BmSPI39突变体及其应用

bmspi39突变体及其应用
技术领域
1.本发明属于基因工程和酶工程技术领域，具体涉及bmspi39突变体及其应用。


背景技术：

2.家蚕是一种具有巨大的经济价值的绢丝昆虫，有大量的基础研究积累，已成为昆虫生物化学、遗传学和基因组学的最佳模型之一。我们前期的研究对免疫相关的家蚕蛋白酶抑制剂进行了系统鉴定，发现很多til(trypsin inhibitor
‑
like cysteine
‑
rich domain)类蛋白酶抑制剂在微生物添食感染后上调表达，暗示til类蛋白酶抑制剂可能参与家蚕的免疫过程。进一步研究表明，一个家蚕的til类蛋白酶抑制剂bmspi39不仅能够强烈抑制枯草杆菌蛋白酶、蛋白酶k、球孢白僵菌体壁降解蛋白酶cdep
‑
1和蜂蜜曲霉蛋白酶的活性，而且能够阻断球孢白僵菌体壁降解蛋白酶cdep
‑
1诱导的家蚕的过度、有害黑化。
3.bmspi39的活性和功能已较为清楚，但是其活性作用机制尚不完全清楚，针对可能影响til类蛋白酶抑制剂抑制特异性的潜在氨基酸位点的研究也比较有限，这直接影响了该抑制剂的遗传改造和产业应用。


技术实现要素：

4.本发明的目的之一是提供bmspi39突变体，bmspi39是由seq id no.1中第25位至第98位组成，所述bmspi39突变体是将bmspi39氨基酸序列，如seq id no.1所示第56位的丙氨酸突变为精氨酸(r)、赖氨酸(k)、丝氨酸(s)、苏氨酸(t)、谷氨酰胺(q)、酪氨酸(y)、甲硫氨酸(m)、亮氨酸(l)、天冬氨酸(d)、谷氨酸(e)、组氨酸(h)、半胱氨酸(c)、缬氨酸(v)、天冬酰胺(n)、异亮氨酸(i)、苯丙氨酸(f)、色氨酸(w)、脯氨酸(p)或甘氨酸(g)获得的。
5.本发明的目的之二是提供所述bmspi39突变体的构建方法，该方法是利用定点突变引物对如seq id no.2所示野生型bmspi39的基因序列进行定点突变，得到所述bmspi39突变体。
6.进一步的，所述bmspi39突变体的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
7.s1、设计定点突变引物，使上下游引物都带有突变位点；
8.s2、以bmspi39
‑
p28载体作为模板，使用dna聚合酶，用特异性突变引物进行pcr反应扩增，反应产物用琼脂糖凝胶电泳进行检测；
9.s3、利用dpni进行酶切反应处理pcr产物；
10.s4、将酶切反应处理的pcr产物转化入trans1
‑
t1感受态细胞，挑选阳性克隆进行测序验证，提取突变质粒；
11.s5、将突变质粒转入宿主表达菌株中，诱导表达得到bmspi39突变体。
12.本发明的目的之三是提供编码所述bmspi39突变体的基因。
13.本发明的目的之四是提供携带所述基因的质粒。
14.本发明的目的之五是提供携带所述质粒的宿主表达菌株。
15.本发明的目的之六是提供所述bmspi39突变体作为枯草杆菌蛋白酶和弹性蛋白酶
抑制剂的应用。
16.本发明的目的之七是提供所述bmspi39突变体作为枯草杆菌蛋白酶、弹性蛋白酶和胰蛋白酶抑制剂的应用，所述bmspi39突变体是将bmspi39氨基酸序列，如seq id no.1所示第56位的丙氨酸突变为赖氨酸或精氨酸的bmspi39突变体。
17.与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
18.本发明根据bmspi39结构分析，对bmspi39氨基酸序列，如seq id no.1所示第56位的丙氨酸进行定点突变，由此获得的突变体bmspi39(a56r)、bmspi39(a56k)、bmspi39(a56s)、bmspi39(a56t)、bmspi39(a56q)、bmspi39(a56y)、bmspi39(a56m)、bmspi39(a56l)对枯草杆菌蛋白酶的抑制活性增强。bmspi39(a56d)、bmspi39(a56e)、bmspi39(a56h)、bmspi39(a56c)、bmspi39(a56v)、bmspi39(a56n)、bmspi39(a56i)、bmspi39(a56f)、bmspi39(a56w)对枯草杆菌蛋白酶的抑制活性减弱。除bmspi39(a56e)、bmspi39(a56s)、bmspi39(a56t)、bmspi39(a56q)对弹性蛋白酶抑制活性增强之外，其余突变体对弹性蛋白酶抑制活性均减弱。而且bmspi39(a56r)、bmspi39(a56k)还获得了胰蛋白酶抑制活性。
19.本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
20.图1为部分bmspi39突变体的pcr产物(a)及突变质粒的凝脂糖凝胶电泳检测图(b)。
21.图2为bmspi39突变体蛋白的sds
‑
page分析，图中，“m”表示蛋白分子量标准。“s”表示可溶性蛋白。“u”表示不可溶蛋白。“control”为转入p28空载体的bl21(de3)菌株的细胞裂解液。箭头指示bmspi39突变体表达蛋白。
22.图3为bmspi39突变体的弹性蛋白酶的活性染色，图中，“control”为转入p28空载体的bl21(de3)菌株的细胞裂解液。“ei”表示弹性蛋白酶抑制活性，“cb”表示考马斯亮蓝染色。弹性蛋白酶抑制活性的箭头指示蛋白酶活性抑制条带。考马斯亮蓝染色的箭头指示蛋白酶抑制剂对应的考马斯亮蓝染色带。
23.图4为bmspi39突变体对不同蛋白酶的活性比较，以5龄第5天家蚕幼虫血淋巴作为阳性对照。“control”为转入p28空载体的bl21(de3)菌株的细胞裂解液。“si”表示枯草杆菌蛋白酶抑制活性。“ci”表示胰凝乳蛋白酶抑制活性。“ti”表示胰蛋白酶抑制活性。“ei”表示弹性蛋白酶抑制活性。“cb”表示考马斯亮蓝染色。胰蛋白酶抑制活性的箭头指示蛋白酶活性抑制带，考马斯亮蓝染色的箭头指示蛋白酶抑制剂对应的考马斯亮蓝染色带。
具体实施方式
24.下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明，但不应理解为本发明的限制。如未特殊说明，下述实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
25.本发明的家蚕丝氨酸蛋白酶抑制剂bmspi39
‑
p28重组表达载体由陕西理工大学维生素d生理与运用研究所保存。
26.实施例1
27.bmspi39突变体构建及活性研究
28.1、突变引物设计
29.bmspi39的氨基酸序列是由seq id no.1中第25位至第98位组成，其中第1位至第24位为信号肽序列，参照bmspi39的基因序列，如seq id no.2所示，对bmspi39设计定点突变引物用于该基因的5
′
到3
′
的pcr扩增。bmspi39的突变体模板、期望突变，dna聚合酶和引物序列分别见表1。
30.31.2、pcr扩增
32.(1)pcr扩增所用的dna聚合酶为fastpfu dna polymerase时，反应体系(25μl)见表2，扩增程序见表3。1％琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。
33.表2 pcr反应体系
[0034][0035]
表3 pcr扩增程序
[0036][0037]
(2)pcr扩增所用的dna聚合酶为easypfu dna polymerase时，反应体系(25μl)见表4，扩增程序见表5。用1％琼脂糖凝胶电泳检测pcr产物。
[0038]
表4 pcr反应体系
[0039][0040]
表5 pcr扩增程序
[0041][0042]
3、利用dpn i酶切pcr扩增产物，去掉模板质粒。
[0043]
酶切条件：37℃，30min。dpn i酶切体系见表6。
[0044]
表6 dpn i酶切体系
[0045][0046]
4、将dpn i处理后的pcr产物转入trans1
‑
t1感受态细胞中，其步骤如下：
[0047]
(1)从
‑
80℃超低温冰箱中取出感受态细胞(100μl)，置入冰中至半融状态分出50μl感受态细胞放入另一灭过菌预冷的无菌离心管中，每一管加入10μl dpn i处理后的pcr产物，轻轻吹吸混匀，冰上静置30min。
[0048]
(2)42℃热激90s，轻轻取出置于冰中冷却5min。
[0049]
(3)加入900μl无抗性的液体培养基，37℃，220rpm孵育1h。
[0050]
(4)3500rpm，离心5min，弃去800μl上清，剩余菌液吹吸混匀后，全部加入固体培养基平板中，均匀涂布5min，37℃倒置培养12h左右。
[0051]
5、基因测序验证及甘油菌制备
[0052]
(1)选取平板中生长饱满，边缘圆润的单菌落挑入1.5ml离心管中，振荡培养3～4h，条件：37℃，220rpm，取200μl菌样送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序。
[0053]
(2)甘油菌制备：取50％甘油200μl，加入300μl菌液，均匀混合、液氮速冻后，置于
‑
80℃长期保存。
[0054]
6、质粒提取
[0055]
提取步骤参考trans质粒提取试剂盒，得到bmspi39突变体质粒。
[0056]
7、转化至宿主表达菌株
[0057]
将bmspi39突变体质粒转入bl21(de3)感受态细胞中，转化步骤参照步骤4。
[0058]
8、诱导表达
[0059]
(1)挑单菌落至1.5ml的ep管中，37℃220rpm条件下振荡培养12h。
[0060]
(2)取150μl菌液加入15ml液体培养基中，37℃220rpm条件下振荡培养至od
600
＝0.6～1.0。
[0061]
(3)加入iptg至终浓度0.2mm进行诱导表达，最佳诱导条件为37℃，220rpm，5h。
[0062]
(4)4℃6000rpm离心20min，收集菌体，以1
×
结合缓冲液(1.5ml)吹吸重悬菌体，将所有菌液转移至2.0ml的ep管。
[0063]
(5)4℃6000rpm离心10min，弃去上清液，1
×
结合缓冲液(1.0ml)吹吸重悬菌体。
[0064]
(6)4℃6000pm离心10min，弃去上清液，1
×
结合缓冲液(450μl)吹吸重悬。
[0065]
(7)超声破碎15min，直至菌液变得透亮。4℃16000g离心30min，分离上清与沉淀，沉淀用1
×
结合缓冲液(250μl)吹吸重悬。
[0066]
9、sds
‑
page
[0067]
用5％浓缩胶压缩蛋白样品(表7)，16.5％的sds
‑
page分离蛋白(表8)，考马斯亮蓝染色，其步骤如下：
[0068]
(1)上清与沉淀各取10μl，3
×
sds上样缓冲液5μl，均匀混合后，煮沸10min。
[0069]
(2)样品全部点入胶孔内，恒流电泳至溴酚蓝完全进入电泳缓冲液中，胶内无残留。电泳条件：浓缩胶10ma，分离胶15ma。
[0070]
(3)考马斯亮蓝染色：切除浓缩胶，用考马斯亮蓝染色液浸泡分离胶，轻微振荡染色15min。
[0071]
(4)脱色：回收染色液后，用考马斯亮蓝脱色液脱色至背景透明，条带清晰。
[0072]
表7 5％sds
‑
page浓缩胶
[0073][0074]
表8 16.5％sds
‑
page分离胶
[0075][0076]
10、bmspi39突变体活性染色
[0077]
10％分离胶配方见表9，4％浓缩胶配方见表10。4
×
native
‑
page胶内活性染色具体步骤如下
[0078]
(1)蛋白样品与4
×
native
‑
page上样缓冲液按1：3比例均匀混合，全部点入胶孔内，恒流电泳至溴酚蓝距离胶边缘2～3mm时停止电泳。电泳条件：4℃，浓缩胶10ma，分离胶15ma。
[0079]
(2)切除浓缩胶，将分离胶置于蛋白酶液中37℃，45rpm条件下避光孵育30min。
[0080]
(4)回收蛋白酶液，用ddh2o轻轻清洗胶面两次，37℃避光静置30min。
[0081]
(5)加入染色液与基质液的混合液，每块胶40ml，37℃，45rpm条件下避光染色15min。
[0082]
(6)倒掉染色液，加入ddh2o终止反应。
[0083]
表9 10％4
×
native
‑
page分离胶
[0084][0085]
表10 4％4
×
native
‑
page浓缩胶
[0086][0087]
其中，a液：tris 36.3g，1m hc1 48ml，temed 0.230ml，加100ml ddh2o定容，4℃避光保存。
[0088]
b液：tris 5.98g，1m hc1 48ml，temed 0.46ml，加100ml ddh2o定容，4℃避光保存。
[0089]
c液：丙烯酰胺30g，甲叉双丙烯酰胺0.8g，加100ml ddh2o定容，0.45μm滤膜抽滤，4℃避光保存。
[0090]
d液：丙烯酰胺10g，甲叉双丙烯酰胺2.5g，加100ml ddh2o定容，0.45μm滤膜抽滤，4℃避光保存。
[0091]
e液：核黄素8mg，加200ml ddh2o定容，4℃避光保存。
[0092]
g液：过硫酸铵0.7g，加100ml ddh2o定容，4℃避光保存。
[0093]
活性染色原理如下：蛋白酶分解基质(n
‑
乙酰基
‑
dl
‑
苯丙氨酸
‑
β
‑
萘酯，，n
‑
acetyl
‑
d,l
‑
phenylalanine
‑
β
‑
naphthylester)，生成的β
‑
奈酚通过重氮偶合反应将凝胶染成紫红色。胶内蛋白酶抑制剂抑制蛋白酶活性，因此所在位置不会被染色，抑制剂所在位置呈现白色条带。
[0094]
11、结果与分析
[0095]
(1)本发明设计了19对定点突变引物，以bmspi39野生型基因序列为模板进行pcr扩增。将pcr产物转化进trans1
‑
t1感受态细胞中，测序后进行质粒抽取。结果显示，bmspi39的p1位点突变体的pcr扩增产物呈现为单一条带，且条带较亮，分子量大小介于3000～5000bp之间(图1a)，质粒提取良好与预期一致(图1b)。
[0096]
(2)为了能表达出高量的蛋白，我们以bl21(de3)作为bmspi39的最适宿主菌株进行诱导表达，选择16.5％sds
‑
page对bmspi39突变体蛋白进行分离检测。其结果如图2所示：
bmspi39突变体蛋白在上清中以可溶形式表达，且表达量较高，而在沉淀中几乎不表达，其表观分子量大小介于6.5～9.5kda之间，结果表明，bmspi39突变体蛋白表达正常。
[0097]
(3)本发明以n
‑
乙酰基
‑
d,l
‑
苯丙氨酸
‑
β
‑
萘酯(n
‑
acetyl
‑
d,l
‑
phenylalanine
‑
β
‑
naphthylester)为底物，bmspi39蛋白上清取6μl。活性染色结果显示，bmspi39能够强烈抑制弹性蛋白酶活性。这是首次明确家蚕蛋白酶抑制剂对弹性蛋白酶的抑制活性(图3)。
[0098]
(4)经sds
‑
page检测得知，bmspi39的p1位点突变体蛋白在上清中高量表达，可用于后续实验研究。基于前期我们对影响小分子til类蛋白酶抑制剂抑制特异性的潜在氨基酸位点分析，p1残基可能是影响蛋白酶抑制剂bmspi39抑制活性和抑制特异性的关键位点之一。
[0099]
结果表明：与bmspi39(wt)相比，突变体bmspi39(a56r)、bmspi39(a56k)、bmspi39(a56s)、bmspi39(a56t)、bmspi39(a56q)、bmspi39(a56y)、bmspi39(a56m)、bmspi39(a56l)对枯草杆菌蛋白酶的抑制活性增强。bmspi39(a56d)、bmspi39(a56e)、bmspi39(a56h)、bmspi39(a56c)、bmspi39(a56v)、bmspi39(a56n)、bmspi39(a56i)、bmspi39(a56f)、bmspi39(a56w)对枯草杆菌蛋白酶的抑制活性减弱。除bmspi39(a56e)、bmspi39(a56s)、bmspi39(a56t)、bmspi39(a56q)对弹性蛋白酶抑制活性增强之外，其余突变体对弹性蛋白酶抑制活性均减弱(图4)。值得注意的是，bmspi39(a56r)、bmspi39(a56k)不仅具有枯草杆菌蛋白酶和弹性蛋白酶抑制活性，还具备胰蛋白酶抑制活性(图4)。
[0100]
尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
[0101]
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。