一种多肽类似物及其制备方法和应用与流程

文档序号:30705631发布日期:2022-07-09 22:51阅读:257来源:国知局
一种多肽类似物及其制备方法和应用与流程

1.本发明属于生物医药领域和医美化妆品领域,涉及用于人类皮肤修复领域所涉及的化合物及产品领域,具体涉及一种多肽类似物及其制备方法和应用。


背景技术:

2.皮肤是覆盖在人体表面的最大器官,是体内环境与外界环境的物理屏障,具有保护机体抵抗外界病原微生物、保持水分含量稳定等重要作用。皮肤作为生物体抵御外界环境侵害的第一道防线,起着至关重要的屏障作用,与此同时,皮肤也成为最容易受到外界损伤的组织器官,皮肤创伤是日常生活中的一种常见损伤形式。皮肤创伤在某些情况下(如糖尿病,感染,神经病变等)伤口愈合过程会延迟,且大多转为慢性创伤。一旦受到损伤后不能快速愈合,皮肤对有害刺激的防御能力减弱甚至丧失,继而会导致感染、休克甚至死亡等一系列后果。因此,伤口的快速有效愈合对身体健康至关重要。
3.创伤修复过程包括各种组织的再生和肉芽组织增生、瘢痕组织形成的复杂组合,表现出各种过程的协同作用。最常见的传统创伤修复的治疗是药物治疗,其中包括抗生素、生长因子、从植物中提取或开发的化合物以及其他免疫调节因子,但因各自的缺点均未能完全满足临床需求。与这些高成本、低活性、存在安全和运输问题的传统药物相比,生物活性多肽因具有高活性、高特异性和高稳定性而在相关研究领域中引起研究者的兴趣。
4.创伤愈合是体内多种因子、细胞参与的复杂过程,外源性生长因子对创伤愈合的作用成为当今创伤修复学研究的热点。重组人表皮生长因子,是应用基因重组技术人工合成的多肽,但不同的提取以及纯化方法对多肽的活性影响较大。
5.很多小分子多肽在皮肤抗皱及抗衰老方面已有广泛应用,它们主要包括:棕榈酰五肽-3(matrixy1)、五胜肽-3(pentapeptide-3)、乙酰基六肽-3、乙酰四胜肽一5(eyesery1)、棕榈酰寡肽(棕榈酰三肽-1)、棕榈酰三肽-5(palmitoyl tripeptide-5),棕榈酰四肽-3和七胜美容肽-脂肽(lipopeptideacetate)等,但这些小分子多肽大多只具备皮肤表层抗衰老作用或者美白等作用,而不具备创伤修复作用。
6.重组bfgf具有促进创伤愈合与组织修复的功能,但是重组bfgf采用生物工程方法生产,生产成本和使用成本较高,而且其在体外保存和运输条件较为苛刻,易降解,导致治疗部位的积累低,难以持续作用,因此在某些程度上限制和影响了其使用和相关剂型的开发。
7.专利201711275004.0也提到一种能够与fgfr2有高亲和力的氨基酸短肽(snflhlg),与目前类似的产品外用重组bfgf(包括155个氨基酸)相比,促增殖效果相当,但亲和力更高,分子量更小,也是一种很好的替代重组bfgf的促皮肤创伤修复和细胞增殖产品。
8.陈雄林等人研究结果表明多肽sikvav对成纤维细胞增殖,迁移,生长因子分泌以及胶原蛋白合成的有重要影响。
9.两栖动物如青蛙和蟾蜍,其皮肤是多功能的器官,具有防御,呼吸和水盐平衡调节
的作用。由于其长期暴露在尖锐的岩石、紫外线和微生物等环境中,两栖动物的皮肤容易受到伤害。为了克服这些因素,它们的皮肤形成了独特而有效的化学防御系统,皮肤能分泌富含多种具有特定生物学活性多肽的分泌物,包括抗菌、抗氧化和免疫调节活性肽等。特别是两栖动物皮肤分泌物能有效缩短自身皮肤创面愈合过程。近年来也有研究报道,臭蛙皮肤分泌物中的活性多肽可有效促进创面的愈合。我国物产丰富,种类众多,两栖动物皮肤这个巨大的新型活性多肽资源库,其多肽结构新颖,功能多样,值得进一步的探索与发现。
10.赖仞课题组,从无指盘臭蛙皮肤中鉴定了一条强效促皮肤创伤修复肽,命名为ah90。在小鼠全层皮损模型中,ah90表现出强烈的促创伤愈合活性。该小肽能促进内源性促创伤愈合因子的表达而不产生促有丝分裂活性,因此科研人员认为,ah90有希望开发为一个良好的促创伤愈合候选药。
11.云南医科大学吴春云研究团队研究了云南臭蛙的cdna文库,并鉴定出的多肽“oa-gl12”由12个氨基酸组成,从n端到c端的成熟肽序列为“gllsginaewpc”;其前体肽长度为326个碱基对所编码的58个氨基酸残基组成;oa-gl12对细胞划痕的愈合有明显的促进作用,且具有明显时间-浓度依赖性,在体外以时间和浓度依赖的方式明显加速了hacat和hsf细胞划痕的愈合,但未有明显的促细胞增殖活性。文献报道称oa-gl12在早期加速肉芽组织形成,但在皮肤伤口愈合的后期产生了收缩。


技术实现要素:

12.为了解决现有技术中的不足,本发明旨在提供一种多肽类似物及其制备方法和应用。本发明在肽序“gllsginaewpc”的基础上进行改进,具体技术方案如下:
13.本发明第一目的在于提供一种多肽类似物或其药学上可接受的盐,所述多肽类似物的核心肽序列为gly-leu-leu-ser-gly-ile-asn-ala-glu-trp-pro-cys,核心肽序列如seq id no.1所示,且对核心肽序列进行如下1)-4)中的一种或以上的修饰:
14.1)在核心肽的n末端进行延长,延长肽为cys,延长肽的cys与核心肽的cys形成二硫键;
15.2)对核心肽进行o-糖基化修饰;
16.3)在核心肽的n末端进行脂肪酸修饰;
17.4)在核心肽的c末端融合syn-ake肽序。
18.进一步地,对所述多肽类似物的核心肽序列进行如下修饰:在核心肽的n末端进行延长,延长肽为cys,延长肽的cys与核心肽的cys形成二硫键,所述多肽类似物记为cyclic-gc12,所述cyclic-gc12的肽序结构为cgllsginaewpc(disulfide cyclic peptide),其具有如式i所示的结构式:
[0019][0020]
进一步地,对所述多肽类似物的核心肽序列进行如下修饰:对核心肽进行o-糖基化修饰;
[0021]
优选地,所述o-糖基化修饰为o-β-d-葡萄糖修饰,所述多肽类似物记为glyco-gc12,所述glyco-gc12的肽序结构为glls(o-β-d-glucose)ginaewpc,其具有如式ii所示的结构式:
[0022][0023]
进一步地,对所述多肽类似物的核心肽序列进行如下修饰:在核心肽的n末端进行脂肪酸修饰;
[0024]
优选地,脂肪酸修饰为棕榈酰化修饰,所述多肽类似物记为pal-gc12,所述pal-gc12的肽序结构为pal-gllsginaewpc,其具有如式iii所示的结构式:
[0025][0026]
进一步地,对所述多肽类似物的核心肽序列进行如下修饰:在核心肽的c末端融合syn-ake肽序,所述多肽类似物记为syn-ake-gc12,所述syn-ake-gc12的肽序结构为gllsginaewpc-β-ala-pro-dab-nhbzl,其具有如式iv所示的结构式:
[0027][0028]
本发明的第二目的在于提供所述多肽类似物syn-ake-gc12的制备方法,包括如下步骤:
[0029]
(1)在h-cys(trt)-2-chlorotrityl resin树脂上,依照多肽类似物syn-ake-gc12的核心肽序列,依次偶联fmoc-pro-oh、fmoc-trp(boc)-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-ala-oh、fmoc-asn(trt)-oh、fmoc-ile-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-leu-oh、fmoc-leu-oh、boc-gly-oh,合成完成后,用dmf、dcm、甲醇依次清洗,干燥后得到肽树脂;
[0030]
(2)裂解步骤(1)所述肽树脂,得到全保护肽,全保护肽用dcm/dmf混合溶液溶解后,加入hoat、pyaop、edc预反应,再加入β-ala-pro-dab(boc)-nhbzl反应,反应结束后,旋蒸得到油状物,油状物再用甲醇洗涤萃取,干燥得到syn-ake-gc12保护肽;
[0031]
(3)步骤(2)所得所得syn-ake-gc12保护肽用裂解液进行裂解,滤掉树脂,树脂用少量tfa洗涤,合并滤液,加入到无水乙醚中析出白色固体,离心,无水乙醚洗涤固体,真空干燥得到syn-ake-gc12粗肽,用hplc对所得粗肽进行纯化,即得syn-ake-gc12精肽。
[0032]
进一步地,步骤(2)中裂解步骤(1)所述肽树脂时采用的裂解液为20%的tfe/dcm溶液;
[0033]
步骤(3)中所述裂解液为tfa、tis、edt、phoh和h2o的混合溶液,所述tfa、tis、edt、phoh和h2o的体积比为90:3:3:2:2。
[0034]
本发明的第三目的在于提供所述多肽类似物或其药学上可接受的盐在制备药物、护肤品、化妆品或保健品中的应用;
[0035]
优选地,所述药物、护肤品、化妆品或保健品为促进体表皮肤创伤愈合和/或减少疤痕产生。
[0036]
本发明的第四目的在于提供一种含有所述多肽类似物或其药学上可接受的盐的产品。
[0037]
进一步地,所述产品为药物、护肤品、化妆品或保健品;
[0038]
优选地,所述护肤品或化妆品为凝胶、乳液、精华液、眼霜、面膜、面霜、冻干粉或柔肤水;
[0039]
优选地,所述药物或保健品为药膏、药水、药用凝胶、药用乳膏、药用乳液或敷贴药剂。
[0040]
进一步地,所述护肤品和化妆品中还包括其他辅料;
[0041]
进一步地,所述药物或保健品中还包括可药用辅料。
[0042]
进一步地,所述产品中还包括除本发明所述多肽类似物或其药学上可接受的盐以外的其他活性成分。
[0043]
本发明的有益效果为:
[0044]
本发明提供的多肽类似物相对bfgf,因为仅有几个到十几个氨基酸,故降解程度大大降低,具有技术上的先进性。1)cyclic-gc12利用环化修饰让多肽更不易氧化,同时具有更好的稳定性。2)glyco-gc12利用糖基化修饰具有更好的皮肤吸收功能。3)pal-gc12利用长链脂肪酸修饰可以增强透皮效果,而且其结构的稳定性会更好,并且棕榈酸(pal)能显著促进人外周血单核细胞的增殖,因此也具有促细胞增值活性的作用,可以解决oa-gl12单独使用无明显促细胞增殖活性的缺陷,具有更好的皮肤创伤修复效果。4)syn-ake-gc12肽序用gc-12和功能小分子多肽syn-ake肽序进行融合,使其具备双功能的一种功能化合物。syn-ake是一种模拟蛇毒毒素waglerin i活性的小肽,为肌肉烟碱乙酰胆碱受体(nmachr)拮抗剂,具有皮肤紧皱的功效,蛇毒肽能阻滞乙酰胆碱与受体的结合,最终导致受体封闭,在封闭状态下钠离子不能摄入,无法去极化,神经兴奋传递阻断,肌肉因此得到松弛,syn-ake能够2小时减少肌肉收缩82%,另外蛇毒肽具有调控离子通道、调控细胞增殖与凋亡、调控细胞因子表达等作用,因此对促进细胞的增值活性有非常积极的作用,syn-ake和具有皮肤修复功能的多肽分子oa-gl12具有协同作用,可以解决oa-gl12单独使用无明显促细胞增殖活性和皮肤伤口愈合后期产生收缩的缺陷,syn-ake-gc12对皮肤创伤的修复具有更好的效果。
附图说明
[0045]
图1:syn-ake-gc12纯品的hplc分析检测结果。
[0046]
图2:syn-ake-gc12纯品的质谱检测结果。
具体实施方式
[0047]
为了使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂,下面对本发明的具体实施方式做详细的说明,但不能理解为对本发明的可实施范围的限定。
[0048]
实施例1:cyclic-gc12制备
[0049]
cyclic-gc12的肽序:cgllsginaewpc(disulfide cyclic peptide),分子量为:
1360.57,其结构式如下:
[0050][0051]
cyclic-gc12的制备,具体步骤如下:
[0052]
1.1、称取h-cys(trt)-2-chlorotrityl resin树脂(sub=0.40mmol/g)2.5克(1mmol)于反应柱中,用dmf清洗3次,再用dmf溶胀30分钟。称取fmoc-pro-oh 2.6克(6mmol),hobt 0.9克(6.6mmol),用dmf溶解,0℃冰水浴下加入1.2克dic(9mmol),活化5分钟,加入反应柱,反应2小时后,茚三酮检测结果为阴性(树脂无色透明),然后用dblk(20%六氢吡啶/dmf)脱除fmoc保护基团,然后重复上述操作,按照序列偶联fmoc-trp(boc)-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-ala-oh、fmoc-asn(trt)-oh、fmoc-ile-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-leu-oh、fmoc-leu-oh、fmoc-gly-oh、boc-cys(trt)-oh,线性肽树脂合成完成后,加入碘单质(i2)2.5克进行环化,环化反应时间为2小时,反应结束后,用dmf、dcm、甲醇依次清洗,干燥后得到肽树脂。
[0053]
1.2、肽树脂用预先配制好的裂解液(tfa:tis:h2o=94:3:3(体积比))进行裂解,裂解反应时间2.5小时,滤掉树脂,树脂用少量tfa洗涤,合并滤液,加入到无水乙醚中析出白色固体,离心,无水乙醚洗涤固体,真空干燥的到白色固体,白色固体为cyclic-gc12粗肽,用hplc对上述粗肽进行纯化,得到纯度96.25%的精肽269mg,产品总收率33.15%。产品经结构确认,确认是目标产物。
[0054]
实施例2:glyco-gc12制备
[0055]
glyco-gc12的肽序:glls(o-β-d-glucose)ginaewpc,分子量为:1421.59,其结构式如下:
[0056][0057]
glyco-gc12的制备,具体步骤如下:
[0058]
2.1、称取h-cys(trt)-2-chlorotrityl resin树脂(sub=0.40mmol/g)2.5克(1mmol)于反应柱中,用dmf清洗3次,再用dmf溶胀30分钟。称取fmoc-pro-oh 2.5克(6mmol),hobt 0.9克(6.6mmol),用dmf溶解,0℃冰水浴下加入1.2克dic(9mmol),活化5分钟,加入反应柱,反应2小时,然后用dblk脱除fmoc保护基团。重复上述操作,按照序列偶联fmoc-trp(boc)-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-ala-oh、fmoc-asn(trt)-oh、fmoc-ile-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-ser(o-β-d-glucose)-oh、fmoc-leu-oh、fmoc-leu-oh、boc-gly-oh,合成完成后用dmf、dcm、甲醇依次清洗,干燥后得到肽树脂。
[0059]
2.2、肽树脂用预先配制裂解液(tfa:tis:edt:phoh:h2o=90:3:3:2:2(体积比))进行裂解,裂解反应时间2.5小时,滤掉树脂,树脂用少量tfa洗涤,合并滤液,加入到无水乙醚中析出白色固体,离心,无水乙醚洗涤固体,真空干燥的到白色固体的glyco-gc12粗肽,用hplc对上述粗肽进行纯化,得到纯度97.33%的精肽198mg,产品总收率24.25%。产品经结构确认,确认是目标产物。
[0060]
实施例3:pal-gc12制备
[0061]
pal-gc12的肽序:pal-gllsginaewpc,分子量为:1497.86,其结构式如下:
[0062][0063]
pal-gc12的制备,具体步骤如下:
[0064]
3.1、称取h-cys(trt)-2-chlorotrityl resin树脂(sub=0.40mmol/g)2.5克(1mmol)于反应柱中,用dmf清洗3次,再用dmf溶胀30分钟。称取fmoc-pro-oh 2.5克(6mmol),hobt 0.9克(6.6mmol),用dmf溶解,0℃冰水浴下加入1.2克dic(9mmol),活化5分钟,加入反应柱,反应2小时,然后用dblk脱除fmoc保护基团。重复上述操作,按照序列偶联fmoc-trp(boc)-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-ala-oh、fmoc-asn(trt)-oh、fmoc-ile-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-leu-oh、fmoc-leu-oh、fmoc-gly-oh、棕榈酰氯(palmitoyl chloride),合成完成后用dmf、dcm、甲醇依次清洗,干燥后得到肽树脂。
[0065]
3.2、肽树脂用预先配制裂解液(tfa:tis:edt:phoh:h2o=90:3:3:2:2(体积比))进行裂解,裂解反应时间2.5小时,滤掉树脂,树脂用少量tfa洗涤,合并滤液,加入到无水乙醚中析出白色固体,离心,无水乙醚洗涤固体,真空干燥的到白色固体的pal-gc12粗肽,用hplc对上述粗肽进行纯化,得到纯度98.14%的精肽297mg,产品总收率36.78%。产品经结构确认,确认是目标产物。
[0066]
实施例4:syn-ake-gc12制备
[0067]
syn-ake-gc12的肽序:gllsginaewpc-β-ala-pro-dab-nhbzl,分子量为:1696.90,其结构式如下:
[0068][0069]
syn-ake-gc12的制备,具体步骤如下:
[0070]
4.1、称取h-cys(trt)-2-chlorotrityl resin树脂(sub=0.40mmol/g)2.5克(1mmol)于反应柱中,用dmf清洗3次,再用dmf溶胀30分钟。称取fmoc-pro-oh 2.5克(6mmol),hobt 0.9克(6.6mmol),用dmf溶解,0℃冰水浴下加入1.2克dic(9mmol),活化5分钟,加入反应柱,反应2小时,然后用dblk脱除fmoc保护基团。重复上述操作,按照序列偶联fmoc-trp(boc)-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-ala-oh、fmoc-asn(trt)-oh、fmoc-ile-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-leu-oh、fmoc-leu-oh、boc-gly-oh,合成完成后用dmf、dcm、甲醇依次清洗,干燥后得到肽树脂。
[0071]
4.2、4.1步得到的肽树脂用50ml的20%的tfe/dcm溶液进行裂解,裂解时间为1.5小时,裂解液用500ml预先冷冻的乙醚沉淀、离心,固体用冷冻乙醚洗涤、离心两次,固体干燥后得到全保护肽0.87克,全保护肽加入到圆底烧瓶后,用dcm/dmf混合溶液搅拌溶解,称取hoat 0.9克、pyaop 3.13克、edc 1.40克预反应30分钟后加入到上述圆底烧瓶,再称取0.47克β-ala-pro-dab(boc)-nhbzl(syn-ake的保护片段肽)加入到上述圆底烧瓶,再搅拌反应4小时,反应结束,旋蒸后得到油状物,油状物再用甲醇洗涤萃取三次,干燥得到淡黄色固体,该固体为syn-ake-gc12保护肽。
[0072]
4.3、上步反应得到的固体用预先配制裂解液(tfa:tis:edt:phoh:h2o=90:3:3:2:2(体积比))进行裂解,裂解反应时间2.5小时,滤掉树脂,树脂用少量tfa洗涤,合并滤液,加入到无水乙醚中析出白色固体,离心,无水乙醚洗涤固体,真空干燥的到白色固体的syn-ake-gc12粗肽,用hplc对上述粗肽进行纯化,得到纯度97.02%的精肽0.203克,产品总收率20.35%。质谱检测的分子量结果及hplc检测的纯度结果如图1和图2所示。
[0073]
实施例5:细胞划痕愈合实验
[0074]
采用两种常用细胞,人类永生化角质形成上皮细胞(hacat)和人类皮肤成纤维细胞(hsf)。细胞培养于杜氏培养基(dmem,bi,israe)以及10%胎牛血清(fbs,bi,israe)和1%双抗(青霉素-链霉素,100u/ml)中,并置于含5%二氧化碳的培养箱(37℃)环境内培养。采用ez-pcr支原体污染检测试剂盒检测是否有支原体污染。采用24孔板培养hacat和hsf细胞(2.5
×
105个/孔),血清饥饿培养12-24小时,在形成的细胞单层上采用无菌移液管(axygen,usa)的尖端制作细胞机械划伤。用pbs轻轻洗两次去除漂浮的细胞,然后加入含有一定浓度的syn-ake-gc12无血清培养基(500/孔),继续培养一段时间(从0到24h),同时,以不含药物肽的相同体积的无血清培养基作为阴性对照。此外,另设置gc-12组(gc12的肽序为gllsginaewpc,使用常规固相多肽合成方法制备得到)、pal-gc12组、glyco-gc12组、cyclic-gc12组、同时各组以不含药物肽的相同体积的无血清培养基作为阴性对照。在显微镜(zeiss,germany)以不同的时间间隔观测划痕修复的图像。使用软件将细胞迁移活动表
示为划痕相对于整个区域的间隙百分比,以评估划痕的愈合率(使用imagej软件计算划痕的面积随着时间的变化)。
[0075]
结果显示:hacat细胞在生理盐水(saline)对照组中12h和24h内的愈合率分别为18%和37%。100nmmol gc12处理组在12h和24h的愈合率分别分别为28%和56%,100nmmol cyclic-gc12处理组在12h和24h的愈合率分别分别为24%和50%,100nmol/l glyco-gc12处理组在12h和24h的愈合率分别分别为24%和52%,100nmol/lpal-gc12处理组在12h和24h的愈合率分别分别为28%和55%,100nmol/l syn-ake-gc12处理组在12h和24h的愈合率分别分别为32%和66%,pal-gc12、syn-ake-gc12显著高于对照组。
[0076]
细胞划痕愈合实验试验结果均表明,本发明所述的皮肤创伤修复肽pal-gc12相比较gc12具有非常接近的划痕的修复率,而皮肤创伤修复肽syn-ake-gc12效果明显优于gc12。
[0077]
实施例6:小鼠创伤修复
[0078]
购置成年雄性昆明种小鼠(22-25g),给小鼠提供必需的食物和水,给予12h光照以及12h黑暗。经过7天时间的适应后,将小鼠随机分成6组,每组8只,制作全层皮肤创伤模型,具体步骤如下:首先给小鼠腹腔注射1%的戊巴比妥钠(0.1ml/20g)麻醉小鼠,然后将小鼠背部毛剃除干净,并用75%的酒精消毒,最后在小鼠背部两侧用凿孔器凿出两个大小对称的孔,约8mm
×
8mm大小。术后将小鼠放在加热器旁待其醒后放回饲养室正常饲养。每天2次上样,每孔每次上样约20μl,第1组小鼠背部一侧涂生理盐水(saline),另一侧涂gc12(100μg/ml);第2组小鼠背部一侧涂生理盐水(saline),另一侧涂syn-ake-gc12(100μg/ml);第3组小鼠背部一侧涂生理盐水(saline),另一侧涂pal-gc12(100μg/ml);第4组小鼠背部一侧涂生理盐水(saline),另一侧涂glyco-gc12(100μg/ml);第5组小鼠背部一侧涂生理盐水(saline),另一侧涂cyclic-gc12(100μg/ml);第6组小鼠背部一侧侧涂生理盐水(saline),另一侧涂康复新(kfx,10mg/ml)。持续给药时间为10天,每2天给小鼠背部创伤拍照,实验结束后最后通过软件计算创伤修复率(修复率=(原始创面面积-当前测量面积)
÷
原始创面面积
×
100%),其中对照saline修复率为50%;kfx修复率为65%;cyclic-gc12修复率为60%;gc12修复率为68%;glyco-gc12修复率为65%;pal-gc12修复率为70%;yn-ake-gc12修复率为85%。
[0079]
动物模型试验结果表明,本发明所述的pal-gc12、yn-ake-gc12相比较gc12具有更好的促创伤修复活性,其中皮肤创伤修复肽syn-ake-gc12促创伤修复活性更佳。
[0080]
以上所述仅为本发明的实施例,并非因此限制本发明的专利范围,凡是利用本发明的内容进行一些稍微的变更,或直接或间接运用在相关的技术领域,均同理包括在本发明的专利保护范围内。
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