一种用于细胞电穿孔的微针尖阵列芯片及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物医用材料及微加工技术领域，具体涉及一种微针尖阵列芯片，尤其涉及一种用于细胞电穿孔的微针尖阵列芯片及其在增加免疫应答效应中的应用。
【背景技术】
[0002]细胞膜是包围在细胞外周的一层薄膜，是细胞与外界进行选择性物质交换的通透性屏障。细胞膜使细胞成为一个独立的生命单位，并拥有一个相对稳定的内环境。细胞可以通过细胞膜从周围环境摄取养料，排出代谢产物，使物质的转运达到平衡状态。所以，细胞膜的基本功能就是维持细胞内微环境的相对稳定并有选择地与外界环境进行物质交换。
[0003]目前的研宄发现，如果对细胞施加一定强度的电刺激并持续一段时间，就可以诱导细胞膜上产生一些微孔，使细胞的通透性增强，所谓细胞电穿孔(Electroporat1n)就是指细胞在外加脉冲电场的作用下，细胞膜脂双层上形成瞬时微孔的生物物理过程(WaverJ.C.“Electroporat1n:A dramatic, nothermal electric field phenomenon，，，1992年)。当细胞膜发生电穿孔时，其通透性和膜电导会瞬时增大，使亲水分子、DNA、蛋白质、病毒颗粒、药物颗粒等正常情况下不能通过细胞膜的分子得以进入细胞。在短时间内撤除电刺激后，细胞膜可以自我恢复，重新成为选择性通透屏障。与传统的化学穿孔和病毒穿孔相比，由于电穿孔具有无化学污染、不会对细胞造成永久性损伤、效率较高等优点，在生物物理学、分子生物学、临床医学等领域有着广阔的应用前景。
[0004]随着技术的发展，电穿孔技术已经应用于诸多研宄领域。不仅在实验室中被用于向体外培养的细胞内部输运大分子，还被用于向生物组织内的细胞内部输运核酸。如果向生物组织内的细胞内输运的核酸是DNA，并且该种DNA成功表达出其编码的蛋白，那这种核酸输运的过程就被称为细胞转染。经由高效的细胞转染而产生的蛋白可以引起生物组织的免疫应答，该种免疫应答的效率和细胞转染的效率正相关。因此，与直接向机体内注射DNA相比，电穿孔技术可以有效增强该种DNA所编码的蛋白引起的免疫应答反应，从而有助于DNA疫苗等领域的研宄。
[0005]关于对细胞，特别是生物组织中的细胞进行电穿孔目前主要有以下两类技术:
[0006](I)向生物组织内部插入两根或多根针状电极，以此在生物组织中产生相应的电场，从而使处于电极之间的细胞发生穿孔(如US7922709B2，US5389069A1，US6233482B1，CN1345607A，CN1248923A)。这类方法有三个较大的缺陷:首先，针状电极对组织的穿透会对生物组织产生较大的物理损伤，针状电极越多，损伤就越严重；其次，针状电极所产生的电场是不均匀的，会造成有些区域的细胞因电场强度不够而未能被电穿孔，而同时有些区域的细胞却因为电场强度过大而死亡；最后，因为现有机械加工技术的限制，针状电极之间的间距相对较大，通常在毫米级别，造成电穿孔需要的电压较高，通常在数百伏特量级，上述三个缺陷决定了这种方式无法向大面积的组织输运核酸，只能用于有限的科研场合；
[0007](2)通过在生物组织表面放置各种形状的平面电极，以此形成相应的电场，从而使处于电极之下的细胞发生电穿孔(us 6775569B2)。这是一类非侵入性的方法，这种方法解决了上述第一种方法中对生物组织的物理伤害问题，但这种方法的致命缺陷在于:因为要穿透皮肤的阻隔，在皮肤表面所需的电场要大于组织内部的电场，同时目前的平面电极尺度都较大(数毫米)，上述两方面的缺陷意味着需要数百伏甚至上千伏的电压才能完成电穿孔过程，而如此高的电压对生物组织来说是致命的。
【发明内容】
[0008]为了克服上述现有技术中的不足，本发明的目的之一是提供了一种微针尖阵列芯片，可以穿透高电阻率的皮肤，直接在皮下产生电场，从而完成对细胞的电穿孔。同时，也可以将体外培养的细胞直接放置于该芯片上，该芯片产生的电场同样可以对这些细胞进行电穿孔；本发明的另一个目的是提供一种利用微针尖阵列芯片对生物组织进行电穿孔，高效转染组织细胞，从而增强组织免疫应答效应的方法。
[0009]为了达到此发明目的，本发明采用以下技术方案:
[0010]第一方面，本发明提供了一种用于细胞电穿孔的微针尖阵列芯片，其包括:基板，设置在基板上的多个微针尖构成的阵列，以及将所述的微针尖连接在一起的连接电极。
[0011]本发明中所述的基板，可以是由绝缘材料制成，也可以是在非绝缘材料表层覆盖绝缘材料而制成。
[0012]在本发明中细胞电穿孔是公知的，包括细胞膜脂双层的破裂，导致在膜上形成暂时性的微孔，允许外源性分子通过扩散进入细胞。
[0013]本发明中所述的微针尖阵列是成对布置的，每对微针尖包括相对设置的阴极和阳极。
[0014]本发明中所述的微针尖阵列是由有较高硬度的材料制成，例如硅或者玻璃。
[0015]本发明中所述的微针尖阵列中针尖的数量为10-250个，例如可以是10个、20个、40 个、50 个、60 个、80 个、90 个、100 个、120 个、150 个、180 个、2000 个、220 个、250 个。
[0016]本发明中所述的微针尖阵列中针尖的形状为圆锥形或底面为四边形的尖锥形。
[0017]本发明中所述的微针尖阵列中针尖的高度为300微米-1毫米，例如可以是300 μ m、350 μ m、400 μ m、450 μ m、500 μ m、550 μ m、600 μ m、650 μ m、700 μ m、750 μ m、800 μ m、850 μ m、900 μ m、950 μ m、1000 μ m。
[0018]本发明中所述的微针尖阵列中针尖的间距为100-400微米，例如可以是100 μπκ120 μ m、150 μ m、180 μ m、200 μ m、220 μ m、250 μ m、280 μ m、300 μ m、320 μ m、350 μ m、380 μ m、400 μ m0
[0019]本发明中所述连接电极是由适当的导电材料或这些材料的复合物来制成。优选材料为生物兼容性好的材料，例如金、钛和掺有银离子的PDMS (聚二甲基硅氧烷)。当采用多种材料时(例如一种导电材料(例如金)镀在另一种导电材料(例如铜)上)，最外层的优选材料为生物兼容性好的材料。
[0020]本发明中所述连接电极是成对布置的，每对微针尖包括相对设置的阴极和阳极。
[0021]本发明中所述连接电极材料为金，并且连接电极的厚度大于5微米，宽度大于100微米。
[0022]第二方面，本发明还提供了一种利用本发明第一方面所述的微针尖阵列芯片增强免疫应答的方法，该方法包括利用所述的微针尖阵列芯片对生物组织进行电穿孔，转染组织细胞，从而增强组织免疫应答效应。
[0023]作为优选的技术方案，所述的方法具体包括以下步骤:
[0024]首先向皮下组织中注射适量的DNA，再将所述的微针尖阵列芯片贴附在皮肤表面，利用所述的微针尖阵列芯片穿透皮肤的角质层，然后对皮下组织施加电场以使DNA进入皮下组织细胞内部并表达出所述DNA编码的蛋白，从而增强生物组织对所述蛋白的免疫应答效应。
[0025]本发明中所述的皮下组织为皮下腺体或肌肉。
[0026]本发明中所述微针尖阵列芯片的贴附方式为直接贴附于皮肤表层。
[0027]本发明中所述的电场强度为200V/cm至1000V/cm，其脉冲宽度为10?200毫秒，脉冲间隔I?30秒；其中电场强度可以是200V/cm、250V/cm、300V/cm、350V/cm、400V/cm、450V/cm、500V/cm、550V/cm、600V/cm、650V/cm、700V/cm、750V/cm、800V/cm、850V/cm、900V/cm、950V/cm、1000V/cm ;脉冲宽度可以是10毫秒、20毫秒、50毫秒、100毫秒、120毫秒、150毫秒、180毫秒、200毫秒；脉冲间隔可以是I秒、3秒、5秒、8秒、10秒、13秒、15秒、18秒、20秒、23秒、25秒、28秒、30秒。
[0028]与现有技术相比，本发明至少具有以下有益效果:
[0029](I)降低了对组织的物理损伤:本发明提出的微针尖高度为300微米至I毫米，仅仅穿透皮肤组织，对皮下肌肉组织完全无损伤；由于微针