培养基中（同上述MEA)。
[0018] 实施例2黄蜻幼虫肠道内生真菌Curvularia crepinii QTYC-I的鉴定 1、形态学鉴定 其生态学特征为：菌株的形态学特征及初步的鉴定依据《半知真菌鉴定手册》。如图 1所示，在MEA(配方：麦芽提取物20g，蔗糖20g，琼脂20g，蛋白胨lg，蒸馏水1L，pH 7. 0， 120°C灭菌20min)培养基平板上恒温28°C培养10天，直径可达70?80mm，菌丝初为浅绿 色，后逐渐转为墨绿色，短绒状，紧凑，菌落近圆形、平展，边缘不整齐。菌丝无色或淡褐色， 具隔膜，多分枝，宽2. 0?4. 1 μ m。分生孢子梗单生或簇生，产生于菌丝末端和中央细胞， 少分枝，顶端屈膝状弯曲，具隔膜，端部颜色稍浅，光滑，长可达160 μ m，宽2?7 μ m。分生孢 子顶侧生，卵形有弯曲或近纺锤形，色较深，端部细胞颜色渐浅，脐点不明显与文献（Ellett CW.Curvularia blight of Ophioglossum vulgatum[J].Mycologia，1989 :815-817)报道 相符。
[0019] 2、菌株分子生物学鉴定 菌株的DNA提取，PCR扩增及扩增产物的序列分析：将培养4d的新鲜菌体作为 DNA提取材料，采用新型快速真菌基因组DNA提取试剂盒（北京百泰克生物技术有限公 司）提取菌株基因组DNA，1%琼脂糖凝胶电泳检测纯度。以上述提取的基因组DNA为 模板，用引物 ITSl (forward) :ITS1 (5- 'TCCGTAGGT GAACCTGCGG-3,），ITS4(reverse): ITS4(5- 'TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）对供试菌株 rDNA 的 ITS 区域进行 PCR 扩增。反应 液体积 50yL，包括：38.8yL ddH20,4.0yL 10XPCRbuffer，4.0yL d NTPs，ITSl、ITS4 各 l.OyL，菌株基因组模板1.0yL，0. 2yL Taq DNA聚合酶。PCR反应程序：94°C预变性2min; 94°C变性lmin，55°C复性lmin，72°C延伸lmin，进行35个循环，最后72°C延伸5min，16°C保 存。PCR产物用I %琼脂糖凝胶测其纯度。PCR扩增产物经检测后送至上海生工生物工程有 限公司进行测序。
[0020] 将菌株 QTYC-1 的序列在 NCBI 数据库（http ://blast. ncbi. nlm. nih. gov/ Blast)中进行比对，其rDNA内转录间隔区（ITS)序列长度为561bp，与其亲缘关系较近的 Curvularia crepinii(Accession number :KF572448.1)序列相似性达 100%，序列比对覆 盖率达97%，应用MEGA5.0软件中Neighbor-Joining法构建系统发育树，如图2所示。结 合其形态学特征，由此确定QTYC-I菌株为Curvularia crepinii。
[0021] 实施例3黄蜻幼虫肠道内生真菌Curvularia crepinii QTYC-I发酵液及发酵液 提取物的制备 将新鲜的真菌Curvularia crepinii QTYC-1菌丝体块接种到含有ME培养基250mL 锥形瓶中（配方为：麦芽提取物20g、蔗糖20g、蛋白胨lg、蒸馏水1L，pH 7.0，120°C灭 菌20min)中，培养2?3天作为种子液；然后将种子液接种于含有ME培养基IOOOmL锥 形瓶中，并在180r/min，28 °C条件下进行扩大发酵，获得黄蜻幼虫肠道真菌Curvularia crepinii QTYC-I的液体培养物。在培养期间每隔一天在无菌条件下取黄蜻幼虫肠道真菌 Curvularia crepinii QTYC-I发酵液50mL经两层纱布过滤，分离菌丝体得其发酵液，并 于4°C保藏备用（共8天）；黄蜻幼虫肠道真菌Curvularia crepinii QTYC-I的液体培养 物培养第7天的发酵液用乙酸乙酯I : 1等体积萃取3?4次，合并萃取液，萃取液再经 45°C、负0. 1个大气压下浓缩得即得到深棕色膏状的提取物，即为黄蜻幼虫肠道内生真菌 Curvulariacrepinii QTYC-1 发酵液提取物。
[0022] 实施例4黄蜻幼虫肠道内生真菌Curvularia crepinii QTYC-I发酵液对稗草和 反枝苋幼根的抑制作用。
[0023] 取5mL分别经过1?8d培养的发酵液于铺有滤纸的培养皿中，以蒸馏水为空白对 照，阳性对照为lOOyg/mL 2,4-0(2,4-二氯苯氧乙酸）。选取露白的稗草或反枝苋种子150 粒（每皿10粒）放在滤纸上，每个处理重复3皿，然后置于28±0. 5°C、70%相对湿度、定时 光照（12h光照，12h黑暗）条件的人工气候培养箱内进行培养，4d后测量种子根长。以平均 根生长抑制率表示结果，平均根生长抑制率计算方法：抑制率（％) =[对照平均根长-处 理平均根长]/对照平均根长X100%。实验结果表明：黄蜻幼虫肠道内生真菌Curvularia crepinii QTYC-I发酵液对对稗草和反枝苋幼根均有较强的抑制作用，其中黄蜻幼虫肠道 内生真菌Curvularia crepinii QTYC-I培养4-8天的发酵液对反枝览抑制活性较好，尤 其是培养4-7天的发酵液抑制率均可达到90%以上；黄蜻幼虫肠道内生真菌Curvularia crepinii QTYC-I培养2-5天的发酵液对稗草抑制活性较好，其中培养3-4天的发酵液抑制 率能够达到95 %，与阳性对照活性相当。
[0024] 实施例5黄蜻幼虫肠道内生真菌Curvularia crepinii QTYC-I发酵液对盆栽稗 草抑制作用。
[0025] 将露白后的稗草或反枝苋种子播于温室花盆（CtlOcm)中，在出苗后第3天喷施黄 蜻幼虫肠道内生真菌Curvularia crepinii QTYC-I发酵液原液，蒸馈水为空白对照，阳性 对照为100 μ g/mL 2,4-D (2,4-二氯苯氧乙酸），每个处理设3个重复每个重复喷洒用量为 4mL，14d后观察幼苗受害程度，统计受害率，鲜重和干重。稗草受害级别有四个级别分别为 0级：全株正常；1级：叶或根变色；2级：全株1/2以上部分枯黄；3级：全株枯萎至死亡。受 害率（％) =Σ [(每皿各受害级别株数X级别V(每皿株数X最高级别）]XlOO ;干重 为新鲜植物体至于70°C烘箱，烘干至恒重为止。实验结果见表1，培养5?8天的发酵液对 稗草活性较好，其中第5天的发酵液能使稗草受害率达到70 %以上，第7?8天的发酵液可 使稗草干重明显减少，和阳性对照相当（干重均为LOmg)，同时也可明显降低稗草鲜重，达 到很好的抑制稗草生长的效果。
[0026] 表1黄蜻幼虫肠道内生真菌QTYC-I发酵液对盆栽稗草的抑制活性
【主权项】
1. 一种黄蜻幼虫肠道内生真菌，其分类命名Curvularia crepiniiQTYC-1，已保藏于中 国典型培养物保藏中心，其保藏编号是：CCTCC M2014308,保藏日期：2014年7月1日。
2. 根据权利要求1所述的黄蜻幼虫肠道内生真菌Curvularia crepiniiQTYC-1，其生 态学特征：在MEA(配方：麦芽提取物20g，蔗糖20g，琼脂20g，蛋白胨lg，蒸馏水lL，pH 7.0， 120°C灭菌20min)培养基平板上28°C恒温培养10天，直径可达70?80mm，菌丝初为浅绿 色，后逐渐转为墨绿色，短绒状，紧凑，菌落近圆形、平展，边缘不整齐；菌丝无色或淡褐色， 具隔膜，多分枝，宽2. 0?4. 1 y m ;分生孢子梗单生或簇生，产生于菌丝末端和中央细胞，少 分枝，顶端屈膝状弯曲，具隔膜，端部颜色稍浅，光滑，长可达160 y m，宽2?7 y m ;分生孢子 顶侧生，卵形有弯曲或近纺锤形，色较深，端部细胞颜色渐浅，脐点不明显。
3. 根据权利要求1所述的黄蜻幼虫肠道内生真菌Curvularia crepinii QTYC-1，其特 征在于：ITS和5. 8S rDNA片段561bp，喊基序列如下所不： AGGGCTACAGGCAGGTATGAGGCTGTACGCGGCTGTGCTCTCGGGCCAGTTTTGCGGAGGCTGAATTATTT ATTACCCTTGTCTTTTGCGCACTTGTTGTTTCCTGGGCGGGTTCGCCCGCCACCAGGACCACATCATAAACCTTTT TTATGCAGTTGCAATCAGCGTCAGTATAACAAATGTAAATCATTTACAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGG CATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATACGTAGTGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGC ACATTGCGCCCTTTGGTATTCCAAAGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTGTACCCTCAAGCTTTGCTTGGTGTTGG GCGTTTTTTGTCTTTGGTTGCCAAAGACTCGCCTTAAAAGGATTGGCAGCCGGCCTACTGGTTTCGCAGCGCAGCAC ATTTTTGCGCTTGCAATCAGCAAAAGAGGACGGCAATCCATCAAGACTCCTTCTCACGTTTGACCTCGGATCAGGTA GGGATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAA 根据权利要求1所述的黄蜻幼虫肠道内生真菌Curvularia crepinii QTYC-1在抑制 杂草生长中的应用。
4. 一种杂草生防菌剂及杀菌剂，该生防菌剂及杀菌剂采用以下方法制备：黄蜻幼虫肠 道内生真菌Curvularia crepinii QTYC-1接种于ME培养基（配方为：麦芽提取物20g、鹿 糖20g、蛋白胨lg，蒸馏水lL，pH 7. 0,120°C灭20min)，温度28?30°C，摇床转数180r/min 培养，得到的发酵液即为杂草生防菌剂，发酵液乙酸乙酯提取物为杀菌剂。
5. 根据权利要求5所述的一种杂草生防菌剂及杀菌剂，其特征在于：所述杂草生防菌 剂在抑制反枝苋和稗草生长中的应用。
6. 根据权利要求5所述的一种杂草生防菌剂及杀菌剂，其特征在于：所述的杀菌剂在 防治杨树溃疡病菌、番茄早疫病菌、苦瓜枯萎病菌、黄瓜枯萎病菌和小麦赤霉病菌中的应 用。
7. 根据权利要求5所述的一种杂草生防菌剂及杀菌剂，其特征在于：所述的杀菌剂在 防治杨树溃疡病菌、番茄早疫病菌、苦瓜枯萎病菌、黄瓜枯萎病菌和小麦赤霉病菌中的应 用。
【专利摘要】本发明公开了一种黄蜻幼虫肠道内生真菌Curvularia crepinii及其应用，黄蜻幼虫肠道内生真菌Curvularia crepinii QTYC-1发酵液可显著抑制稗草和反枝苋幼根的生长，其最大抑制率分别可达95.0％和90.1％，并可使经喷施发酵液的稗草幼苗的受害率达到71.1％。发酵液的乙酸乙酯提取物对稗草和反枝苋幼根具有很好的抑制效果，在100μg/mL的浓度条件下，粗提物对稗草和反枝苋的抑制活性分别为56.8％和71.2％，且在该浓度条件下其对一些常见农作物具有很好的安全性，其抑制率均低于35％，与阳性对照放线菌酮的活性相当，为开发新的除草剂和抗菌药物提供了很好的候选药物。CCTCC M 201430820140701
【IPC分类】A01N63-04, C12R1-645, A01P3-00, A01P13-02, C12N1-14
【公开号】CN104531534
【申请号】CN201410447245
【发明人】张应烙, 邵明伟, 余文华
【申请人】浙江师范大学
【公开日】2015年4月22日
【申请日】2014年8月29日