低甲基化PDGFRL基因作为α辐射损伤预测的分子标志物的用途的制作方法

低甲基化pdgfrl基因作为
α
辐射损伤预测的分子标志物的用途
技术领域
1.本发明属于生物检测技术领域，涉及低甲基化pdgfrl基因作为α辐射损伤预测的分子标志物的用途。


背景技术：

2.α粒子的辐射致癌效应是辐射生物效应研究领域的关注重点。icrp第31号出版物综述了大量的动物实验结果，认为包括钚在内的α放射性核素的生物效应主要表现为淋巴细胞减少、呼吸功能不全、肺和淋巴结纤维化、细胞变性、肺癌和骨肉瘤等，由于血液受照，淋巴细胞水平降低，会影响动物的免疫能力，进而使肿瘤发生的易感性增高。
3.在α辐射致癌损伤的分子机制中，除导致基因结构的改变外，还可通过产生表观遗传改变，可导致某些关键基因的表达变化，影响生物学功能，如促使癌基因激活、抑癌基因失活、干扰细胞周期调控等。
4.dna甲基化是表观遗传修饰的主要形式。pdgfrl(platelet derived growth factor receptor like，血小板衍生生长因子受体，genbank登陆号：nc_000008:17576433..17643144)的蛋白结构与血小板来源的生长因子受体β的配体结合域具有显著的序列相似性，称为pdgfr“样”蛋白。目前研究结果认为pdgfrl基因作为一种癌基因，参与细胞增殖、发育、血管生成等过程，可能与某些肿瘤的发生发展有关。促癌基因的低甲基化在肿瘤的早期诊断中具有重要的临床意义。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供低甲基化pdgfrl基因作为α辐射损伤预测的分子标志物的用途，以能够便捷、准确、低成本的进行早期α辐射损伤的预测。
6.为实现此目的，在基础的实施方案中，本发明提供低甲基化pdgfrl基因作为α辐射损伤预测的分子标志物的用途(即低甲基化pdgfrl基因作为分子标志物用于制备α辐射损伤诊断的试剂盒的用途)，所述的低甲基化pdgfrl基因是pdgfrl基因的启动子区域的甲基化水平为24.62
±
5.93％(对应对照组甲基化水平29.33
±
7.14％，p＜0.05)。
7.我国放射作业人员逐年增加，受照途径包括外照射和内照射。α内照射对人体产生持续内照射，但是其健康损伤效应不明确，特异的健康监护指标缺失。dna甲基化是一种最重要的表观遗传修饰形式。研究证明，dna甲基化改变是癌症发生早期的重要生物学基础。目前临床上已将dna甲基化用于癌症早期诊断和预后的指标。在电离辐射致癌的早期分子生物学改变中，dna甲基化及其调控机制是目前电离辐射生物效应研究的热点。
8.在一种优选的实施方案中，本发明提供低甲基化pdgfrl基因作为α辐射损伤预测的分子标志物的用途，其中pdgfrl基因的甲基化位点包括启动子区域的cg25912517的cg位点。
9.在一种优选的实施方案中，本发明提供低甲基化pdgfrl基因作为α辐射损伤预测
的分子标志物的用途，其中所述的辐射损伤为局部或全身的组织器官不良反应(如恶心、呕吐、食欲减退、白细胞下降和/或皮肤发红变痒等)。
10.本发明的有益效果在于，利用本发明的低甲基化pdgfrl基因作为α辐射损伤预测的分子标志物的用途，能够便捷、准确、低成本的进行早期α辐射损伤的预测。
具体实施方式
11.通过如下的实施例对本发明的实施作进一步说明，但本发明的实施方式并不局限于如下的实施例。
12.实施例1：
13.1、利用基因芯片对α受照人员外周血dna甲基化检测、分析，初步筛选显著差异甲基化基因
14.1)样本的采集
15.选取受照人员(钚内照射剂量范围为24.0msv-2254.0msv)和对照人员的血液样本。
16.2)外周血基因组dna提取
17.提取样本的基因组dna。采用illumina公司血液基因组dna提取试剂盒，按照产品说明书进行样本全血基因组dna提取。用分光光度计检测提取dna浓度，同时评估a260/a280比值在1.8-2.0之间，质量满足实验要求，可进行后续实验。
18.3)亚硫酸盐转化
19.用亚硫酸盐试剂(nahso3，生工生物工程(上海)股份有限公司)溶解样本dna，加入亚硫酸盐反应成分(nahso3，生工生物工程(上海)股份有限公司)，在pcr仪中启动循环、扩增(条件见表1)，pcr完成亚硫酸盐作用下的dna转化。
20.表1 pcr反应条件
21.序号程序温度时间1变性95℃5min2复性60℃25min3变性95℃5min4复性60℃85min5变性95℃5min6复性60℃175min7保持20℃——
22.4)dna甲基化芯片检测
23.采用illumina850k甲基化芯片(简称850k芯片，zymo ca，illumina公司)测定全基因组dna甲基化水平。
24.5)甲基化芯片筛选差异甲基化位点
25.①
δβ值：即为对照组与受照组各cpg位点的甲基化值β相减的结果，即实验组与对照组在每个位点的甲基化的差异程度。
26.②
差异分值(diff score值)：比较每个基因位点在受照组与对照组之间的表达差异，差异分值取正值表示受照组较对照组甲基化程度升高，取负值则表示降低。
27.③
差异甲基化基因位点的筛选标准：
28.实验组样本差异分值》|13|且δβ值》|0.10|，(δβ值的计算，即为实验组与对照组在每个位点的甲基化的差异程度)。
29.利用生物信息分析，筛选出pdgfrl基因启动子区域低甲基化位点，见表2。
30.表2初步筛选出pdgfrl基因启动子区域低甲基化位点
[0031][0032]
2、利用焦磷酸测序技术对实验验证位点进行人群验证
[0033]
1)样本的采集照射及染色体畸变分析
[0034]
采集30名左右受照人员(钚内照射剂量范围为24.0msv-2254.0msv)和15名左右对照组人员外周血。
[0035]
2)外周血基因组dna提取
[0036]
提取样本的基因组dna。采用illumina公司血液基因组dna提取试剂盒，按照产品说明书进行全血基因组dna提取。用分光光度计检测提取dna浓度，同时评估a260/a280比值在1.8-2.0之间，质量满足实验要求，可进行后续实验。
[0037]
3)焦磷酸测序检测pdgfrl基因甲基化程度
[0038]
①
引物设计
[0039]
表3 pdgfrl基因引物设计
[0040][0041]
②
pcr扩增反应
[0042]
表4 pcr反应体系
[0043]
模板dna浓度体积
引物f10μm2μl引物r10mμ2μldntp(混合)10μm2μltaq缓冲液(含mgcl2)10
×
5μltaq酶5u/μl0.5μlddh2o-50μl
[0044]
表5 pcr反应条件
[0045]
序号程序温度时间1预变性95℃5min2变性94℃30sec3退火55℃30sec4延伸72℃50sec5循环2-435循环 6修复延伸72℃8min
[0046]
③
焦磷酸测序
[0047]
a)pcr产物和水混合制成38.5μl反应体系。
[0048]
b)在96孔pcr反应板中加入反应结合珠2μl，结合缓冲液38μl，pcr产物40μl，室温下充分混勾10min。
[0049]
c)开启真空泵吸取结合珠及pcr产物混悬液，依次浸入70％(v/v)乙醇，0.2mnaoh和冲洗缓冲液中各5s。
[0050]
d)关闭真空泵后将探头上结合珠及pcr产物置入40μl退火缓冲液(含测序引物1.5μl)，85℃变性2min，冷却至室温，使引物与模板退火杂交。
[0051]
e)根据pyrose quencing软件序列设计信息所计算出剂量，在试剂舱中依次加入底物混合物、酶混合物及四种dntp。
[0052]
f)将试剂舱及96孔反应板放入pyrosequencing检测仪(qiagen公司)进行反应，pyroq-cpg软件自动分析每个位点甲基化水平。而且每个样品的每个引物都有一个测序峰图，测序峰图中的每个百分比对应的位点即为甲基化位点。
[0053]
4)统计分析
[0054]
采用spss 22.0统计软件对差异甲基化基因的甲基化程度数据进行统计分析，根据是否符合正态分布，两组间的比较用t检验(正态)或mann-whitney检验(非正态)，两组间的相关性分析采用spearman法。采用逐步多元线性回归方程分析甲基化水平的影响因素。统计学检验为双侧，检验水准α＝0.05。结果见表6。
[0055]
表6两组间启动子区域甲基化水平比较结果
[0056][0057]
注：*p＜0.05
[0058]
采用逐步多元线性回归方程分析剂量与差异甲基化水平的相关性。结果表明：α受
照剂量与pdgfrl基因甲基化水平具有线性相关性，偏回归系数为-4.831(p＝0.021)，有α受照剂量史，受照组pdgfrl基因的甲基化水平平均降低4.831％。结果详见表7。
[0059]
表7 pdgfrl基因甲基化水平多元线性回归分析
[0060]
指标β(95％ci)标准误(se)tp常量28.295(19.319～37.271)4.4516.3570.000受照剂量-4.831(-8.891～-0.77)2.013-2.3990.021
[0061]
因此，筛选低甲基化的pdgfrl基因启动子区域作为预测早期辐射损伤的分子标志物。
[0062]
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若对本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其同等技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。上述实施例或实施方式只是对本发明的举例说明，本发明也可以以其它的特定方式或其它的特定形式实施，而不偏离本发明的要旨或本质特征。因此，描述的实施方式从任何方面来看均应视为说明性而非限定性的。本发明的范围应由附加的权利要求说明，任何与权利要求的意图和范围等效的变化也应包含在本发明的范围内。