稳定性以及操作简便性有了更高的要求。
4.常用的血吸虫病诊断方法主要有病原学诊断、免疫学诊断和分子生物学诊断等。病原学诊断是血吸虫病诊断的金标准，具有经济、快捷、易操作等优点。但是随着我国消除血吸虫病进程的不断推进，流行区人和动物的血吸虫感染率和感染强度逐渐降低，病原学诊断存在的漏检率高、敏感性低等缺点，已逐渐不适用于低度流行地区。免疫学诊断具有较好的敏感性、方便快捷、稳定等优点，在流行病学调查、群体诊断等方面有着病原学诊断不可比拟的优势，是血吸虫病诊断的重要手段。但同时，免疫学诊断的交叉反应、较高的假阳性结果以及不能区分既往和现症感染等缺点制约了免疫学诊断在日本血吸虫病诊断上的发展。分子生物学诊断日本血吸虫病是通过检测宿主体内的日本血吸虫核酸片段来进行疾病诊断，该方法具有敏感性高、特异性强等特点。
5.日本血吸虫尾蚴侵入宿主后，在移行、发育、成熟、产卵等过程中，表膜等虫体成分进行更新、脱落，虫体细胞、部分虫卵会发生崩解，其核酸物质释放到宿主体内，因此，可通过这些核酸物质的检测来对宿主日本血吸虫病进行诊断。这些核酸物质包括循环无细胞dna，长期以来一直被探索用于各种临床无创诊断。近20年来，母体血浆中循环无细胞dna一直被用于诊断和监测一系列胎儿疾病和妊娠相关并发症。循环无细胞dna主要存在于宿主
血液、唾沫、尿液等体液中，这也是通过检测日本血吸虫核酸物质来诊断日本血吸虫病的分子基础。近些年已经有学者通过检测人血液中血吸虫循环无细胞dna来诊断血吸虫病。
6.sun等(2016)建立了lfd
‑
rpa检测人日本血吸虫病方法，检测下限为5 fg日本血吸虫基因组dna，敏感性为92.86％（13/14），特异性为100％（31/31）。xing等（2017）建立了real
‑
time rpa检测人日本血吸虫病方法，检测下限为0.9 fg日本血吸虫基因组dna，敏感性和特异性均为100％（30/30; 30/30）。而上述两种日本血吸虫病诊断方法检测模板都是来自人粪便样本中的虫卵基因组dna，而在本研究中，检测模板是小鼠和山羊血浆样本中的cell
‑
free dna，在样本的来源和处理上，血浆样本更具有可操作性，便于后续的实验开展。
7.传统的分子生物学诊断方法（如pcr,巢式pcr,real
‑
time pcr等）具有高敏感性和特异性，但是需要昂贵的仪器和专业的操作人员，对于一些偏远或缺乏仪器设备的地区，仍然无法满足检测日本血吸虫病的需求。重组酶聚合酶扩增（rpa）技术是由三种酶（重组酶、聚合酶和单链dna结合蛋白）参与的一种体外恒温扩增技术，在常温下5
‑
20min就可以完成对靶基因的核酸扩增。rpa具有反应时间短且在常温就可以完成、高敏感性和特异性、快速、便捷、高效和适合现场检测等优点，近年来在病原微生物检测、基因突变和食品安全检测等领域快速发展。本发明根据日本血吸虫特异性g01序列设计引物和探针，建立了一种针对日本血吸虫病的rpa快速检测方法，结合侧流层析试纸条（lfd）可直接读取结果，大大减少检测时间，提高检测效率。目前还没有报道可用于诊断动物日本血吸虫病的rpa方法。之前只有zhang等建立的巢式pcr用于诊断家畜（牛和羊）日本血吸虫病，该方法检测水牛的敏感性为92.30%（24/24），特异性为97.60%（41/42），但是它需要进行两轮pcr反应，耗费时间长（3小时）并增加了污染的风险。在本研究中，首次通过lfd
‑
rpa方法诊断家畜（羊）日本血吸虫病，大大缩短了反应时间（15 min），为在资源匮乏地区诊断动物日本血吸虫病提供了一种新方法。该方法操作简单方便、快速且不需要昂贵的仪器和专业的操作人员，适合于基层对羊日本血吸虫病的检测需求，有大规模推广应用的潜力。
8.

技术实现要素：

9.本发明构建了敏感性高和特异性强的日本血吸虫lfd
‑
rpa检测技术，在39℃可准确快速的检测日本血吸虫g01基因。
10.本发明提供了一种用于日本血吸虫检测的lfd
‑
rpa诊断试剂盒，所述的试剂盒包含一组敏感性高和特异性强的日本血吸虫检测引物和探针，其核苷酸序列为：rpa
‑
f: 5'
‑
ccgaacacttcaaggaacagtttagctggc
‑
3'（seq id no.1）rpa
‑
r: 5'
‑
cttcgtcgtttcaggttagatatagctttttg
‑
3'（seq id no.2）rpa
‑
p: 5'
‑
attacccagcttttccactcaagctaaatgaacattgaagtaggc
‑
3'（seq id no.3）（注：在rpa
‑
r的5'端标记biotin,在rpa
‑
p的5'端标记fam, 3'端标记c3
‑
spacer, 在距离5'端30 bp和距离3'端15 bp的位置标记thf）扩增片段大小为145bp，全长序列为：ccgaacacttcaaggaacagtttagctggccttcagctactctacaattacccagcttttccactcaagctaaatggaacattgaagtaggccccccgacactagctgaagttcaaaaagctatatctaacctgaaacgacgaag（seq id no.4）
进一步的，在rpa
‑
r的5'端标记biotin, 在rpa
‑
p的5'端标记fam, 3'端标记c3
‑
spacer, 在距离5'端30 bp和距离3'端15 bp的位置标记thf。
11.本发明的另一目的是提供了用于检测日本血吸虫的rpa反应体系：rpa
‑
f/r (10 μm)：2.1 μltwistampnfo probe (10 μm)：0.6 μlprimer free rehydration buffer：29.5μlbetaine（5m）：5 μldna模板：1 μlddh2o：7.2 μlmgoac (280mm)：2.5μl总反应体系为50 μl。
12.rpa扩增条件为39℃反应15 min。经实验样本验证，可用于日本血吸虫的检测。
13.进一步的，本发明提供一种rpa
‑
lfd可视化快速检测血吸虫核酸的试剂盒，所述试剂盒包括：如seq id no.1～2所示的引物对，和如seq id no.3所示探针。
14.优选的，所述试剂盒还包括rpa扩增反应体系试剂。rpa扩增反应体系试剂是指除了引物对、探针及模板之外的rpa扩增反应体系中的所有试剂组分。所述rpa扩增反应体系试剂包含：rpa反应缓冲液、rpa扩增试剂、醋酸镁、双蒸水。其中，rpa扩增试剂是指依赖重组酶、单链结合蛋白和dna聚合酶的作用，实现目的基因扩增的试剂。
15.优选的，所述试剂盒还包括侧流层析试纸条(lfd)。
16.优选的，所述试剂盒还可以包括阴性对照品。在一种实施方式中，所述阴性对照品为双蒸水。
17.优选的，所述试剂盒还可以包括阳性对照品。在一种实施方式中，所述阳性对照品为血吸虫基因组dna。
18.上述检测方法，扩增产物稀释20倍后通过侧流层析试纸条（lfd）判断结果，同时出现检测线和质控线，即显示为阳性。
19.进一步的，本发明提供了一种体外恒温扩增日本血吸虫g01序列的lfd
‑
rpa方法，简单快速，对资源有限的地区尤为适用。
20.1)提取待测样本中dna；2)rpa扩增：将如seq id no.1～2所示的rpa引物对、如seq id no.3所示rpa
‑
nfo探针、rpa反应缓冲液、dna模板、甜菜碱及醋酸镁混合于含rpa扩增试剂的反应管中配置成rpa反应体系，反应温度设为39℃，反应时间为15 min，进行rpa扩增；设置双蒸水为阴性对照，血吸虫基因组dna为阳性对照；3)lfd检测rpa扩增产物：采用侧流层析试纸条(lfd)检测rpa扩增产物；将扩增产物稀释20倍, 取10μl滴加于侧流层析试纸条样品垫上，然后将侧流层析试纸条样品垫垂直插入稀释液中，室温反应5min，肉眼观察结果。当试纸条检测线及质控线均显色(出现紫色条带)，表明rpa扩增产物为阳性，样本中含有血吸虫dna；若只质控线显色，表明rpa无目标扩增产物，样本中无血吸虫dna；若质控线未显色，表明实验结果无效。
21.作为一个具体的实施例，所述rpa扩增试剂组分包括：噬菌体重组酶、dna聚合酶、单链dna结合蛋白、dntp以及外切酶。
22.作为一个具体的实施例，所述反应缓冲液为primer free rehydration buffer。
23.作为一个具体的实施例，所述侧流层析试纸条为mileniagenline hybridetect
‑
1试纸条。
24.作为一个具体的实施例，所述rap反应体系通常为50μl反应体系：向含rpa组分的冻干粉中加入29.5μlprimer free rehydration buffer，2.1 μl10μm的上游引物、2.1 μl 10 μm的下游引物，5 μl 5m甜菜碱、2.5μl280 mm的醋酸镁、1 μl(~ 20ng)dna模板，用双蒸水补足到50μl。
25.优选的，rpa扩增的较佳条件为：反应温度为39℃，反应时间为15 min。
26.优选的，lfd检测rpa扩增产物的较佳条件为：将扩增产物稀释20倍后，取10μl滴加于侧流层析试纸条样品垫上，然后将试纸条样品垫垂直插入稀释液中，室温反应5min，肉眼观察结果。
27.本发明提供了一种检测日本血吸虫的试剂盒以及检测方法；可用于检测小鼠和羊日本血吸虫病；本发明的检测方法操作简单快速，不需要复杂仪器。
28.有益效果在本发明中，我们成功建立了诊断小鼠和羊日本血吸虫病的lfd
‑
rpa方法，该方法在39℃下15min即可完成对靶基因的扩增。将扩增产物稀释20倍后，取10 μl滴加于侧流层析试纸条样品垫上，然后将试纸条样品垫垂直插入稀释液中，室温下孵育5min，通过试纸条即可观察结果。lfd
‑
rpa方法的检测下限为74.9拷贝靶序列。此外，lfd
‑
rpa方法与八种相近寄生虫基因组dna均无交叉反应。
29.在本发明中，首次通过lfd
‑
rpa方法诊断家畜（羊）日本血吸虫病，大大缩短了反应时间（15 min），为在资源匮乏地区诊断动物日本血吸虫病提供了一种新方法。
附图说明
30.图 1 lfd
‑
rpa孵育温度的优化孵育温度分别设置为25℃、30℃、35℃、37℃、39℃、42℃和45℃。
31.图 2 lfd
‑
rpa孵育时间的优化孵育时间分别设置为5 min、10 min、15 min和20 min。
32.图 3 lfd
‑
rpa反应产物稀释度的优化产物稀释度分别设置为 1:100、1:50、1:20 和 1:10。
33.图4 lfd
‑
rpa检测下限1
‑
8 为梯度稀释的包含日本血吸虫靶序列的阳性质粒，分别为7.49
×
107、7.49
×
106、7.49
×
105、7.49
×
104、7.49
×
103、7.49
×
102、7.49
×
101、7.49拷贝靶序列。
34.图5 lfd
‑
rpa交叉反应交叉反应分别以日本血吸虫、前后盘吸虫、大片吸虫、弓形虫、旋毛虫、裂头蚴、住肉孢子虫、隐孢子虫和捻转血矛线虫虫体基因组作为模板进行lfd
‑
rpa反应。
35.具体实施方式
36.下面结合实施例对本发明提供的具体实施方式作详细说明。
37.实施例：（1）日本血吸虫虫株及基因组核酸样本制备：实验用日本血吸虫虫株由中国农业科学院上海兽医研究所钉螺室提供。将日本血吸虫虫体充分研磨，然后用核酸提取试剂盒提取虫体基因组，测定浓度和纯度，用于方法建立的检测模板。
38.引物设计：根据实验室前期筛选的g01基因设计引物和探针，序列如下rpa
‑
f: 5'
‑
ccgaacacttcaaggaacagtttagctggc
‑
3'rpa
‑
r: 5'
‑
cttcgtcgtttcaggttagatatagctttttg
‑
3'rpa
‑
p: 5'
‑
attacccagcttttccactcaagctaaatgaacattgaagtaggc
‑
3'扩增片段大小为145bp。
39.在rpa
‑
r的5'端标记biotin, 在rpa
‑
p的5'端标记fam, 3'端标记c3
‑
spacer, 在距离5'端30 bp和距离3'端15 bp的位置标记thf（2）靶序列克隆和重组阳性质粒构建：利用pcr扩增靶序列并纯化，连接到pmd19
‑
t载体上，获得重组阳性质粒，用于敏感性试验。
40.（3）反应体系：rpa
‑
f/r (10 μm)：2.1 μltwistampnfo probe (10 μm)：0.6 μlprimer free rehydration buffer：29.5 μlbetaine（5m）：5 μldna模板：1 μlddh2o：7.2 μlmgoac (280mm)：2.5 μlrpa扩增条件为39℃反应15 min。
41.（4）结果判定：rpa扩增产物通过lfd检测，同时出现检测线和质控线，显示扩增出目的片段，即该样本为阳性。
42.（5）特异性试验：日本血吸虫、前后盘吸虫、大片吸虫、弓形虫、旋毛虫、裂头蚴、住肉孢子虫、隐孢子虫和捻转血矛线虫虫体基因组均由上海兽医研究所农业部动物寄生虫重点实验室提供。分别以它们为模板，进行lfd
‑
rpa反应观察其交叉反应。
43.结论：对以上九种虫体基因组dna进行lfd
‑
rpa的特异性分析，结果显示除日本血吸虫外，其它虫体均无特异性扩增，该方法对日本血吸虫g01基因具有很强的特异性（图4）。
44.（6）敏感性试验：将构建的重组质粒倍比稀释，进行lfd
‑
rpa检测，观察其检测下限。
45.结论：检测结果表明，lfd
‑
rpa检测下限为74.9拷贝靶序列（图5）。
46.（7）添加甜菜碱对比实验：对不添加和添加甜菜碱溶液（5m）到lfd
‑
rpa反应体系中的结果进行观察，统计假阳性率。
47.结论：不添加甜菜碱溶液反应假阳性率为20%（2/10），添加甜菜碱溶液假阳性率为0%（0/10），因此，添加甜菜碱溶液可以提高lfd
‑
rpa反应特异性。
48.（8）lfd
‑
rpa在小鼠上检测敏感性和特异性比较：采用优化的实验条件，对人工感
染的36份实验动物（balb/c小鼠）阳性dna样本和36份阴性dna样本进行lfd
‑
rpa检测，统计检测敏感性和特异性。
49.结论：在小鼠中检测敏感性为97.22% (35/36, 95% ci, 85.47
–
99.93%)，特异性为100% (36/36, 95% ci, 90.26
–
100%)。
50.（9）lfd
‑
rpa在家畜（羊）上检测敏感性和特异性比较：采用优化的实验条件，对48份人工感染的家畜（羊）阳性dna样本和53份阴性dna样本，进行lfd
‑
rpa检测，统计检测敏感性和特异性。
51.结论：在羊中检测敏感性为 93.75% (45/48, 95% ci, 82.80
–
98.69%)，特异性为100% (53/53, 95% ci, 93.28
–
100%)。
52.本发明建立的lfd
‑
rpa方法具有较高的敏感性和特异性，操作简单方便、快速且不需要昂贵的仪器和专业的操作人员，适合于基层对羊日本血吸虫病的检测需求，有大规模推广应用的潜力。