一种小RNA及其在心血管疾病治疗中的用途

一种小rna及其在心血管疾病治疗中的用途
技术领域
1.本发明涉及核酸治疗领域。更具体地，本发明涉及一种新的小rna以及其在治疗心血管疾病，尤其是，高血压、心肌炎、心肌肥大、心力衰竭、心肌梗死、心肌病中的用途。


背景技术：

2.在过去几十年中，用核酸分子包括rna分子作为治疗药物的理念从概念走向了临床现实。事实上，核酸分子拥有许多的属性使得它可以作为治疗药物。它们能够折叠形成复杂的构象让它们可以与蛋白质、小分子或者其他核酸相互结合，有些甚至可以形成催化中心。小干扰rna(sirna)作为rnai的效应分子，其作为治疗药物具有越来越广阔的前景。目前已经有多种sirna药物进入临床实验，预示着其良好的发展前景。通常，人们一般把sirna，mirna及其它非编码小rna不加区分地称之为小核酸或小rna(srna)。小rna是一大类小的非编码rna，其由动、植物基因组内所编码，长度大约为18
‑
24个核苷酸。研究表明，小rna参与各种各样的调节途径，包括发育、病毒防御、造血过程、器官形成、细胞增殖和凋亡、脂肪代谢等等。
3.本发明人的研究小组在之前的研究中发现了从中药中提取多种能够促进核酸递送的化合物或合成的化合物，并利用所提取的化合物或多种组合促进核酸如srna吸收和进入靶细胞中，并能促进核酸进入有此需要的对象体内的靶部位(参见，wo2019184991a1，cn111918672a，其内容通过引用并入本文)。
4.心血管疾病是全球性的最为严峻的健康问题，而高血压是心血管疾病的最主要危险因素，容易造成动脉粥样硬化、冠心病、心肌梗死、心脏衰竭等问题。高血压，即血压长期持续升高，是心血管疾病死亡和发病的重要危险因素之一。据估计，全世界有10亿人受到高血压的影响，在每年因心血管疾病造成的1700万人死亡中，高血压占了一半以上。大约5％的高血压患者有潜在的病因，但绝大多数被诊断为“原发性高血压”，病因不明。
5.血压是由心血管系统的的几个参数所决定的，包括血容量和心输出量以及动脉张力的平衡，受到血管内容积和神经体液系统的调节。维持生理血压水平涉及一个完整的神经体液系统的各种因素的复杂相互作用，包括肾素
‑
血管紧张素
‑
醛固酮系统、利钠肽系统、内皮素系统、交感神经系统以及免疫系统。这一综合神经体液系统的任何组成部分中与血压控制有关的因素发生故障或中断，都可能直接或间接地导致平均血压或血压变异性增加，或两者兼有，随着时间的推移，导致心血管疾病等靶器官损伤的结果。
6.目前国际高血压指南推荐的一线降压药物有利尿剂、钙通道阻滞剂、血管紧张素转换酶抑制剂、β
‑
阻滞剂和血管紧张素受体拮抗剂。虽然现代医学的发展在控制血压上取得了明显的疗效，但接受降压治疗的患者血压控制达标率并不令人满意，许多药物具有明显的副作用，例如：头晕、面红、四肢发凉、胸闷、耳鸣等，严重影响了患者服药依从性。


技术实现要素：

7.本技术部分基于以下发现：本发明人从中草药中分离出一种新的小rna，并且意想
不到地发现，所述小rna靶向人和小鼠血管紧张素转换酶(ace)基因的3’utr，并可有效地改善或降低血管紧张素ii诱导的高血压、心肌炎、心肌肥大、心力衰竭、心肌梗死、心肌病、心肌纤维化。
8.基于以上发现，在第一方面，本发明提供了一种分离的核酸分子，其包含以下序列或由以下序列组成：
9.a)seq id no：1(gggauaaggauuggcucu)所示的核苷酸序列；
10.b)与seq id no：1(gggauaaggauuggcucu)所示的核苷酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、96％、97％、98％、99％序列同一性的序列；
11.c)与seq id no：1相比具有至少10个、优选地至少9个、至少8个、至少7个、至少6个、至少5个、至少4个、至少3个、至少2个、至少1个核苷酸取代、缺失或添加的序列；
12.d)在严格条件下能够与seq id no：1所示的核苷酸序列杂交的序列；或
13.e)能够与seq id no：16所示的核苷酸序列互补结合的核苷酸序列。
14.在一个优选的实施方案中，根据本发明所述的分离的核酸分子通过靶向血管紧张素转换酶的3’utr的序列uccugcccugucccugucccc(seq id no:16)，降低心肌肥厚标志物anp和bnp的表达，降低心肌纤维化相关基因col1a1和col3a1的表达，并降低心肌炎症相关基因il
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6和mcp
‑
1的表达。
15.在进一步优选的实施方案中，根据本发明所述的分离的核酸分子是rna分子或dna分子，优选地，其是小rna分子；优选地，其是长度为18
‑
24核苷酸的小rna分子，优选地，其是长度为19、20、21、22、23、或24个核苷酸的小rna分子。
16.另一方面，本发明提供了一种载体，其包含本发明所述的核酸分子。
17.另一方面，本发明提供了一种宿主细胞，其转染有本发明所述的载体。
18.另一方面，本发明提供了一种药物组合物，其包含本发明所述的核酸分子和鞘氨醇类脂质及其衍生；优选地，所述鞘氨醇类脂质为鞘氨醇(d18:1)；优选地，所述核酸分子的含量为0.1
‑
1000μm、优选为3.0μm
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100μm；优选为0.3μm、0.6μm、0.9μm、1.0μm、3.0μm、6.0μm、9.0μm、10.0μm、13.0μm、16.0μm、19.0μm、20.0μm、23.0μm、26.0μm、29.0μm、30.0μm、33.0μm、36.0μm、39.0μm、40.0μm、43.0μm、46.0μm、49.0μm、50.0μm、53.0μm、56.0μm、59.0μm、60.0μm、63.0μm、66.0μm、69.0μm、70.0μm、73.0μm、76.0μm、79.0μm、80.0μm、83.0μm、86.0μm、89.0μm、90.0μm、100μm、130μm、160μm、190μm、200μm、250μm、300μm、350μm、400μm、450μm、500μm、550μm、600μm、650μm、700μm、750μm、800μm、850μm、900μm、950μm、1000μm、或这些点值之间的任意范围；所述鞘氨醇(d18:1)的含量为0.01
‑
1000mg/ml，优选为0.03mg/ml、0.06mg/ml、0.09mg/ml、0.1mg/ml、0.13mg/ml、0.16mg/ml、0.19mg/ml、0.2mg/ml、0.23mg/ml、0.26mg/ml、0.29mg/ml、0.3mg/ml、0.33mg/ml、0.36mg/ml、0.39mg/ml、0.4mg/ml、0.43mg/ml、0.46mg/ml、0.49mg/ml、0.5mg/ml、0.53mg/ml、0.56mg/ml、0.59mg/ml、0.6mg/ml、0.63mg/ml、0.66mg/ml、0.69mg/ml、0.7mg/ml、0.73mg/ml、0.76mg/ml、0.79mg/ml、0.8mg/ml、0.83mg/ml、0.86mg/ml、0.89mg/ml、0.9mg/ml、0.93mg/ml、0.96mg/ml、0.99mg/ml、1.0mg/ml、3.0mg/ml、6.0mg/ml、9.0mg/ml、10.0mg/ml、13.0mg/ml、16.0mg/ml、19.0mg/ml、20.0mg/ml、23.0mg/ml、26.0mg/ml、29.0mg/ml、30.0mg/ml、33.0mg/ml、36.0mg/ml、39.0mg/ml、40.0mg/ml、43.0mg/ml、46.0mg/ml、49.0mg/ml、50.0mg/ml、53.0mg/ml、56.0mg/ml、59.0mg/ml、60.0mg/ml、63.0mg/ml、66.0mg/ml、69.0mg/ml、70.0mg/ml、73.0mg/ml、76.0mg/ml、
79.0mg/ml、80.0mg/ml、83.0mg/ml、86.0mg/ml、89.0mg/ml、90.0mg/ml、100mg/ml、130mg/ml、160mg/ml、190mg/ml、200mg/ml、250mg/ml、300mg/ml、350mg/ml、400mg/ml、450mg/ml、500mg/ml、550mg/ml、600mg/ml、650mg/ml、700mg/ml、750mg/ml、800mg/ml、850mg/ml、900mg/ml、950mg/ml、1000mg/ml、或这些点值之间的任意范围。
19.优选地，根据本发明的药物组合物可用于口服、肌肉内、静脉内、皮下、经皮、动脉内、腹膜内、肺内、脑脊髓内、关节内、滑膜内、鞘内、心室内、和/或吸入途径施用，优选地，根据本发明的组合物通过口服施用。
20.另一方面，本发明提供了根据本发明所述的分离的核酸分子、载体、细胞或药物组合物在制备用于治疗心血管疾病的药物中的用途。优选地，所述心血管疾病选自高血压、心肌炎、心肌肥大、心力衰竭、心肌梗死、心肌病、心肌纤维化。
21.优选地，根据本发明的分离的核酸分子、载体、细胞或药物组合物可以与一种或多种，优选一种至三种其他药物组合用于治疗心血管疾病，所述其他药物选自ace抑制剂、β
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受体阻断剂、利尿剂、盐皮质激素受体拮抗剂、肾素抑制剂、钙通道阻断剂、血管紧张素ii受体拮抗剂、硝酸盐、洋地黄化合物、变力剂和β
‑
受体激动剂、抗高血脂剂、血浆hdl升高剂。其中所述ace抑制剂包括但不限于myco(captopril)、依那普利(enalapril)、赖诺普利(lisinopril)、雷米普利(ramipril)、贝那普利(benazepril)、喹那普利(quinapril)、培哚普利(perindopril)、莫昔普利(moexipril)、群多普利(trandolapril)、福辛普利(fosinopril)。
22.另一方面，本发明提供了用于治疗有需要的受试者中心血管疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的根据本发明所述的分离的核酸分子、载体、细胞或药物组合物。
23.术语
24.如本文所用的术语“核酸”包括“多核苷酸”、“寡核苷酸”和“核酸分子”，并且通常意指dna或rna聚合物，其可以是单链的或双链的、合成的或从天然来源获得的(例如分离的和/或纯化的)；其可以包含天然的、非天然的或被改变的核苷酸。在一些实施方案中，核酸不包含任何插入、缺失、倒位和/或替换。然而，如本文所讨论的，在一些情况下对核酸而言，包含一个或更多个插入、缺失、倒位和/或替换可以是合适的。
25.如本文所用的术语在“严格条件下杂交”意指核苷酸序列以可检测地强于非特异性杂交的量与靶序列(例如，seq id no：1所示的序列)特异性杂交。严格性条件可以包括例如低盐和/或高温条件，例如由在约50℃至70℃的温度下约0.02m至0.1m nacl或等同物提供的。
26.如本文所用，“序列同一性”是指两个多核苷酸序列之间的序列相似性。当两个比较序列中的位置均被相同碱基占据时，例如如果两个dna分子的每一个位置都被腺嘌呤占据时，那么所述分子在该位置是同一的。两个序列之间的同一性百分率是两个序列共有的匹配或同源位置数除以比较的位置数
×
100的函数。
27.如本文所用的术语“载体”，是指并入本文所述的核酸的重组表达载体。所述重组表达载体可以是任何合适的重组表达载体，并且可以用于转化或转染任何合适的宿主细胞，包括但不限于植物表达载体、动物表达载体、病毒载体，例如逆转录病毒载体或慢病毒载体。这些载体是本领域技术人员熟知的，并且可以商购获得。
28.本文所用的术语“宿主细胞”是指可以转染有本发明的重组表达载体的任何类型的细胞。宿主细胞可以是真核细胞，例如植物、动物、真菌或藻类，或者可以是原核细胞，例如细菌或原生动物。
29.多种转染技术是本领域公知的，包括但不限于磷酸钙共沉淀、直接微注射到培养的细胞内、电穿孔、脂质体介导的基因转移、脂质介导的转导和使用高速微型射弹的核酸递送。
30.如本文使用，术语“血管紧张素转换酶(ace)”，又称激肽酶ⅱ或肽基
‑
羧基肽酶。属血管内皮细胞膜结合酶，由肽的c端将氨基酸切为两段变换而来，可使肽链c端二肽残基水解。ace主要功能有两个：1)催化血管紧张素ⅰ转化为血管紧张素ⅱ；2)使缓激肽失活。血管紧张素转化酶因这两种功能而成为治疗高血压、心力衰竭、2型糖尿病和糖尿病肾病等疾病的理想靶点。
31.如本文所用，“治疗”包括治疗在哺乳动物中(特别是在人类中)的疾病状态，并且包括：(a)抑制疾病状态，即阻止其发展；和/或(b)缓解疾病状态，即引起疾病状态消退。
32.如本文所用，术语“受试者”是指可能潜在地从用本发明的核酸分子、包含其的载体、细胞或组合物的治疗中受益的任何人类或非人类生物体。示例性受试者包括具有心血管疾病，尤其是，高血压、心肌炎、心肌肥大、心力衰竭、心肌梗死、心肌病的受试者。
33.如本文所用，术语“治疗有效量”旨在包括当单独或组合施用本发明的核酸分子、包含其的载体、细胞或组合物时，使受试者获益的所述核酸分子、包含其的载体、细胞或组合物的量。
34.如本文所用，短语“互补结合”或“互补地结合”是指两条单链彼此碱基配对以形成可检测的双链。但是，只要可以形成稳定的双链，就允许两条单链之间存在一定百分比的不匹配。例如，在一些实施方案中，双链具有约1％，约2％，约3％，约4％，约5％，约6％，约7％，约8％，约9％，约10％，约15％，约20％，约25％，约30％，约35％，约40％，约45％，或约50％的不匹配。
35.为了更详细的说明本发明，本说明书提供了下列具体实施方案，并结合附图说明这些具体实施方案，但本公开的方案并非仅限于此。本领域技术人员可以结合本领域的公知常识，对本发明的方法、用途和小rna进行适当的改变，只要其能够实现本发明所述的功能，即应落入本发明的范围内。
附图说明
36.图1：小鼠皮下埋泵，缓释血管紧张素ii灌注持续14天建立高血压小鼠模型。尾套法测定灌胃xkc
‑
srna
‑
3治疗组小鼠收缩压相对于nc
‑
srna组的血压的结果。
37.图2a
‑
图2d：血管紧张素ii灌注14天后，采用小动物超声成像系统评价灌胃xkc
‑
srna
‑
3治疗组小鼠心脏结构相对于nc
‑
srna组的结果。
38.图3a
‑
图3f：血管紧张素ii灌注14天后，检测小鼠心脏心肌肥厚、纤维化和炎症基因表达结果。
39.图4a
‑
图4b：麦胚凝集素(wga)染色观察小鼠心肌细胞面积。
40.图5a
‑
图5b：天狼星红(psr)染色观察小鼠心脏胶原纤维沉积。
41.图6a
‑
图6b：双荧光素酶报告基因检测系统检测xkc
‑
srna
‑
3的靶点。
具体实施方式
42.实施例1.本草体鞘氨醇(d18:1)
‑
xkc
‑
srna
‑
3的制备
43.向30nmol小rna xkc
‑
srna
‑
3干粉中加入300μl无核酸酶水溶解后，加入10μl 10mg/ml鞘氨醇(sphingosine)(d18:1)的脂质溶液，充分震荡混匀之后，90℃水浴15min，冷却至室温，制备出包含小rna xkc
‑
srna
‑
3和鞘氨醇(d18:1)的混合液。
44.其中所述xkc
‑
srna
‑
3来自中药夏枯，其序列如seq id no：1(gggauaaggauuggcucu)所示。
45.以类似的方式制备阴性对照混合液，其中将小rna xkc
‑
srna
‑
3替换成小rna的无义对照序列(nc)，其余步骤同上。
46.实施例2.xkc
‑
srna
‑
3对血管紧张素ii诱导的高血压的保护作用
47.取80只8周龄、质量25g左右的雄性c57bl/6j小鼠(由北京维通利华生物公司提供)，随机分为以下10组：
48.假手术组：以800ng/kg*min的速度灌注生理盐水14天；
49.血管紧张素ii组：以800ng/kg*min的速度灌注血管紧张素ii 14天；
50.血管紧张素ii+nc
‑
srna组：在血管紧张素ii灌注第2天至第21天以10nmol/只的剂量给小鼠灌胃，阴性对照为包含鞘氨醇(d18:1)和nc(小rna的无义对照序列)的混合液；
51.血管紧张素ii+xkc
‑
srna
‑
3组：在血管紧张素ii灌注第2天至第14天以3nmol/只、10nmol/只、30nmol/只的剂量向小鼠灌胃如上所述制备的包含小rna xkc
‑
srna
‑
3和鞘氨醇(d18:1)的混合液。
52.血管紧张素ii+卡托普利组：在血管紧张素ii灌注第2天至第14天以30nmol/只和2300nmol/只的剂量向小鼠灌胃。
53.在血管紧张素ii灌注前2天至灌注结束第14天，每隔一天测量一次小鼠血压，采用kent无创血压计测定。取小鼠在加热板上37℃放置5分钟，待小鼠尾动脉充分扩张，鼠尾套入套袖，动物安静后充气，在鼠尾根部加载检测探头进行收缩压的测定。每只小鼠测量10次，取其平均值记录。
54.结果如图1所示，与nc
‑
srna相比，灌胃xkc
‑
srna
‑
3显著降低了小鼠的血压水平，且剂量为30nmol/只时效果最好，**表示统计学分析以非配对t检验p<0.01，***表示统计学分析以非配对t检验p<0.001，认为有统计学意义。表明xkc
‑
srna
‑
3在动物水平上具有降压效果，且呈现剂量效应。
55.实施例3.xkc
‑
srna
‑
3对血管紧张素ii诱导的心脏损伤的保护作用
56.1.小鼠心脏超声检测
57.1)启动小动物多普勒超声检测仪器。小鼠胸部脱毛干净后，用3％异氟烷与空气混合气麻醉小鼠，使用1.5％异氟烷空气混合气维持小鼠状态(使小鼠心率维持在450bpm左右)；
58.2)超声探头置于二尖瓣索水平，采用m型胸旁长轴扫描对左心室进行探查(探头频率为30mhz)，测量舒张末期左室前壁厚度(lvaw，d)、收缩末期左室前壁厚度(lvaw，s)，舒张末期左室后壁厚度(lvpw，d)、收缩末期左室后壁厚度(lvpw，s)，至少连续记录3个心动周期，取3次测量的平均值记录。
59.结果：
60.血管紧张素ii灌注14天后，采用小动物超声成像系统评价小鼠心脏舒张期左室前壁厚度，从图2a中可见，与nc
‑
srna组相比，灌胃xkc
‑
srna
‑
3(30nmol/只)显著降低了小鼠心脏舒张期左室前壁厚度，且效果优于同剂量的卡托普利，表明xkc
‑
srna
‑
3可以逆转血管紧张素ii灌注导致的心脏舒张期左室前壁增厚。
61.动物超声成像系统评价小鼠心脏收缩期左室后壁厚度，从图2b中可见，与nc
‑
srna组相比，灌胃xkc
‑
srna
‑
3(30nmol/只)显著降低了小鼠心脏收缩期左室后壁厚度，且效果优于同剂量的卡托普利，表明xkc
‑
srna
‑
3具有可以逆转血管紧张素ii灌注导致的心脏收缩期左室后壁增厚的功能。
62.动物超声成像系统评价小鼠心脏收缩期左室前壁厚度，从图2c中可见，与nc
‑
srna组相比，灌胃xkc
‑
srna
‑
3(30nmol/只)显著降低了小鼠心脏收缩期左室前壁厚度，且效果优于同剂量以及有效剂量(2300nmol/只)的卡托普利，表明xkc
‑
srna
‑
3可以逆转血管紧张素ii灌注导致的心脏收缩期左室前壁增厚。
63.动物超声成像系统评价小鼠心脏舒张期左室后壁厚度，从图2d中可见，与nc
‑
srna组相比，灌胃xkc
‑
srna
‑
3(30nmol/只)显著降低了小鼠心脏舒张期左室后壁厚度，且效果优于同剂量以及有效剂量(2300nmol/只)的卡托普利，表明xkc
‑
srna
‑
3可以逆转血管紧张素ii灌注导致的心脏舒张期左室后壁增厚。
64.2.小鼠心脏心肌肥厚、纤维化、炎症基因的检测
65.1)术后第14天，处死小鼠，取心脏组织置于
‑
80℃冰箱冻存；
66.2)取出冻存的组织样品，取大概50mg组织加入1ml trizol后，匀浆器充分裂解组织2min；
67.3)总rna提取：取1ml组织裂解液，加入200μl氯仿，充分混匀后室温放置10min，4℃，12000rpm离心15min。吸取上层水相至另一离心管中(注意：不要吸取中间界面，也不要触碰中间层)；按0.6倍水相体积加入异丙醇，颠倒混匀，室温静置15min，4℃，12000rpm离心15min，弃上清，此时可见白色的rna沉淀沉于管底。加入1ml 750ml/l乙醇，温和振荡离心管，悬浮沉淀，4℃，12000rpm离心10min。弃掉上清，将离心管壁残留的液体吸干，打开管盖，室温晾干。根据rna沉淀的量，用25
‑
100μl的depc处理的h2o溶解rna样品。用nanodrop2000测定rna的浓度和纯度；
68.4)rna逆转录为cdna：根据nanodrop2000测定的rna的浓度，将提取的rna样品加depc处理的h2o，调节浓度至150ng/μl，将rna逆转录为cdna，逆转录体系如下：模板rna(150ng/μl)10μl，10x rt缓冲液2.0μl，25x dntp混合物(100mm)0.8μl，10x随机引物2.0μl，逆转录酶1.0μl，rnase抑制剂1μl,nuclease
‑
free h2o 1.2μl，瞬时离心后,放入pcr仪反应，反应条件如下：(1)25℃，10min；(2)37℃，120min；(3)85℃，5min；(4)4℃，终止反应；
69.5)定量pcr扩增反应：qpcr反应体系总体积10μl，包括：5μl 2
×
sybr green master mix，0.5μl正向引物(10μm)，0.5μl反向引物(10μm),1μl逆转录得到的cdna,3μl无rnase dh2o。使用lightcycler 480荧光定量pcr仪，pcr反应条件是：95℃，持续5min预变性，进入pcr扩增循环：(1)95℃，10s；(2)55℃，10s；(3)72℃，20s，持续40个循环，最后40℃10s降温。扩增反应正向引物和反向引物均由北京擎科生物技术有限公司合成。所用引物序列如下：
[0070][0071][0072]
最后，利用2
‑
δδct法计算相对表达量。
[0073]
3.小鼠心脏石蜡切片wga染色
[0074]
1)固定、脱水：取小鼠心脏，放入4％多聚甲醛室温摇床上固定24h，将心脏按照编号放入包埋框，流水冲洗蜡包埋。石蜡脱蜡、切片：按照30％乙醇(10min)
→
50％乙醇(10min)
→
75％乙醇(10min)
→
85％乙醇(10min)
→
95％乙醇(10min)
→
无水乙醇(10min)，ddh2o清洗后组织放入异丁醇4℃过夜浸泡；
[0075]
2)包埋、切片、烤片：次日在58℃石蜡液浸泡组织1h，在石蜡包埋机上将心脏组织包埋备用；将石蜡组织块置于切片机槽内，设置切片厚度为5μm开始切片，用载玻片将展开后无皱褶的切片粘附平整，置于烤片机上60℃烤片1h；
[0076]
3)脱蜡：二甲苯i(20min)
→
二甲苯ⅱ(20min)
→
无水乙醇ⅰ(10min)
→
无水乙醇ⅱ(10min)
→
95％乙醇(5min)
→
90％乙醇(5min)
→
80％乙醇(5min)
→
70％乙醇(5min)，ddh2o清洗；
[0077]
4)抗原修复：随后将载玻片置于有0.01m枸橼酸钠缓冲液(ph＝6.0)的高压锅中，缓慢加压，不盖锅盖使玻片在缓冲液中浸泡五分钟，然后将盖锁定；阀门升起后10分钟后撤去热源，置入凉水中阀门沉下后打开盖子；
[0078]
5)染色：用组织化学笔在组织周围画圈，每个圈内滴加50μlwga
‑
af488w工作液，室温孵育15min；使用pbs漂洗(5min)3次；
[0079]
6)封片：使用中性树胶封片，置于室温封干超过24h；
[0080]
7)拍照、统计：使用共聚焦显微镜绿色488nm激发荧光通道，调整为(40x)目镜视野后，选择心肌细胞横截面拍照，每张病理切片随机选择5个不同视野，每个视野随机再选择20个细胞，使用image pro 10统计平均细胞面积大小。
[0081]
4.小鼠心脏石蜡切片psr染色
[0082]
1)固定、脱水：取小鼠心脏，放入4％多聚甲醛室温摇床上固定24h，将心脏按照编
号放入包埋框，流水冲洗蜡包埋。石蜡脱蜡、切片：按照30％乙醇(10min)
→
50％乙醇(10min)
→
75％乙醇(10min)
→
85％乙醇(10min)
→
95％乙醇(10min)
→
无水乙醇(10min)，ddh2o清洗后组织放入异丁醇4℃过夜浸泡；
[0083]
2)包埋、切片、烤片：次日在58℃石蜡液浸泡组织1h，在石蜡包埋机上将心脏组织包埋备用；将石蜡组织块置于切片机槽内，设置切片厚度为5μm开始切片，用载玻片将展开后无皱褶的切片粘附平整，置于烤片机上60℃烤片1h；
[0084]
3)脱蜡：二甲苯i(20min)
→
二甲苯ⅱ(20min)
→
无水乙醇ⅰ(10min)
→
无水乙醇ⅱ(10min)
→
95％乙醇(5min)
→
90％乙醇(5min)
→
80％乙醇(5min)
→
70％乙醇(5min)，ddh2o清洗；
[0085]
4)苏木素染色液染色15min，酸性分化液分化30
‑
60s；自来水洗一次，蒸馏水洗三次；
[0086]
5)天狼星红染色液滴染1h，流水稍微冲洗去除切片表面染液；
[0087]
6)脱水、封片：将切片依次放入95％乙醇i(5min)
→
95％乙醇ii(5min)
→
无水乙醇i(5min)
→
无水乙醇ⅱ(5min)
→
二甲苯i(5min)
→
二甲苯ⅱ(5min)，脱水后将切片从二甲苯中拿出并晾干，中性树胶封片，24h晾干后显微镜观察并进行图像采集分析。
[0088]
结果：
[0089]
血管紧张素ii灌注14天后，小鼠心脏心肌肥厚标志物anp和bnp的表达结果如图3a
‑
图3b所示，其中，与nc
‑
srna组相比，灌胃xkc
‑
srna
‑
3(30nmol/只)显著降低了小鼠心肌肥厚标志物anp和bnp的表达，且效果优于同剂量以及有效剂量(2300nmol/只)的卡托普利，***表示统计学分析结果p<0.001，非配对t检验。表明xkc
‑
srna
‑
3可以显著降低心肌肥厚标志基因anp和bnp的表达。
[0090]
血管紧张素ii灌注14天后，小鼠心脏纤维化相关基因col1a1和col3a1的表达结果如图3c
‑
图3d所示，其中，与nc
‑
srna组相比，灌胃xkc
‑
srna
‑
3(30nmol/只)显著降低了小鼠心肌纤维化基因col1a1的表达，且效果优于同剂量以及有效剂量(2300nmol/只)的卡托普利，*表示统计学分析结果p<0.05，**表示统计学分析结果p<0.01，非配对t检验。表明xkc
‑
srna
‑
3可以显著降低心肌纤维化基因col1a1和col3a1的表达。
[0091]
血管紧张素ii灌注14天后，小鼠心脏炎症相关基因il
‑
6和mcp
‑
1的表达结果如图3e
‑
图3f所示，其中，与nc
‑
srna组相比，灌胃xkc
‑
srna
‑
3(30nmol/只)显著降低了小鼠心脏心肌炎症相关基因il
‑
6和mcp
‑
1的表达，且效果优于同剂量以及有效剂量(2300nmol/只)的卡托普利，*表示统计学分析结果p<0.05，**表示统计学分析结果p<0.01，非配对t检验。表明xkc
‑
srna
‑
3可以显著降低心肌炎症相关基因il
‑
6和mcp
‑
1的表达。
[0092]
血管紧张素ii灌注14天后，通过wga染色观察小鼠心肌细胞面积，如图4a和4b所示，其中，与nc
‑
srna组相比，灌胃xkc
‑
srna
‑
3(30nmol/只)显著降低了小鼠心肌细胞横截面积，且效果优于同剂量的卡托普利，**表示统计学分析结果p<0.01，非配对t检验。表明在小鼠病理层面，xkc
‑
srna
‑
3可以有效改善血管紧张素ii灌注导致的心肌细胞面积增大，对血管紧张素ii灌注导致的心肌肥厚具有改善作用。
[0093]
血管紧张素ii灌注14天后，通过psr染色观察小鼠心脏胶原纤维沉积情况，如图5a和5b所示，其中，与nc
‑
srna组相比，xkc
‑
srna
‑
3(30nmol/只)显著降低了小鼠心肌纤维化的面积，且效果优于同剂量的卡托普利，**表示统计学分析结果p<0.01，非配对t检验。表明在
小鼠病理层面，xkc
‑
srna
‑
3可以有效降低血管紧张素ii灌注导致的心脏胶原纤维的沉积，具有改善心肌纤维化的作用。
[0094]
实施例4.双荧光素酶报告基因检测系统验证xkc
‑
srna
‑
3的靶点
[0095]
样品制备
[0096]
1)在转染前1d，用胰酶消化对数生长期的hek293t细胞，用dmem培养基稀释成1
×
105个细胞/ml的密度，混匀后分入48孔板中，每孔0.3ml，放入37℃细胞培养箱中培养；
[0097]
2)待细胞至少贴壁12h后，用rnai max转染xkc
‑
srna
‑
3，对照组转染nc，终浓度为100nmol/l；
[0098]
3)转染xkc
‑
srna
‑
3 24h后，用lipofectaminetm 2000转染psicheck
tm
‑
2载体，分别转染3’utr野生型质粒和3’utr突变型质粒，即，在转染xkc
‑
srna
‑
3 24h后，用lipofectamine 2000分别转染带有ace基因3’utr的野生型质粒以及ace基因3’utr种子区突变的突变型质粒。每孔加入1μl的lipofectaminetm 2000及300ng的psicheck
tm
‑
2载体；
[0099]
4)转染48h后，检测双荧光素酶活性，具体步骤见下。
[0100]
双荧光素酶活性测定
[0101]
参考普洛麦格(北京)生物技术有限公司双荧光素酶报告基因检测试剂盒说明的操作步骤
[0102]
1)将所有试剂从
‑
20℃取出，4℃溶化，平衡至室温；
[0103]
2)按照实验用量配制1
×
plb溶液(被动裂解缓冲液)，用去离子水将5
×
被动裂解缓冲液稀释成1
×
被动裂解缓冲液。小心弃去48孔板内培养基，每孔加100μl的1
×
被动裂解缓冲液。放置摇床上室温裂解15
‑
25min，充分裂解细胞。用移液器将细胞裂解液吸入ep管内，室温8000rpm离心5min；
[0104]
3)取白色不透明的专用96孔板，每孔依次加入10μl的细胞裂解上清；
[0105]
4)按照实验用量需要配制荧光素酶检测试剂ii和stop&试剂；
[0106]
5)利用promega双荧光素酶基因报告系统仪器测定双荧光素酶活性；
[0107]
6)仪器检测完毕后，记录双荧光素酶各自的数值，清洗仪器关机。
[0108]
结果：
[0109]
利用双荧光素酶报告基因检测系统检测xkc
‑
srna
‑
3小rna的靶基因的结果如图6a和6b所示，xkc
‑
srna
‑
3靶向ace基因(ace基因的ncbi编号为nm_000789.4)的3’utr的序列uccugcccugucccugucccc(seq id no:16)，提示xkc
‑
srna
‑
3通过靶向该区域发挥降压功效，并成为潜在的治疗人高血压及其器官损伤的药物。