一种调控PCV2在宿主细胞中复制的方法及应用

一种调控pcv2在宿主细胞中复制的方法及应用
技术领域
1.本发明属于生物技术和兽医药技术领域，具体涉及一种调控pcv2在宿主细胞中复制的方法。


背景技术：

2.猪圆环病毒2型(porcinecircovirustype2，pcv2)是圆环病毒属的一种单股负链dna病毒，主要侵害猪只的免疫系统，造成免疫抑制，是引起断奶仔猪多系统衰竭综合征(pmws)的主要病原体，给养猪业带来巨大的经济损失。
3.n6-甲基腺苷（m6a）甲基化调控是高等真核生物rna的转录后水平的调控方式，于1974年首次被发现，近年来引起了人们的极大兴趣。m6a主要富集在mrna的启动子区、终止密码子区以及rrach motif内，它广泛的存在于哺乳动物，植物、酵母、果蝇等各类真核生物中。
4.m6a这种甲基化修饰被证明是动态和可逆的。甲基化过程是由甲基化转移酶（methyltransferase）mettl3和mettl14 1:1的比例形成的异源二聚体催化，并由亚基蛋白wtap调控。m6a甲基化可以由烷基化修复同源蛋白5(alkbh5)和肥胖相关蛋白(fto)组成的m6a去甲基酶(eraser)去除。越来越多的证据表明，m6a基因在哺乳动物中具有多种生物学功能，m6a修饰可以影响mrna代谢过程，包括mrna的加工、出核运输、翻译和 稳定性，以及在rna转录后水平调控基因的表达，进而影响各种生理过程，如生长、发育、生殖、细胞多能性、减数分裂、昼夜节律和疾病发生等。
5.病毒的生命周期是依赖宿主细胞的相关机制和途径进行的，从表观遗传学角度研究病毒活动过程对促进抗病毒机制的研究具有重要意义。人们最先在腺病毒(ad)和甲型流感病毒(iav)的mrna上检测到m6a。随后，在单纯疱疹病毒1型(hsv-1)、劳斯氏肉瘤病毒(rsv)、猴空泡病毒40(sv40)、b77肉瘤病毒、禽流感病毒和猫白血病病毒等病毒rna中也检测到了m6a。这些研究发现证明了m6a甲基化表观遗传修饰在病毒的侵染复制过程中具有重要作用。然而，对pcv2病毒复制中m6a所发挥的作用并没有报道。


技术实现要素：

6.针对现有技术中的问题，本发明提供一种调控pcv2在宿主中复制的方法，通过调控m6a甲基化修饰对于pcv2复制过程进行影响，从而达到促进或者抑制pcv2在宿主细胞内复制的作用。
7.为实现上述目的，本发明采用如下技术方案。
8.mettl14基因在调控pcv2病毒在宿主细胞中复制的应用。
9.优选地，所述应用为：a）通过药物使pk-15细胞中mettl14基因的表达量提高以提高pcv2病毒的复制量或滴度，或，b）通过药物使pk-15细胞中mettl14基因的表达量降低以降低pcv2病毒的复制量
或滴度。
10.fto基因在调控pcv2病毒在pk-15细胞中复制的应用。
11.优选地，所述应用为：a）通过过表达质粒转染使pk-15细胞中fto基因的表达量降低以提高pcv2病毒的复制量或滴度，或，b）通过sirna沉默使pk-15细胞中fto基因的表达量提高以降低pcv2病毒的复制量或滴度。
12.所述药物的活性成分可以为靶向mettl14基因或fto基因的小干扰rna（sirna）或短发卡rna（shrna），包含上述小干扰rna或短发卡rna的载体，过表达mettl14基因或fto基因的载体。
13.mir-30a-5p在调控pcv2病毒在宿主细胞中复制的应用。
14.优选地，所述应用为：a）通过药物使pk-15细胞中mir-30a-5p的表达量提高以提高pcv2病毒的复制量或滴度，或，b）通过药物使pk-15细胞中mir-30a-5p的表达量降低以降低pcv2病毒的复制量或滴度。
15.所述药物的活性成分可以为靶向mir-30a-5p的mimic或inhibitor。
16.本发明具有以下优点：本发明通过研究pcv2侵染和未侵染pk-15细胞中m6a修饰、甲基化相关酶和mirna含量上的差异，发现侵染病毒后导致机体的甲基化水平上调，且甲基化转移酶mettl14、去甲基化转移酶fto、mir-30a-5p在两种pk-15细胞中存在显著的差异。通过构建mettl14和fto过表达和沉默细胞、转染mir-30a-5p mimics细胞发现，mettl14是能够引起m6a甲基化水平升高的关键调控基因，同时fto能够使甲基化总体水平呈现降低趋势；mir-30a-5p受到mettl14和fto介导的m6a修饰调控，m6a修饰能够促进成熟mir-30a-5p的产生。将mir-30a-5p mimics转染进pk-15细胞后并接种pcv2病毒液后发现，mir-30a-5p可以促进pcv2病毒的复制，并发现可以通过mimics在mettl14缺失和fto过表达形成的m6a水平低的细胞中对pcv2复制形成补救。这说明通过m6a水平低造成的mirna表达量低可以通过补救来实现。本发明为利用宿主蛋白提高自身免疫力抵抗病毒感染，寻找病毒通用治疗靶点提供重要的依据。
附图说明
17.图1是pcv2感染对pk-15细胞中的rna甲基化表达水平的影响；图2是pcv2感染对pk-15细胞中mirna表达水平的影响；图3是转录组测序结果中各甲基化酶表达趋势；图4是rt-qpcr检测侵染pcv2病毒和未侵染的pk-15细胞中m6a调控相关基因表达量的差别；图5是靶向mettl14 sirna沉默效果验证（a. qpcr和b. western blot）；图6是靶向fto sirna沉默效果验证（a. qpcr和b. western blot）；图7是mettl14过表达转染效果验证（a. qpcr和b. western blot）；
图8是fto过表达转染效果验证（a.qpcr和b.westernblot）；图9是mettl14和fto沉默表达与过表达对细胞中m6a甲基化水平的影响；图10是mettl14和fto沉默表达与过表达对pcv2复制的影响；图11是mettl14沉默表达与过表达对细胞中10种mirna水平的影响；图12是fto沉默表达与过表达对细胞中10种mirna水平的影响；图13是mettl14沉默表达与过表达对细胞中10种pri-mirna水平的影响；图14是fto沉默表达与过表达对细胞中10种pri-mirna水平的影响；图15是转染mir-30a-5pmimics和mimicsnc的pk-15细胞中pcv2复制量的差异；图16是mettl14差异表达的细胞中fto表达量和fto差异表达的细胞中mettl14表达量；图17是mettl14和fto与mir-30a-5p共转染对pcv2复制量的影响；其中，*代表p《0.05，**代表p《0.01，ns代表无差异。
具体实施方式
18.下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明，但本发明不受下述实施例的限制。
19.实施例1pcv2感染对pk-15细胞中m6a甲基化表达水平的影响正常培养的pk-15细胞按照moi=1接种pcv2病毒，以不接毒细胞为对照，培养72h后提取细胞总rna，采用amyjetscientific公司的m6a半定量试剂盒检测整体m6a甲基化水平，步骤按照操作说明书分别加入80μlbs结合到每孔后加入nc和pc以及待检测rna，然后分别加入ca、da、es进行m6a捕获后加入ds和ss后进行置于酶标仪中进行信号检测。读取在450nm的吸光值而后通过公式计算总rna中的m6a百分比，结果如图1所示：发现m6a在接毒的细胞中含量相比较于未接毒细胞中呈现上调趋势（p《0.05）。
20.实施例2pcv2感染对pk-15细胞中甲基化相关酶和mirna表达水平的影响1.对甲基化相关酶的影响正常培养的pk-15细胞按照moi=1接种pcv2病毒，以不接毒细胞为对照，培养72h后提取细胞总rna，进行转录组测序后构建srna文库，分析甲基化相关酶mettl14、mettl3、wtap、fto、alkbh5、ythdf2等在接种和不接种细胞中表达是否有差异。结果如图2显示：通过测序分析，在mettl14和fto都在侵染pcv2病毒的pk-15细胞pcv2中显著的上调表达，其他基因无显著性表达。
21.将上述酶进行qpcr验证：正常培养的pk-15细胞按照moi=1接种pcv2病毒，以不接毒细胞为对照，培养72h后提取细胞总rna，反转录cdna，以其为模板以表1中引物进行qpcr，以β-actin为内参，每个样品3个平行，反应体系和程序如表2、3所示。
22.表1甲基化相关酶的rtqpcr引物和序列
表2rtqpcr反应体系表3rtqpcr反应程序结果如图3所示，与未接毒细胞相比，在接毒的细胞中各甲基化酶均成上调趋势，其中mettl14和fto上调显著差异。
23.2.对mirna的影响正常培养的pk-15细胞按照moi=1接种pcv2病毒，以不接毒细胞为对照，培养72h后采用mirna反转录试剂盒提取细胞mirna后，然后采用茎环法进行反转录，将反转录试剂中通用引物换成mirna通用引物，进行mirna荧光定量分析，每个样品3个平行，反应体系和程序如表5、6所示。
24.表4mirna的rtqpcr引物和序列
表5rtqpcr反应体系表6rtqpcr反应程序通过rt-qpcr筛选10种在侵染pcv2的pk-15细胞中可能有差异表达的10种mirna：mir-30b-3p、mir-125a、mir-92b-3p、mir-10b、mir-155-5p、mir-21、mir-29b、mir-361-3p、mir-15a、mir-30a-5p，结果如图4所示：mir-30b-3p、mir-125a、mir-92b-3p、mir-10b、mir-21、mir-29b、mir-361-3p、mir-15a、mir-30a-5p的表达有显著差异。
25.实施例3mettl14和fto甲基化酶的沉默表达与过表达1.mettl14和fto甲基化酶的沉默表达与过表达质粒筛选设计并合成mettl14、fto的小干扰rna（sirna），每个基因设计三个靶点，命名为simettl14-1、simettl14-2、simettl14-3、sifto-1、sifto-2和sifto-3，同时设置无关序列sinc为对照，小干扰rna序列序列见表7。mettl14、fto的过表达质粒pc3.1-mettl14、pc3.1fto过表达载体由上海吉玛基因设计并合成，过表达质粒pc3.1-pig-mettl14-c端his序列长度为1407bp，过表达质粒pc3.1-pig-fto-c端his的序列长度为1554bp。
26.表7sirna靶序列按照lipofectaminernaimax转染试剂说明书将simettl14-1、simettl14-2、simettl14-3、sifto-1、sifto-2和sifto-3以及sinc等sirna转染进细胞。按照lipofectamine3000转染试剂说明书将pc3.1-mettl14和pc3.1-fto过表达质粒和空载质粒转染进细胞。上述细胞分别于48h和72h提取总rna和蛋白，采用rt-qpcr和westernblot检测mettl14和fto甲基化酶的表达。
27.转染mettl14的sirna后rt-qpcr结果显示（图5），mettl14水平（si-mettl14）显著低于对照组（si-nc）。在si-mettl14组中，si-mettl14-3沉默效率最高，wb结果与rt-qpcr显示一致。因此，si-mettl14-3具有较好的沉默效率，将用于后续试验。转染fto的sirna后rt-qpcr结果显示（图6），fto水平（si-fto）显著低于对照组（si-nc）。在si-fto组中，si-fto-2沉默效率最高。wb结果与rt-qpcr显示一致。因此，si-fto-2具有较好的沉默效率，将用于后续试验。通过qpcr和wb结果显示，mettl14过表达质粒表达成功，在很大程度上上调了mettl14的表达（图7）。fto过表达质粒表达成功，在很大程度上上调了fto的表达（图8）。
28.2.mettl14和fto沉默表达与过表达对细胞中m6a甲基化水平的影响参照实施例3中的方法构建mettl14和fto沉默表达与过表达的pk-15细胞，72h后提取细胞总rna，检测不同处理的pk-15细胞中m6a的表达量。结果如图7所示：过表达mettl14，m6a含量相对于对照组明显上调，而干扰mettl14后，m6a含量相对于对照组明显下调（p《0.05）（图9a）。这说明mettl14影响m6a整体水平，与甲基化整体水平呈现正向调控：mettl14水平高时，m6a甲基化水平高；mettl14水平低时，m6a甲基化水平低。过表达fto，m6a含量相对于对照组明显下调，而干扰fto后，m6a含量相对于对照组明显上调（p《0.05）（图9b）。这说明fto影响m6a整体水平，与甲基化整体水平呈现负向调控：fto水平高时，m6a甲基化水平低；fto水平低时，m6a甲基化水平高。这表明，mettl14、fto是导致pk-15细胞中m6a上调、下调的关键调控基因，同时也说明mettl14、fto导致侵染pcv2病毒的pk-15细胞系中的m6a修饰紊乱。
29.3.mettl14和fto沉默表达与过表达对pcv2复制的影响
使用lipofectaminernaimax转染试剂和lipo3000转染试剂将simettl14-3、sifto-2、sinc质粒和过表达质粒转染进pk-15细胞系中沉默或过表达mettl14和fto，并于转染6h后按照moi=1接种pcv2病毒液，于接毒后48h和72h收集细胞，提取蛋白和总rna，分别做westernblot和rt-qpcr检测pcv2复制效率，以β-actin作为内参蛋白。
30.qpcr结果（图10a，图10b）显示：过表达mettl14和沉默fto上调pcv2的表达量。而过表达fto和沉默mettl14均能抑制pcv2病毒的复制，wb结果与rt-qpcr结果一致（图10c），mettl14的过表达提高了cap蛋白的表达量而沉默mettl14降低了cap蛋白的表达量。同样的，去甲基化酶fto的过表达降低了cap蛋白的表达量而fto的沉默则提高了cap蛋白的表达量。这说明mettl14在体外能促进病毒复制，fto抑制病毒复制。从而揭示了m6a甲基化能正向调控pcv2病毒复制，甲基化水平高促进病毒复制，甲基化水平低则抑制病毒复制。
31.实施例4mettl14和fto沉默表达与过表达对细胞中mirna、pri-mirna水平的影响参照实施例3中的方法构建mettl14和fto沉默表达与过表达的pk-15细胞，转染6h后按照moi=1.0接种pcv2病毒，72h后提取细胞总rna，按照实施例2中的方法检测不同处理的pk-15细胞中mirna的表达量。以表8中序列为引物，rt-qpcr检测不同处理的pk-15细胞中pri-mirna的表达量，采用actin作为内参；反应体系和条件如实施例2中mirna检测。
32.表8pri-mirna的rtqpcr引物和序列不同处理的pk-15细胞中mirna的表达量结果如图11和图12所示：mirna表达量的高低与mettl14表达水平的高低大多呈现正相关趋势，mirna在si-mettl14中表达量大多呈
下调趋势，并且在oe-mettl14的细胞中上调表达。mirna呈现与fto的表达量负相关的趋势，过表达fto，mirna表达量大多下调，反之沉默fto，mirna则大多呈上调趋势。
33.不同处理的pk-15细胞中pri-mirna的表达量结果如图13和图14所示：在pk-15细胞中mettl14敲低后，pri-mirna表达量大多显著上升；过表达mettl14会pri-mirna的表达量大多降低；而mirna表达呈现mettl14正相关的趋势，这个结果表明pri-mirna加工成pre-mirna和mirna成熟体需要mettl14来介导参与。在pk-15细胞中，fto敲低后，pri-mirna表达量大多显著下调；过表达fto会使pri-mirna的表达量上调，而mirna表达大多呈现fto负相关的趋势，这个结果表明pri-mirna加工成pre-mirna和mirna成熟体fto可能也参与和介导。
34.实施例5mir-30a-5p对pk-15细胞pcv2蛋白复制的影响选择pcv2感染与未感染pk-15细胞中mirna差异最明显的mir-30a-5p设计mimic，同时设计无关序列mimicnc作为阴性对照，序列如表9所示。按照lipofectaminernaimax转染试剂说明书将其转染进pk-15细胞，转染6h后按照moi=1.0接种pcv2病毒，于接毒后72h收集细胞，提取蛋白做westernblot检测pcv2复制效率，以β-actin作为内参蛋白。
35.表9mir-30a-5pmimic序列结果如图15所示：转染mir-30a-5pmimics的pk-15细胞中pcv2表达量上调，这说明mir-30a-5p对pcv2的复制有促进作用。
36.实施例6fto、mettl14和mir-30a-5p对pk-15细胞pcv2蛋白复制的相互作用1.mettl14和fto的相互调控参照实施例3中的方法构建mettl14和fto沉默表达与过表达的pk-15细胞，转染72h后分别用q-pcr检测fto和mettl14的表达量，结果如图16所示：在mettl14过表达的细胞中fto的表达量下调，在沉默的mettl14中fto表达上调。而在沉默和过表达fto的细胞中检测mettl14的变化显示mettl14没有显著性差异。
37.这说明甲基化转移酶mettl14不能在pk-15细胞中影响fto的表达量，但fto可以在pk-15细胞中影响mettl14的表达量。这说明侵染pcv2的pk15细胞中mettl14的上调导致了总rnas的m6a修饰上调，而fto的上调是机体对上调m6a的一种负反馈调节反应。
38.2.mettl14和fto对mir-30a-5p的调控按照lipofectaminernaimax转染试剂说明书将simettl14-3和mir-30a-5pmimics共转染进pk-15细胞，按照lipofectamine3000转染试剂说明书将pc3.1-fto过表达质粒和mir-30a-5pmimics共转染进pk-15细胞，转染6h后，按照moi=1.0接种pcv2病毒，72h后收集细胞，提取蛋白质进行westernblot检测pcv2病毒cap蛋白含量。
39.结果如图17所示：mettl14下调和fto上调的细胞中mir-30a-5pmimics可以恢复pcv2的复制，说明mir-30a-5pmimics可以补救mettl14下调和fto上调对于pcv2病毒复制的抑制作用。
40.综上可知，mir-30a-5p是mettl14和fto的下游靶基因，可以同时受这两个甲基化相关酶的调控并参与到pcv2病毒的复制过程中；m6a修饰可以调控mir-30a-5p的成熟体的过程，进一步调控pcv2的复制过程。