任选的药学可接 受载体、赋形剂或稳定剂（《Remington'sPharmaceuticalSciences》，第 16 版，Osol,A. 编，1980)混合来制备治疗用配制剂，供贮存。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在所采用的 剂量和浓度对接受者是无毒的，而且包括缓冲剂，诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗 氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂（诸如氯化十八烷基二甲基苄基铵；氯化己烷双 胺；苯扎氯铵、苯索氯铵；酚、丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烷基酯，诸如对羟基苯甲酸甲 酯或丙酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇和间甲酚）；低分子量（少于约10个残基） 多肽；蛋白质，诸如血清清蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮； 氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水 化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如EDTA;糖类，诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或 山梨醇；成盐相反离子，诸如钠；金属复合物（例如Zn-蛋白质复合物）和/或非离子表面 活性剂，诸如TWEEN?、PLUR0NICS?或聚乙二醇（PEG)。
[0158] 还可以用脂转染或脂质体将多肽、抗体、或抗体片段投递到细胞中。在使用抗 体片段时，优选特异性结合靶蛋白质的结合结构域的最小片段。例如，根据抗体的可变 区序列，可以设计保留与靶蛋白质序列结合能力的肽分子。此类肽可以化学合成和/ 或通过重组DNA技术生成（参见例如Marascoetal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA90， 7889-7893[1993])。
[0159] 本文中的配制剂还可含有超过一种所治疗具体适应症所必需的活性化合物，优选 活性互补且彼此没有不利影响的那些。合适的是，此类分子以对于预定目的有效的量组合 存在。
[0160] 活性分子还可包载入例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊（例如分 别是羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚（甲基丙烯酸甲酯）微胶囊）、胶状药物投递系统（例 如脂质体、清蛋白微球体、微乳剂、纳米颗粒和纳米胶囊）、或粗滴乳状液。此类技术披露于 例如《Remington，sPharmaceuticalSciences》，第 16 版，Osol,A?编，1980。
[0161] 用于体内施用的配制剂必须是无菌的。这可容易的通过使用无菌滤膜过滤来实 现。
[0162] 可制备持续释放制剂。持续释放制剂的合适例子包括含有抗体的固体疏水性聚合 物半透性基质，该基质以定型产品的形式存在，例如薄膜或微胶囊。持续释放基质的例子包 括聚酯、水凝胶（例如聚（2-羟乙基_甲基丙烯酸酯）或聚（乙烯醇））、聚交酯（美国专利 No. 3, 773, 919)、L-谷氨酸和Y_乙基-L-谷氨酸酯的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯、 可降解的乳酸-乙醇酸共聚物诸如LUPRONDEPOT?(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞 林构成的可注射微球体）及聚-D-(-)-3-羟基丁酸。虽然诸如乙烯-乙酸乙烯和乳酸-乙 醇酸等聚合物能够释放分子100天以上，但是某些水凝胶释放蛋白质的时间较短。当胶囊 化抗体在体内长时间维持时，它们可能由于暴露于37°C的潮湿环境而变性或聚集，导致生 物学活性损失和免疫原性可能改变。可根据相关机制来设计合理的稳定化策略。例如，如 果发现聚集机制是经由硫醇-二硫化物互换而形成分子间S-S键，那么可通过修饰巯基、由 酸性溶液冻干、控制湿度、采用适宜添加剂和开发特定的聚合物基质组合物来实现稳定化。
[0163] 治疗方法
[0164] 作为它们抑制补体活化，特别是旁路补体途径的能力的结果，本发明的CRIg变体 在补体相关疾病和病理状况的预防和/或治疗中找到应用。此类疾病和状况包括但不限于 补体相关的，炎性的和自身免疫的疾病。
[0165] 早先已经列出了本文中的CRIg变体所能针对的补体相关的，炎性的和免疫相关 的疾病和病症的具体例子。
[0166] 以下非限制性实施例例示了本发明的更多详情。
[0167] 实施例1:亲和力成熟的CRIg变体的制备
[0168] 材料和方法
[0169]材料：
[0170] 材料一酶和M13-K07 辅助菌体（NewEnglandBiolabs);Maxisorp免疫板 (Nunc.Roskilde，Denmark) ;96 孔U底聚丙烯板（COSTAR;产品目录 #3365) ;96 孔平底，非 结合板（NUNC;产品目录#269620);辣根过氧化物酶/抗M13抗体偶联物（Pharmacia); 3, 3'，5, 5' -四甲基-联苯胺，H2O2过氧化物酶底物（TEB)(KirkegaardandPerry Laboratories，Inc);大肠杆菌XLl-blue和大肠杆菌BL21 (DE3) (Stratagene);牛血 清清蛋白（BSA)和Tween20 (Sigma) ;Ni_NTA琼脂糖（Qiagen);家兔RBC(Colorado SerumCompany;产品目录 #CS1081);明胶Veronal缓冲液（GVB) [100mT,Veronal缓冲液 (BioWhittaker;产品目录 #12-624E);明胶（牛皮肤B型；SIGMA;产品目录#69391-1006); Clq消减的血清（CompTech;产品目录#八300) ;fH蛋白（ComplementTechnology;产品目录 #A137);抗FLAG-HRP，mAb，在 50% 甘油中，Sigma产品目录#八-85921.lmg/mL
[0171] 噬菌体展示CRIg文库的构建
[0172] 将编码CRIg的DNA片段连接入经XhoI和SpeI消化的噬菌粒载体（P3DvlzPDZ-gD) (Kunkeletal.，MethodsEnzymol. 154:367-382 (1987))，作为野生型对照和设计CRIg变 体的模板。然后，自CJ239大肠杆菌细胞（Kunkeletal.，1987,见上文）制备在每个靶 定残基处具有TAA终止密码子的模板，供随机化用。使用一种软随机化策略来进行CRIg变 体选择，其中通过使用定位寡核苷酸策略用偏向野生型核苷酸的70-10-10-10碱基混合物 在选定位置处引入大约50%的突变率。在文库设计中：5 = 50%A，10%G，10%C和10% T;6 = 50%G，10%A，10%C和 10%T;7 = 50%C，10%A，10%G和 10%T;8 = 50%T， 10%A，10%G和 10%C0
[0173] 设计了5个文库。
[0174] 文库 1 中的BCR1，ATCCTGGAAGTGCAA656(SEQIDN0:7)AGTGTAACAGGACCT 866(SEQIDNO:8)555GGGGATGTGAATCTT(SEQIDNO:9)；
[0175]文库 2 中的BCR2,AAGTGGCTGGTACAA768(SEQIDNO:10) 668TCA657 775 688 577ATCTTT(SEQIDNO:11)786CGT657TCTTCTGGAGACCAT(SEQIDNO:12)；
[0176]文库3 中的BCR3，TTTCTACGTGACTCT(SEQIDN0:13)877 668 657757 588 756 756 678 555TAC756GGCCGCCTGCATGTVG(SEQIDNO:14)；
[0177]文库4 中的BCR4,CMTTGAGCACCCTG(SEQIDNO: 15)656 586657GAC768AGC CACTACACGTGT656(SEQIDNO:16)GTCACCTGG756(SEQIDNO:17)ACTCCTGATGGC AAC(SEQIDNO:18)；
[0178]文库 5 中的BCR5,ACTCCTGATGGCAAC756(SEQIDNO:19)GTC688 768 657 555 ATTACTGAGCTCCGT(SEQIDNO:20)。
[0179] 通过使用适宜密码子来引入相应突变，如上所述进行定点诱变以进行点突变，并 通过序列来确认正确的克隆。
[0180] 文库分选和筛选以选择CRIg变体：
[0181] 将Maxisorp免疫板用C3b(5yg/ml)于4°C包被过夜并用磷酸盐缓冲盐水（PBS) 和0.05% (w/v)牛血清清蛋白（BSA)于室温封闭1小时。将噬菌体文库添加至C3b包被 的板并于室温温育3小时。将板清洗10次并用50mMHCl洗脱结合的噬菌体并用等体积的 LOMTris碱（pH7. 5)中和。通过经大肠杆菌XLl-blue传代来扩增回收的噬菌体并用于别 的结合选择轮次。5轮后，我们自每个文库选出12个克隆并以96孔形式在500y1补充有 羧苄青霉素和M13-K07辅助噬菌体的2YT肉汤中培养它们。按照设计的位置在经C3b、抗 gD、BSA和无关蛋白质包被的384孔板中直接添加2倍连续稀释的培养物上清液。测量结 合亲和力以评估给出的噬菌体浓度，比抗gD显著更高地结合C3b但不结合BSA和无关蛋白 质。我们将噬菌体浓度固定，以相同的形式自每个文库筛选出约200个克隆，并自每个文库 选出24-48个显示出显著结合C3b胜过抗gD的克隆，然后对它们测序以进行分析。
[0182] 竞争性噬菌体ELISA
[0183] 为了评估结合亲和力，使用一种改良的噬菌体ELISA。将96孔微量滴定板用含 2ug/ml3Cb的50mM碳酸盐缓冲液（pH9. 6)于4C包被过夜。然后将板用PBS，0. 5%BSA于 室温封闭1小时。将展示CRIg变体的噬菌体在PBT缓冲液中连续稀释，并测量结合以评估 给出饱和时的信号50%的噬菌体浓度。固定亚饱和浓度的噬菌体并与C3b的连续稀释液一 起预温育2小时，然后将混合物转移至经C3b包被的测定板。温育15分钟后，将板用PBS， 0.05%Tween20清洗，并与辣根过氧化物酶/抗M13抗体偶联物（在PBT缓冲液中1:5000 稀释）一起温育30分钟。将板清洗，用TMB底物显色，用I.OMH3PO4淬灭，并于450nm处以 分光光度法读数。作为导致噬菌粒结合半最大值的竞争C3b的浓度来计算亲和力（Ic50)。
[0184] 蛋白质纯化
[0185] 将包含表达质粒的大肠杆菌BL21 (DE3)的单菌落接种入30mL补充有50yg/mL羧 苄青霉素的LB培养基（LB/carb培养基）并于37°C培养过夜。收获细菌，清洗，重悬浮，并 接种入500mLLB/carb培养基。将培养物于37°C培养至对数生长中期（A_=0.8)。用 0. 4mM异丙基1-硫一D-吡喃半乳糖甘来诱导蛋白质表达，并将培养物于30°C培养24小时。 通过以4000g离心15分钟来沉淀细菌，用磷酸盐缓冲盐水（PBS)清洗2次，并于-80°C冷冻 8小时。将沉淀物重悬浮于50mLPBS，并通过穿过微流化仪加工或声处理设备来溶解细胞。 用2mlNI-NTA琼脂糖和凝胶过滤来纯化CRIg变体蛋白。
[0186] mutCRIg-huFc液相竞争性结合ELISA :
[0187]将huCRIg(L)-LFH在PBS，pH7. 4 中稀释至 2ug/mL，并通过于 4°C温育过夜（16-18 小时）（25ul/孔）来包被到Maxisorp384孔平底板（Nunc，Neptune，NJ)上。将板在清洗缓 冲液（PBS，pH7. 4,0. 05%Tween20)中清洗3次，并将50ul/孔封闭缓冲液（PBS，pH7. 4， 0. 5%BSA)添加至每个孔。让板封闭1-3小时；这次和所有后续温育在定轨摇床上于室温实 施。在封闭步骤期间，将C3b(在Genentech纯化）在测定缓冲液（PBSpH7. 4,0. 5%BSA， 0? 05%Tween-20)中稀释至20nM，并将mutCRIg-huFc分子在测定缓冲液中连续稀释，浓度 范围为20, 000 - 0. 34nM。然后将C3b与mutCRIg-huFc分子1:1混合并容许预温育0. 5-1 小时。将经过封闭的板清洗3次（如上所述），并将C3b:mutCRIg-huFc复合物添加至反应 板（25ul/孔）。温育1-2小时后，将ELISA板清洗3次（如上所述），并通过添加抗人C3b 抗体（克隆 5F202，USBiological，Swampscott，MA;600ng/mL，25ul/孔）来检测板结合的 C3b。将板温育1-2小时并清洗（如上所述）。然后添加（25ul/孔）1:2, 000稀释的HRP偶 联的抗鼠FeIgG(JacksonImmunoResearch，WestGrove，PA)，并将板温育 1-2 小时。最后 一次清洗后，将25ul/孔TMB底物（Kirkegaard&PerryLaboratories，Gaithersburg，MD)添 加至ELISA板。大约8分钟后通过添加25ul/孔I.OM磷酸来终止显色。使用SpectraMax 250 微量滴定板阅读仪（MolecularDevices，Sunnyvale，CA)测定 450nm和 650nm处的吸 光度。
[0188] 补体活化测定法：
[0189] 使用Wieslab?补体系统旁路途径试剂盒（AlpcoDiagnostics，Salem，NH)来评估 mutCRIg-Fc抑制补体活化的能力。以想要的终浓度2倍制备连续稀释的mutCRIg-Fc(400 至 0? 2nM)和Clq缺陷的人血清（5 % )(ComplementTechnology，Tyler，TX)，1:1 混合，并在 定轨摇床上以300RPM预温育5分钟，之后添加至经LPS包被的ELISA板（IOOul/孔）。测 定的其余部分遵循制造商的指令。简言之，将ELISA板中的样品于37°C温育60-70分钟，然 后在清洗缓冲液（PBS，pH7. 4,0. 05%Tween20)中清洗3次。将IOOul/孔抗C5b-9偶联物 添加至ELISA板。于室温温育30分钟后，如上所述清洗ELISA板，并添加IOOul/孔底物， 并将板于室温再温育30分钟。通过添加50ul/孔5mMEDTA来终止显色。使用MultiSkan Ascent微量滴定板阅读仪（ThermoFisherScientific，Milford，MA)来测定 405nm处的 吸光度。
[0190] 溶血抑制测定法：
[0191] 将家兔红血球（ColoradoSerumCompany，Denver，CO)用含有0?1 %牛皮肤明胶 (Sigma)的Veronal缓冲液（Sigma，St.Louis，MO) (GVB)清洗 3 次，每次清洗以 1500rpm， 于4°C离心10分钟。最后一个离心步骤后，将细胞以终浓度2xl09个细胞/mL重悬浮于 GVB。将在GVB中连续稀释的补体抑制剂以50yL/孔添加至96孔U底聚丙烯板（Costar， Cambridge，MA)，接着是 20yL/ 孔在 0.IMMgCl2/0.IMEGTA/GVB中 1:2 稀释的家兔红血 球。通过添加30yL/孔用GVB1:3预稀释的Clq消减的血清（ComplementTechnology， Tyler，TX)来触发板中补体级联。将板以温和摇动于室温温育30分钟，之后用IOOyL/孔 IOmMEDTA/GVB终止反应。将板以1500rpm离心5分钟后，将上清液转移至透明平底无结合 96 孔板（Nunc，Neptune，NJ)并使用微量板阅读仪（MolecularDevices，Sunnyvale，CA)于 412nm读取光密度。
[0192] 阿尔法筛选竞争性测定法：
[0193] 使用AlphaScreen?组氨酸（镍螯合物）检测试剂盒（PerkinElmer，Waltham， MA)来评估突变型CRIg分子对C3的潜在交叉反应性。以想要的终浓度3倍制备连续 稀释的人C3和C3b(3, 000至0. 7nM)，以及固定浓度的生物素化iC3b(30nM)，及突变型 CRIg(mutCRIg)和野生型CRIg分子（15-60nM)，1: 1:1混合，并在定轨摇床上以3000TPM于 环境温度预温育30分钟。以想要的终浓度4倍制备链霉亲合素供体珠与镍螯合物受体珠 (各0.lmg/mL)的1:1混合物并添加至反应。将反应板在定轨摇床上以3000rpm于环境温 度避光温育60分钟。在AlphaQuest?-HTS微量板分析仪（PerkinElmer，Waltham，MA) 上分析板。
[0194] 表面等离振子共振
[0195] 在Biacore? AlOO设备（GEhealthcare)上使用表面等离振子共振测量来测定 C3b对突变型和野生型CRIg的亲和力。采用一种抗Fc捕捉形式，而且自平衡结合测量计算 KD。使用抗muFc捕捉试剂盒（BR-1008-38)遵循制造商提供的指令准备传感器芯片。将突 变型或野生型CRIg在运行缓冲液（IOmMHEPESpH7.4,150mMNaCl，0. 01%Tween-20)中 稀释至Iyg/mL并进行60yL注射，使得芯片表面的一个点捕捉约100RU的融合蛋白。记录 在CRIg点上注射10分钟不同C3b浓度的溶液的传感图，减去含有捕捉抗体但没有CRIg的 参照点的信号。为浓度范围4yM至15. 6nM的C3b2倍稀释系列获得数据，流速10yL/分， 温度25°C。在结合循环间通过注射IOmMGly-HClpH1.730秒来再生表面。使用Biacore AlOO评估软件vl.l(Safstenetal. (2006)Anal.Biochem.353:181)的亲和力算法，使用每 次C3b注射结束时获得的高台值来计算Kd。
[0196]
[0197] 噬菌体文库设计
[0198] 我们使用与C3b复合的CRIg的晶体结构来设计靶文库。设计了 5个文库来覆盖 CRIg与C3b之间的接触面（图4)。CRIg文库在单价噬菌体展示载体中构建成与g3p次要 外壳蛋白的融合物（Zhangetal.，JBiolChem281 (31) :22299-311 (2006))。我们通过 诱变将终止密码子噬菌体噬菌粒的CRIg编码部分每个要随机化的残基处。然后使用每种 含有终止密码子的构建物来生成噬菌体展示文库（见材料和方法）。使用"软随机化"策略 来选择结合物以维持野生型序列偏爱，使得选定的位置只有50%的时间被突变。所有5个 文库是以>10 1CI种独立序列每个文库的平均多样性获得的（表1)。
[0199] 用CRIg噬菌体文库选择
[0200] 4轮结合选择后，我们自这5个文库获得了 38个独特克隆（表2)。在文库1中， 第15位赖氨酸得到保留。芳香族残基（即酪氨酸和色氨酸）替换第8位谷氨酸。第14位 被亲本的色氨酸或同源的苯丙氨酸占据。在文库2中，我们对24个克隆测序，而且它们都 揭示共有。第42位，第46位和第47位作为野生型得到保留。天冬酰胺，组氨酸和苯丙氨 酸替换第43位，第44位和第45位处的野生型序列。在文库3中，我们随机化10个位置， 而且序列在第54位，第55位，第56位，第57位，第58位，第61位，第62位和第63位处展 现完全保守。异亮氨酸或赖氨酸占据第60位。在第64位，谷氨