适用于毛囊干细胞体外培养的培养基配方和用于体外3d毛囊干细胞的培养方法
技术领域
1.本发明属于生物医药领域，涉及一种适用于毛囊干细胞体外培养的培养基配方和用于体外3d毛囊干细胞的培养方法。
背景技术：
2.成体干细胞(adult somatic stem cells ，scs)是指存在于一种已经分化组织中的未分化细胞，这种细胞能够自我更新并且能够特化形成组成该类型组织的细胞。在特定条件下，成体干细胞或者产生新的干细胞，或者按一定的程序分化，形成新的功能apsc多能细胞，从而使组织和器官保持生长和衰退的动态平衡。成年个体组织中的成体干细胞在正常情况下大多处于休眠状态，在病理状态或在外因诱导下可以表现出不同程度的再生和更新能力。成体干细胞存在于机体的各种组织器官中，维持组织器官的更新、修复和重塑。成体干细胞在体内的增殖分化受到严格的稳态调控，在组织器官需要的时候能有效而及时的进行组织器官功能的修复。成体干细胞数量维持的调控机制尚待研究。
3.毛囊干细胞(hair follicle stem cells，hfscs)是存在于毛囊外根鞘隆突部（bulge region）的一种具有未分化性、自我更新和体外增殖能力强等特点的干细胞。人毛囊干细胞属于成体干细胞的一种，具有成体干细胞的共性，在体内处于静止状态，在激活状态下则表现出惊人的增殖分化能力。研究发现，毛囊干细胞具有多向分化潜能，它可以分化成表皮、毛囊、皮脂腺，参与皮肤创伤愈合的过程。作为一种成体干细胞，hfscs大多时间处于静息状态，在正常稳态下，只有一部分的hfscs会被激活进入细胞周期，毛囊干细胞活化后生成primed hfscs，再由primed hfscs分化生成短暂增殖细胞（transit amplifying cells，tac），tac细胞是毛囊干细胞和有丝分裂后分化细胞（postmitotic differentiating cells，pdc）之间的一种过渡状态，来提供足够量的毛囊前体细胞，生成新的毛发。未活化的毛囊干细胞则通过缓慢的自我复制，来维持毛囊部位干细胞的数量。这种“自我更新-定向分化”的平衡对于维持正常毛囊再生至关重要。
4.毛囊干细胞具有很高的增殖潜能，可诱导分化为神经元细胞，神经胶质细胞，平滑肌细胞和黑色素细胞等细胞，而植入体内则可分化形成神经元、黑色素细胞和角化细胞等，其在再生医学、创伤修复、和毛发再生等方面的作用长期以来受到研究者的关注。然而，在体外，单独培养毛囊干细胞无法实现无限扩增，随着毛囊干细胞在体外传代的代数增加，它的增殖分化能力也随之下降。毛囊干细胞体外培养时传代代数短，细胞分化严重等问题成为制约毛囊干细胞研究和应用的主要障碍；要保持毛囊干细胞的特性研究者都会通过与表皮角质细胞（epidermal keratinocytes）、成纤维细胞饲养层（fibroblast feeder layer）共同培养来维持毛囊干细胞多分化潜能。但共培养让研究者们难于精准的操控和检测毛囊干细胞的分化，一种成熟的体外培养毛囊干细胞的方法亟待开发。
技术实现要素：
5.为克服毛囊干细胞体外培养时传代代数短，细胞分化严重等问题，本发明要解决的技术问题是提供一种适用于毛囊干细胞体外培养的培养基配方。
6.本发明要解决的另一个技术问题是提供上述用于毛囊干细胞体外培养的培养基配方产品用于体外3d毛囊干细胞的培养方法，以提高毛囊干细胞体外培养的细胞数目和并且有效维持了毛囊干细胞的分化潜能。
7.本发明提供了一种适用于毛囊干细胞体外培养的培养基配方，该培养基以mem培养基为基础，含有1-10 ng/ml表皮生长因子（egf）、1-30 ng/ml成纤维细胞生长因子（fgf）、1-30 ng/ml 血管内皮生长因子a（vegf-a）、1-10μm rock抑制剂 y27632和5-10μg/ml 转铁蛋白。
8.较好的，该培养基的成分还包括：胰岛素，磷酸乙醇胺，乙醇胺，氢化可的松，谷氨酰胺，青霉素，链霉素中的一种或者若干种。
9.较好的，该培养基的成分还包括不多于10%的螯合胎牛血清。通常血清的加入量可以根据细胞培养的需要进行调控，通常在0-15%，也可以是5-10%。
10.较好的，培养基成分如下：mem培养基的基础上添加5 μg/ml 胰岛素, 1-10 ng/ml egf, 1-30 ng/ml fgf，1-30 ng/ml vegf-a，1-10μm y27632, 5-10μg/ml 转铁蛋白, 10μm 磷酸乙醇胺, 10 μm 乙醇胺(ethanolamine), 0.36 μg/ml 氢化可的松, 2 mm 谷氨酰胺, 100 u/ml青霉素 and 100 μg/ml链霉素, 8% 螯合胎牛血清。
11.更好的，上述的适用于毛囊干细胞体外培养的培养基中含有10 ng/ml egf, 20 ng/ml fgf2，20 ng/ml fgf7，20 ng/ml vegf-a，5μm y27632。
12.本发明的实验结果表明，毛囊干细胞在体外利用典型的fad培养基在成纤维细胞饲养层上进行2d培养的条件下，其中的cd34+
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6+干细胞群体14天后就消失了。针对毛囊干细胞体外培养代数短、易分化的问题，本发明提供一种体外培养基配方及培养方案，模拟体内环境维持干细胞的长期生长和分化潜能。
13.本发明通过在培养基中添加rock 抑制剂 (y27632)来防止体外培养的上皮细胞因为体外培养中细胞与细胞沟通机制的丧失而产生的失巢凋亡现象。在y27632的存在下，上皮细胞以及毛囊干细胞的数量产生小幅增加。
14.本发明通过在培养基中添加适量egf，fgf, 和 vegf-a，促进细胞增殖。
15.本发明提供了使用将所述适用于毛囊干细胞体外培养的培养基配方用于体外3d毛囊干细胞的培养方法，使用上述配置得到的培养基，配合matrigel基质胶，实现体外3d培养毛囊干细胞，matrigel基质胶主要成分包括：层黏连蛋白、胶原蛋白iv等，为毛囊干细胞提供适当的生长支架。
16.本发明还提供了一个体外3d培养毛囊干细胞的方法，能更好的维持干细胞的增殖分化潜能。利用matrigel 中的层粘连蛋白（laminins）对毛囊干细胞的生长支持作用，通过添加y27632, fgf, 和 vegf-a的培养基，上皮细胞经过14天培养后，cd34+
ɑ
6+毛囊干细胞群体显著增加5倍。matrigel提供的3d环境很好的模拟了体内环境，对cd34+
ɑ
6+毛囊干细胞群体在体外的增殖和分化潜能的维持有至关重要的作用。
17.本发明提供了一个体外3d培养毛囊干细胞的方法及培养基配方，实现了毛囊干细胞体外扩增和长期的分化性能的维持。此培养基配方及培养方法克服了毛囊干细胞体外培
养时传代代数短，细胞分化严重等问题，大幅提高了毛囊干细胞体外培养的细胞数目，并且能更好的有效维持毛囊干细胞的分化潜能。
18.本发明还提供了一种体外3d毛囊干细胞的培养方法，配置本发明的适用于毛囊干细胞体外培养的培养基，配合matrigel基质胶，实现体外3d培养毛囊干细胞；matrigel基质胶为毛囊干细胞提供生长支架，其活性成分包括但不限于层黏连蛋白或者胶原蛋白iv。
19.较好的，培养基 和matrigel的混合比例为1：1.5，体积百分比。
20.本发明提供了一个体外3d培养毛囊干细胞的方法及培养基配方，实现了毛囊干细胞体外扩增和长期的分化性能的维持；本发明的培养方法具有如下优势：1. 该方法下培养的上皮细胞中cd34+
ɑ
6+毛囊干细胞群体比例能在多次传代后得到维持。
21.2．操作简便，成本低。
具体实施方式
22.下面将对本技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本技术保护的范围。
23.本发明提供一种适用于毛囊干细胞体外培养的培养基配方和用于体外毛囊干细胞3d的培养方法，培养基成分如下：mem培养基的基础上添加5 μg/ml 胰岛素, 1-10 ng/ml egf, 1-30 ng/ml fgf，1-30 ng/ml vegf-a，1-10μm y27632, 5-10μg/ml 转铁蛋白, 10μm 磷酸乙醇胺, 10 μm 乙醇胺(ethanolamine), 0.36 μg/ml 氢化可的松, 2 mm 谷氨酰胺, 100 u/ml青霉素和100 μg/ml链霉素, 8% 螯合胎牛血清。本发明所述毛囊干细胞使用层粘连蛋白凝胶提供3d培养环境，通过rock抑制剂y27632促进干细胞类悬浮培养，在fgf, 和 vegf-a共同作用下实现传代培养和分化标志物的维持，包括促进毛囊干细胞体外增殖及分化潜能的维持。
24.试剂：mem培养基 ，胰岛素, egf,转铁蛋白, 10μm 磷酸乙醇胺, 10 μm 乙醇胺均采购自sigma; 氢化可的松购自calbiochem； 谷氨酰胺，青霉素，链霉素以及胎牛血清均采购自gibco。
25.实施例1取小鼠背部皮肤剪碎后用0.8% 胰蛋白酶(gibco)于37℃消化50分钟，真皮和表皮分离后，分别过70μm和45μm细胞滤网(bd biosciences)，900 rpm离心3分钟收集细胞；将得到的上皮细胞接种于包被了胶原蛋白（collagen i，30 μg/ml，millipore）和纤维粘合蛋白（fibronectin，10μg/ml，millipore）的培养皿中，在mem培养基中于37℃培养一小时，然后，用kgm 或 fad培养基悬浮接种于包被好的培养皿中。
26.实施例2用50 μl 1：1.5的比例混合上述培养基 和matrigel (corning) 悬浮8
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104上述实施例中的上皮细胞，然后接种到24孔培养皿中固化15分钟；固化好后，加入500μl的培
养基于37℃,5%co2的条件下培养，第二天更换培养基，此后每两天更换一次培养基。
27.细胞传代，将matrigel打散，加入0.5%胰蛋白酶(gibco)和0.5mmedta37℃孵育10分钟，10-14天原代上皮细胞也能够长满到75%-90%部分，因此，每10-14天可以用新鲜的1:1的魔芋葡甘聚糖溶胶（kgm）:matrigel基质胶以1:3
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1:5的比例进行传代。
28.实施例3小鼠背部皮肤分离的上皮细胞或培养得到的细胞用mem培养基离心洗涤一次后，于冰上进行荧光抗体标记30分钟，用facsbuffer(2%fcs,2mmedta,pbs)洗涤两次后，细胞用bdfacscantoii进行荧光分析；数据使用flowjo软件进行分析，使用的抗体如下：fitc-cd34(cloneram34,ebioscience),efluor450-a6integrin(clonegoh3,ebioscience),pe-cy7-epcam(cloneg8.8,ebioscience)。
29.结果显示，细胞传代在10代以内能够保持良好的状态，细胞性质不改变，表面标志物仍然能够清晰显示和被检测到。也有上皮细胞传代到20代甚至50代仍然能够保持较好的状态。
30.以上所述，仅为本技术的具体实施方式，但本技术的保护范围并不局限于此，任何熟悉本领域技术的技术人员在本技术公开的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本技术的保护范围之内。因此，本技术的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。