专利名称:一种腐乳专用生产发酵剂及其制备方法
技术领域：
本发明是涉及ー种腐乳专用生产发酵剂及其制备方法，主要是应用于腐乳的生产，属于食品发酵技术领域：
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背景技术：
腐乳是我国的传统发酵豆制食品，它是ー种利用微生物法改变植物蛋白和脂肪风味的植物奶酪食品，由于和西方乳制干酪在加工エ艺和成熟机理上有许多相似之处，素有“东方奶酪”的美誉。发酵腐乳不含胆固醇，富含大豆多肽、大豆异黄酮、大豆皂苷和蛋白黑素等生理活性物质，具有降胆固醇、降血压、抗氧化和抗癌的功效。根据发酵腐乳优势微生物种类的差异，可将腐乳分为霉菌发酵型、酵母发酵型和细菌发酵型。通常细菌发酵腐乳前后酿造两次需要180天，传统腐乳生产周期过长导致占用了过多的土地、建筑、资金，远不能与食品产业的快速发展相适应。
发明内容
现有技术中有少数对传统エ艺进行改进的，例如，天津科技大学汪建明的公开号为CN101283772A的专利申请，涉及ー种发酵法快速制备低盐腐乳的方法，步骤是(I).将从大豆原料中所制备的豆乳，灭菌后冷却至室温；(2).接种霉菌进行发酵，发酵时间为24-48小吋；(3).再添加酶制剂以促进成熟，于40-55°C发酵培养，时间为5-7天；(4).当腐乳成熟后，经调配并采用适宜的包·装和杀菌方式即可得到低盐膏状或块状腐乳成品。江苏新中酿造有限责任公司申请的公开号为CN101647541 A的发明专利，其取高产纤溶酶的枯草芽孢杆菌作为发酵菌株，以腐乳生产的豆腐坯为发酵基质进行发酵，获得高产代谢产物纤溶酶；利用产纤溶酶活力高的枯草芽孢杆菌与毛霉混合发酵的同时，在腐乳后酵生产中添加蛋白酶制剂提高大豆蛋白的水解效率。虽然上述エ艺一定程度上缩短了腐乳的生产周期，但是周期缩短カ度仍然不能适应エ业化生产，即周期缩短不够，又由于后续酶制剂的添加，大大提高了产品成本，同时增加产品被污染机会，并且酶制剂例如蛋白酶剂量或类型使用不当，会使产品中产生过多的疏水性肽或氨基酸，改变先前发酵风味，给种产品带来后苦味，进而影响腐乳品质。另外，现有技术中腐乳生产发酵剂存在传代培养、扩大培养、使用不便、活力不稳定等缺陷，目前的冻干菌种多用于乳制品生产中，用于腐乳生产的国内外未见报道。而腐乳专用发酵剂的研制是解决传统发酵食品发酵周期长的有效途径之一，也是获得更好风味、具有更多风味物质产品的有效途径之一。提供一种适于腐乳エ业化生产的专用发酵剂是食品工作者急需解决的问题。
本发明提供一种细菌型的腐乳生产专用发酵剂，同时提供专用发酵剂的制备方法，与传统的自然发酵生产方式相比，利用本发明成果可以有效的避免细菌腐乳发酵过程中由杂菌的污染和发酵剂菌株生产性能下降而导致产品质量不稳定的技术难题，同时不需要使用蛋白酶进行后续催化成熟，更加有效缩短发酵周期，提高了成品的营养成分，风味更独特，质地更细腻、味道醇厚，后味鲜美绵长，该发酵剂实用性强、可操作性强、产品品质稳定。
申请人:在研究过程中意外发现，藤黄微球菌、克氏库克菌、肉葡萄球菌、肠膜明串珠菌、枯草芽孢杆菌和嗜盐四联球菌六株细菌按特定比例3:2:1:1:2:1组合后用于腐乳制作，各菌株产生相互协同作用，发酵能力显著提高，风味得到明显改善，带来了预料不到的技术效果。藤黄微球菌、克氏库克菌、肉葡萄球菌、肠膜明串珠菌、枯草芽孢杆菌和嗜盐四联球菌实际上是腐乳不同发酵过程中的优势菌株。需要特别说明:本发明的各菌株可以按常规方法从腐乳中获取，也可以从市场上购买获得，可以是任意的获得方式。
本发明的目的是通过以下技术措施来实现的:腐乳专用的细菌发酵型生产发酵齐Li，由藤黄微球菌克氏库克菌docaria Arisi/aae)、肉葡萄球菌{Staphylococcus肠膜明串珠菌(Zewcofliosioc mesenteroides),枯草芽抱杆菌{Bacillus 和嗜盐四联球菌六株细菌组成,其中，按活菌数计，其配比为藤黄微球菌:克氏库克菌:肉葡萄球菌:肠膜明串珠菌:枯草芽孢杆菌:嗜盐四联球菌=3: 2:1:1: 2:1。
按活菌数计，通常采用下述方法获得:用TSB培养基分别对上述菌株的冻干粉进行菌落计数，得出每株菌的活菌数(CFU/g)，然后按活菌数比折算成菌粉的重量比进行混合。生产接种时，如冻干粉中的活菌数为5X 10nCFU/g，将Ig菌粉加入到5X IO6g的无菌水中即可达到105CFU/mL的接种浓度，或用其它方法，只要达到适宜接种浓度即可。当然，也可以用任意的形态的六株菌按活菌数混合。
该腐乳专用的细菌发酵型生产发酵剂，其经过真空冷冻干燥获得，为冻干粉状。
所得发酵剂中活菌数大于2.0X 10nCFU/g冻干粉。
腐乳专用的细菌发酵型生产发酵剂的制备方法，首先将藤黄微球菌、克氏库克菌、肉葡萄球菌、肠膜明串珠菌、枯草芽孢杆菌和嗜盐四联球菌分别用培养基进行高密度培养，培养基初始PH为7.0-7.2，培养温度为30°C _37°C，其中藤黄微球菌、枯草芽孢杆菌和克氏库克菌都分别发酵24-26h，肉葡萄球菌、肠膜明串珠菌和嗜盐四联球菌分别发酵36-38h ；六株菌发酵结束后将培养发酵物温度冷却至10°C，用连续式离心机分别对每ー株菌的发酵液进行浓缩，供料量为10L/min，离心速度为1000-12000rpm，将菌泥与冻干保护剂以1:1-1: 1.5的质量比混合，二者混合后置于-40°C冷冻机的冷冻盘中预冻至制品中心温度为_35°C ”，接着将预冻后制品的温度由-35 °C升至-20°C，升温速率为0.5 °C /min,当制品的温度达到_20°C时，在此温度下干燥16h，随后将制品温度升至20°C，在此温度下继续干燥5h，冷冻干燥过程中真空度保持在0.01-0.005MPa之间，最后阶段在0.001-0.003MPa真空度下保持2h，得冻干粉，以活菌计数，将藤黄微球菌:克氏库克菌:肉葡萄球菌:肠膜明串珠菌:枯草芽孢杆菌:嗜盐四联球菌按照3:2:1:1:2:1的比例对菌株冻干粉进行混合，用三维无菌混料机将六株菌的冻干粉混合均匀，即得腐乳专用生产发酵剂。
优选培养基初始pH为7.0,培养温度为30°C，其中藤黄微球菌、枯草芽孢杆菌和克氏库克菌都分别发酵24h，肉葡萄球菌、肠膜明串珠菌和嗜盐四联球菌分别发酵36h。
培养基的配方为:大豆酪蛋白消化培养基50g、K2HPO4 7g、KH2P043g、MgSO4 lg、酵母粉7g、脱脂乳粉100g，加入蒸馏水溶解并用蒸馏水定容至lOOOmL，115°C灭菌15min ;保护剂的制备过程为:取脱脂乳粉100g、海藻糖15g、蔗糖Sg和甘油3g，加入蒸馏水溶解并定容至lOOOmL, IlCTC灭菌 15 min。[0013]腐乳专用生产发酵剂的使用方法，生产时将腐乳专用生产发酵剂冻干粉用无菌水进行稀释，得浓度为105CFU/mL的液体菌种，喷淋接种，接种量以体积(mL)质量(g)百分比计，为腐乳质量的0.3-0.5%，发酵剂发酵温度为30°C。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果。
(1)本发明创造性的将藤黄微球菌、克氏库克菌、肉葡萄球菌、肠膜明串珠菌、枯草芽孢杆菌和嗜盐四联球菌六株细菌按照特定比例3:2:1:1:2:1组合，用于腐乳专用生产发酵剂，有效缩短周期至少60-70天，明显提高产品质地和风味。使用该发酵剂生产腐乳，省略传统エ艺中后续添加蛋白酶步骤，降低成本、減少污染。在腐乳的前酵过程中藤黄微球菌、克氏库克菌和肉葡萄球菌生长的速度较快，将蛋白质和脂肪分别降解为分子量较大的疏水肽和少量的游离氨基酸及游离脂肪酸，在腐乳后发酵过程中肠膜明串珠菌产生具有水果香味的酷类物质，枯草芽孢杆菌和嗜盐四联球菌则可以降解具有较大分子量的疏水肽和蛋白质生成较小分子量的亲水肽和游离氨基酸，并进一歩降解脂肪生成游离脂肪酸，而分子量较小的亲水肽和游离氨基酸则是良好的风味物质，各菌前后协同发酵。
(2)本发明发酵剂制备エ艺简单，成本低，所得发酵剂中活菌数大于
2.0X 10nCFU/g，具有发酵活力高、用量少和且发酵效果好的优点，在赋予腐乳良好食用品质的基础上，使腐乳的发酵周期缩短了至少60天，节约了成本。
(3)变温干燥过程在较短时间内把制品中的水分降到目标水平，较大程度上降低菌体细胞的死亡率，生产过程中使用量明显降低，制备成冻干形式的发酵剂用于腐乳，避免传统生产发酵剂制作过程容易造成杂菌污染、菌株生产能力下降、产品质量不稳定的缺陷，更适于规模化生产。由本发明的腐乳专用发酵剂按常规方法(发酵后不需要额外添加蛋白酶)制得的腐乳与传统方法获得的腐乳相比，产品风味物质更丰富，风味更独特，质地更细腻、味道醇厚， 后味鲜美绵长。
(4)本发明对菌种进行高密度培养，对菌株进行高密度培养的目的是使发酵剂中的活菌数和发酵活力最大化，从而使最終的发酵剂产品中具有较高的活菌数和发酵活力，这样可以减少发酵剂的使用量，同时获得良好的发酵效果。
本发明所获得的发酵剂是各菌株、比例及エ艺參数的协同作用的结果，产生了预料不到的技术效果。用本发明发酵剂所生产的腐乳，其理化指标及微生物指标都符合国家标准。 具体实施方式
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实施例1
将藤黄微球菌、克氏库克菌、肉葡萄球菌、肠膜明串珠菌、枯草芽孢杆菌和嗜盐四联球菌分别用液体培养基按常规技术进行菌种活化，以活菌计数，将藤黄微球菌:克氏库克菌:肉葡萄球菌:肠膜明串珠菌:枯草芽孢杆菌:嗜盐四联球菌按照3:2:1:1:
2: 1的比例对液体菌种进行混合，混合均匀，即得腐乳专用生产发酵剂。
所述液体培养基的配方及制备方法为:大豆酪蛋白消化培养基50g、K2HPO4 7g、KH2P043g、MgSO4 lg、酵母粉7g、脱脂乳粉100g，加入蒸馏水溶解并用蒸馏水定容至IOOOmL,115。。灭菌 15min。
实施例2
将藤黄微球菌、克氏库克菌、肉葡萄球菌、肠膜明串珠菌、枯草芽孢杆菌和嗜盐四联球菌分别用培养基进行高密度培养，培养基初始pH为7.0，培养温度为30°C，其中藤黄微球菌、枯草芽孢杆菌和克氏库克菌都分别发酵24h，肉葡萄球菌、肠膜明串珠菌和嗜盐四联球菌分别发酵36h ;六株菌发酵结束后将培养发酵物温度冷却至10°C，用连续式离心机分别对每一株菌的发酵液进行浓缩，供料量为10L/min，离心速度为1000-12000rpm，将菌泥与冻干保护剂以1: 1-1: 1.5的质量比混合，二者混合后置于-40°C冷冻机的冷冻盘中预冻至制品中心温度为_35°C”，接着将预冻后制品的温度由-35°C升至_20°C，升温速率为0.50C /min,当制品的温度达到_20°C时，在此温度下干燥16h，随后将制品温度升至20°C，在此温度下继续干燥5h，冷冻干燥过程中真空度保持在0.0lMPa,最后阶段在0.0OlMPa真空度下保持2h，得冻干粉，以活菌计数，将藤黄微球菌:克氏库克菌:肉葡萄球菌:肠膜明串珠菌:枯草芽孢杆菌:嗜盐四联球菌按照3:2:1:1:2:1的比例对菌株冻干粉进行混合，用三维无菌混料机将六株菌的冻干粉混合均匀，即得腐乳专用生产发酵剂；所得发酵剂中活菌数大于2.0X 10nCFU/g。
其中所述培养基的配方为:大豆酪蛋白消化培养基50g、K2HPO4 7g、KH2P043g、MgSO4 lg、酵母粉7g、脱脂乳粉100g，加入蒸馏水溶解并用蒸馏水定容至lOOOmL，115°C灭菌15min。
所述保护剂的制备过程为:取脱脂乳粉100g、海藻糖15g、蔗糖Sg和甘油3g，加入蒸馏水溶解并定容至lOOOmL，110°C灭菌15min。
生产时将腐乳专用生产发酵剂冻干粉用无菌水进行稀释，得浓度为105CFU/mL的液体菌种，喷淋接种，接种量以体积(mL)质量(g)百分比计，为0.3-0.5%，发酵剂发酵温度为 30。。。
与传统或常规的自然发酵生产方式相比，使用该专用发酵剂，腐乳的发酵周期缩短了约60天。
实施例3`
将藤黄微球菌、克氏库克菌、肉葡萄球菌、肠膜明串珠菌、枯草芽孢杆菌和嗜盐四联球菌分别用培养基进行高密度培养，培养基初始PH为7.2，培养温度为37°C，其中藤黄微球菌、枯草芽孢杆菌和克氏库克菌都分别发酵6h，肉葡萄球菌、肠膜明串珠菌和嗜盐四联球菌分别发酵38h ;六株菌发酵结束后将培养发酵物温度冷却至10°C，用连续式离心机分别对每一株菌的发酵液进行浓缩，供料量为10L/min，离心速度为1000-12000rpm，将菌泥与冻干保护剂以1: 1-1: 1.5的质量比混合，二者混合后置于-40°C冷冻机的冷冻盘中预冻至制品中心温度为_35°C”，接着将预冻后制品的温度由-35°C升至_20°C，升温速率为
0.50C /min,当制品的温度达到_20°C时，在此温度下干燥16h，随后将制品温度升至20°C，在此温度下继续干燥5h，冷冻干燥过程中真空度保持在0.005 MPa,最后阶段在0.003MPa真空度下保持2h，得冻干粉，以活菌计数，将藤黄微球菌:克氏库克菌:肉葡萄球菌:肠膜明串珠菌:枯草芽孢杆菌:嗜盐四联球菌按照3:2:1:1:2:1的比例对菌株冻干粉进行混合，用三维无菌混料机将六株菌的冻干粉混合均匀，即得腐乳专用生产发酵剂；所得发酵剂中活菌数大于2.0X 10nCFU/g。
其中所述培养基的配方为:大豆酪蛋白消化培养基50g、K2HPO4 7g、KH2P043g、MgSO4 lg、酵母粉7g、脱脂乳粉100g，加入蒸馏水溶解并用蒸馏水定容至lOOOmL，115°C灭菌15min。[0033]所述保护剂的制备过程为:取脱脂乳粉100g、海藻糖15g、蔗糖Sg和甘油3g，加入蒸馏水溶解并定容至lOOOmL，110°C灭菌15min。
生产时将腐乳专用生产发酵剂冻干粉用无菌水进行稀释，得浓度为105CFU/mL的液体菌种，喷淋接种，接种量以体积(mL)质量(g)百分比计,为腐乳质量的0.3-0.5%，发酵剂发酵温度为30°C。
与传统或常规的自然发酵生产方式相比，使用该专用发酵剂，腐乳的发酵周期缩短了约70天， 生产过程中不需要额外添加酶制剂进行后续熟化。
权利要求
1.ー种腐乳专用生产发酵剂，由藤黄微球菌(#icrococcw5.Aziew1S )、克氏库克菌(^focaria kristinae)、肉葡萄球 HStaphylococcus carnosus ) > 肠膜明串珠菌(.Leuconostoc eseflieroiofes)、枯草芽抱杆菌 CfeciBw1S subtil is、和嗜盐四联球菌(Tetragenococcus halophilus)六株细菌组成,其中，按活菌数计,其配比为藤黄微球菌:克氏库克菌:肉葡萄球菌:肠膜明串珠菌:枯草芽孢杆菌:嗜盐四联球菌=3: 2: I:1:2:1。
2.权利要求
1所述的ー种腐乳专用生产发酵剂，其经过真空冷冻干燥获得，为冻干粉状。
3.如权利要求
1或2所述的ー种腐乳专用生产发酵剂，所得发酵剂中活菌数大于2.0X10nCFU/g 冻干粉。
4.权利要求
3所述的ー种腐乳专用生产发酵剂的制备方法，首先将藤黄微球菌、克氏库克菌、肉葡萄球菌、肠膜明串珠菌、枯草芽孢杆菌和嗜盐四联球菌分别用培养基进行高密度培养，培养基初始PH为7.0-7.2，培养温度为30°C _37°C，其中藤黄微球菌、枯草芽孢杆菌和克氏库克菌分别发酵24-26h，肉葡萄球菌、肠膜明串珠菌和嗜盐四联球菌分别发酵36-38h ;六株菌发酵结束后将培养发酵物温度冷却至10°C，用连续式离心机分别对每一株菌的发酵液进行浓缩，供料量为10L/min，离心速度为1000-12000rpm，将菌泥与冻干保护剂以1:1-1.5的质量比混合，二者混合后置于_40°C冷冻机的冷冻盘中预冻至制品中心温度为_35°C，接着将预冻后制品的温度由-35°C升至_20°C，升温速率为0.5°C /min,当制品的温度达到_20°C时，在此温度下干燥16h，随后将制品温度升至20°C，在此温度下继续干燥5h，冷冻干燥过程中真空度保持在0.01-0.005 MPa之间，最后在0.001-0.003MPa真空度下保持2h，得冻干粉；以活菌计数，将藤黄微球菌:克氏库克菌:肉葡萄球菌:肠膜明串珠菌:枯草芽孢杆菌:嗜·盐四联球菌按照3:2:1:1:2:1的比例对菌株冻干粉进行混合，用三维无菌混料机将六株菌的冻干粉混合均匀，即得腐乳专用生产发酵剂。
5.如权利要求
4所述的ー种腐乳专用生产发酵剂的制备方法，其中所述培养基的配方为:大豆酪蛋白消化培养基50g、K2HPO4 7g、KH2P043g、MgSO4 lg、酵母粉7g、脱脂乳粉100g，加入蒸馏水溶解并用蒸馏水定容至lOOOmL，115°C灭菌15min。
6.如权利要求
5所述的ー种腐乳专用生产发酵剂的制备方法，所述保护剂的制备过程为:取脱脂乳粉100g、海藻糖15g、蔗糖Sg和甘油3g，加入蒸馏水溶解并定容至IOOOmL,IlCTC 灭菌 15min。
7.如权利要求
6所述的ー种腐乳专用生产发酵剂的制备方法，其中培养基初始pH为7.0，培养温度为30°C，其中藤黄微球菌、枯草芽孢杆菌和克氏库克菌都分别发酵24h，肉葡萄球菌、肠膜明串珠菌和嗜盐四联球菌分别发酵36h。
8.权利要求
2所述的ー种腐乳专用生产发酵剂的使用方法，其特征在于，生产时将腐乳专用生产发酵剂冻干粉用无菌水进行稀释，得浓度为105CFU/mL的液体菌种，喷淋接种，接种量以体积(mL)/质量(g)百分比计，为0.3-0.5 mL/100 g，发酵剂发酵温度为30°C。
专利摘要
本发明涉及一种腐乳专用生产发酵剂及其制备方法，对发酵剂组成菌株，即藤黄微球菌、克氏库克菌、肉葡萄球菌、肠膜明串珠菌、枯草芽孢杆菌和嗜盐四联球菌，进行高密度培养、浓缩、冷冻干燥保护和冷冻干燥，得冻干菌粉，按特定3︰2︰1︰1︰2︰1比例混合，最终制成可以直接用于腐乳生产的发酵剂产品。本项发明工艺简单，所得发酵剂中活菌数大于2.0×1011CFU/g冻干粉，具有发酵活力高、用量少且发酵效果好的优点，使腐乳的发酵周期缩短了60-70天。该发酵剂也可以为液体。本项发明技术解决了传统自然发酵过程中容易造成杂菌污染和菌株生产能力下降而导致产品质量不稳定的问题，发酵过程中不需要额外添加蛋白酶，有效缩短了发酵周期，产品风味独特。
文档编号C12R1/265GKCN102827771 B发布类型授权 专利申请号CN 201210314770
公开日2013年9月4日 申请日期2012年8月30日
发明者冯镇, 石景春 申请人:东北农业大学导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan