酰胺被精氨酸替换或得到 保留。在文库4中，芳香族残基在第86位占优，而同源碱性残基，即精氨酸和赖氨酸在第99 位占优。第85位，第87位和第95位也得到软随机化，但是表现为高度保守的。在文库5 中，两种显著同源的碱性残基，即赖氨酸和精氨酸在第105位是优选的，胜过谷氨酰胺。带 负电荷的残基即天冬氨酸或酸性氨基酸即天冬酰胺在第110位占优。
[0201] 我们通过竞争性噬菌体ELISA评估了 一些突变体的亲和力（数据未显示），而且我 们发现文库3中有如下的克隆，它们是比野生型CRIg好大约8倍的C3b结合物。
[0202] 体外结合亲和力及体内生物学功效的测定
[0203] 为了鉴定提高对C3b的结合亲和力和溶血抑制测定法中的功效的关键残基，通过 掺入占优的单突变并将其它位置保持为野生型，或自第一代噬菌体文库选出2-3个通过噬 菌体ELISA测定的高亲和力克隆，接着设计第二代CRIg变体来进行。为了精确测量我们的 突变体的亲和力和功效，我们作为分离的蛋白质表达了所有变体。来自溶血抑制测定法的 结果（表3)显示在溶血测定法中与野生型相比来自文库1的L12,来自文库3的L33和来 自文库4的L41显著提高功效4-10倍。来自文库3的L32显示与野生型CRIg相比改进 10倍的IC50。数据还表明结合亲和力与来自基于细胞的测定法的功效没有关联。
[0204] 突变体的组合
[0205] 基于来自第二代文库的结果，我们设计了第三代突变体以进一步改进在溶血测定 法中的功效和结合亲和力。我们选择3个最有生物学效力的突变体（L12-8W，L33-Q60I/ L32-Q64R和L41-M86Y)和1个结合亲和力最高的突变体（L32-Q64R)作为模板。然后，我 们将这些突变体与在第二代文库中获得的其它有生物学效力的克隆组合以测定提高溶血 测定法中的功效和结合亲和力的最佳突变集。我们表达和纯化了CRIg变体，供详细的分析 用。数据显示（表4)来自L12的组合突变体不改进抑制功效，而且甚至展示与亲本突变体 相比较低的活性，尽管WL41和WL59突变体的结合亲和力高3-6倍。在来自L32的突变体 内，RL41展现比野生型好1. 8倍的结合亲和力和溶血测定法中好6倍的功效。所有来自L33 组的突变体显示显著提高的结合亲和力；与野生型相比提高27-226倍，尽管溶血测定法中 的功效没有显著提高。我们还注意到60I-64R和86Y涉及大多数亲和力改进的组合克隆。
[0206]CRIgQ64RM86Y突变体改进的结合亲和力和补体抑制活性
[0207] 我们选择了在竞争性ELISA中具有最高亲和力的突变体Q64RM86Y(图4和表3) 供进一步分析用。为了测定CRIgwt和CRIgQ64RM86Y对C3b的结合亲和力，对CRIgwt 和CRIgQ64RM86Y实施了Biacore分析。CRIgQ64RM86Y的亲和力相对于野生型CRIg改 进了 5倍（图6)。先前的研宄显示CRIgwt选择性结合C3b但不结合天然C3(Wiesmanet al.，Nature，444(7116):217-20,2006)。因为诱变可改变这种选择性，所以我们在a筛选 液相竞争性测定法中比较了CRIgQ64RM86Y对C3b与C3相比的亲和力。CRIgQ64RM86Y 与可溶性C3b竞争，但不与可溶性C3竞争，指示诱变不改变CRIg对活性成分C3b的选择性 (图7)。通过分析与C3b复合的CRIgQ64RM86Y的结构中的这些残基（数据未显示），这 种选择性得到了进一步确认。
[0208] 为了测试对C3b改进的亲和力和保守的选择性是否转化成改进的功效，我们在对 补体旁路途径选择性的基于红细胞的溶血测定法中测试了CRIgQ64RM86Y对CRIgwt。 CRIgQ64RM86Y显示出与CRIgwt相比改进4倍的IC50(图8的A小图）。为了进一步证 实针对旁路途径补体抑制的改进的功效，我们在对补体旁路途径选择性的基于LPS的测定 法中比较了CRIgQ64RM86Y与CRIgwt的抑制活性。在此，CRIg显示出与野生型重组蛋 白相比180倍的IC50改进。CRIgwt和CRIgQ64RM86Y不影响经由经典途径的补体活化。 如此，CRIg-C3b结合界面中的两处氨基酸替代产生具有改进的结合亲和力和对不同旁路途 径具有选择性的两种不同测定法中优良补体抑制活性的分子。
[0209] 为了进一步确定提高的结合亲和力和功效是否转化成改进的治疗功效，我们在血 清转移关节炎模型中比较了wt和Q64RM86Y型式的CRIg的保护效果。先前的研宄显示了CRIg有力抑制胶原和抗体诱导的关节炎中的炎症和骨破坏（Katschkeetal.，J.ExpMed 204(6):1319-1325(2007))。
[0210] 在此，在免疫复合物介导的关节炎的第三种临床前模型中测试CRIg功效。类风湿 性关节炎的一种自发性鼠模型（K/BxN)模拟人关节炎疾病的许多临床和组织学特征。第0 天给小鼠注射自K/BxN小鼠获得的50微升血清。每天检查动物，并通过目视观察对疾病程 度打分。第6天处死所有小鼠。
[0211] 自第-1天开始在IOOul无菌盐水中每天给小鼠皮下注射指定量的同种型对照或 hCRIg-mlgGl或hCRIg-RL41-mIgGl重组蛋白。
[0212] 监测和打分：
[0213] 每只爪的得分。
[0214] 0=没有红斑和肿胀的证据
[0215] 1=限于足中段（跗骨）或踝的红斑和轻度肿胀
[0216] 2=自踝延伸至足中部的红斑和轻度肿胀
[0217] 3=自踝延伸至跖关节的红斑和中度肿胀
[0218] 4=涵盖踝，足和趾的红斑和重度肿胀
[0219] 得分均值=4只爪的得分之和。
[0220]疾病阶段，轻度（得分均值1-3)，中度（得分均值4-8)和重度疾病（得分均值9 以上）。得分均值反映累及的关节数目。
[0221] 在第6天，通过处死前麻醉下的心内穿刺采集血液样品。使用血清测量hCRIg-Fc 融合蛋白的量。
[0222] 收集关节供组织学评估用。
[0223] 将来自KRN小鼠的血清转移入Balb/c接受者导致快速且强力的免疫应答，其特征 为对称的关节炎症。关节炎诱导是由在关节中形成促炎性免疫复合物的抗葡萄糖-6-磷 酸异构酶自身抗体介导的（Kouskoff，V.，Korganow，A.S.，Duchatelle，V.，Degott，C.， Benoist，C.，andMathis,D. (1996).Organ-specificdiseaseprovokedbysystemic autoimmunity.Cell87,811-822)。关节炎的形成完全依赖于完整无缺的旁路补体途径 和Fc受体功能，如旁路补体途径成分缺陷的小鼠中和常见Fc受体Y链缺陷的小鼠中没 有疾病所显不的（Ji，H.，Ohmura，K.，Mahmood，U.，Lee，D.M.，Hofhuis，F.M.，Boackle， S.A. ,Takahashi,K. ,Holers,V.M. ,ffalport,M. ,Gerard,C. ,etal. (2002).Arthritis criticallydependentoninnateimmunesystemplayers.Immunity16,157-168)〇 由 于疾病的快速发作和严重性，用CRIgwt-Fc融合蛋白处理只将关节炎得分降低22% (图9 的A小图，B小图）。用CRIgQ64RM86Y处理显示关节炎得分降低66%。组织学检查显示， 与用CRIgwt或对照融合蛋白处理的小鼠相比，用CRIgQ64RM86Y处理的小鼠中主要由嗜 中性粒细胞和巨噬细胞组成的免疫细胞浸润显著降低（图9的C小图，D小图）。CRIgwt 和CRIgQ64RM86Y的血清浓度是相似的，指示关节炎得分的差异不是由于CRIgwt与CRIg Q64RM86Y蛋白质的半衰期差异。如此，我们显示了CRIg对其靶物C3b提高的结合亲和力 转化成显著改进的治疗功效。
[0224] 在此通过述及明确地完整收录本说明书中所引用的所有专利和参考文献。
[0225] 虽然已经参照具体实施方案描述了本发明，但是要理解，本发明不限于此类实施 方案。相反，本发明意图覆盖所附权利要求的精神和范围内所包括的各种修改和等效方案。
[0226] 本发明涉及下述各项。
[0227] 1. 一种CRIg变体，其包含在选自下组的区域中的氨基酸替代：SEQIDNO:2之氨 基酸序列的E8-K15,R41-T47,S54-Q64,E85-Q99 和Q105-K111。
[0228] 2.项1的变体或其片段，其选择性结合C3b胜过C3。
[0229] 3?项1的变体，其具有提高的对C3b的结合亲和力胜过SEQIDNO:2之天然序列 人CRIg0
[0230] 4.项3的变体，其中所述结合亲和力提高至少2倍。
[0231] 5.项3的变体，其中所述结合亲和力提高至少5倍。
[0232] 6?项3的变体，其中所述结合亲和力提高至少10倍。
[0233] 7?项3的变体，其中所述结合亲和力提高至少90倍。
[0234] 8?项1的变体，其是比SEQIDNO: 2之天然序列人CRIg更有力的旁路补体途径抑 制剂。
[0235] 9?项8的变体，其比SEQIDNO:2之天然序列人CRIg更有力至少2倍。
[0236] 10.项8的变体，其比SEQIDNO:2之天然序列人CRIg更有力至少5倍。
[0237] 11?项8的变体，其比SEQIDNO:2之天然序列人CRIg更有力至少10倍。
[0238] 12.项1的变体，其包含在选自下组的一个或多个氨基酸位置处的氨基酸替代： SEQIDN0:2 之氨基酸序列中的位置 8，14，18,42,44,45,60,64,86,99，105 和 110。
[0239] 13.项1的变体，其包含在SEQIDNO: 2之氨基酸序列中的氨基酸位置60,64,86， 99,105和110中一个或多个位置处的氨基酸替代。
[0240] 14.项1的变体，其包含选自下组的一处或多处替代疋81，114?484￥/114?;?45卩； G42D/D44H/P45F；Q60I；Q64R；Q60I/Q64R；M86Y；M86ff,M86F,M86W/Q9R；M86F/Q99R；K110D, KllN;Q105R/K110N;Q105R/K110Q和Q105K/K110D。
[0241] 15.项I的变体，其包含选自下组的一处或多处替代：Q64R/M86Y;Q60I/Q64R/ E8Y；Q60I/Q64R/G42D；Q60I/Q64R/P45F；Q60I/Q64R/G42D/D44H/P45F；Q60I/Q64R/M86Y； Q60I/Q64R/Q105R；Q60I/Q64R/Q105K；Q60I/Q64R/K110N；Q60I/Q105R/K110N；M86Y/E8Y； M86Y/G42D/D44H/P45F;M86Y/P45F;M86Y/G42D/D44H/P45F和M86Y/Q99K/M86Y/Q99R/M86Y/ Q105R/M86Y/Q105K/M86Y/Q105R/K110N。
[0242] 16.项I的变体，其包含选自下组的一处或多处替代：Q60I;Q64R;Q60I/Q64R; M86Y；Q99L；Q105K/K110D；E8ff/Q105R/Kl10N；Q64R/M86Y；Q60I/Q64R/E8Y；Q60I/Q64R/ G42D；Q60I/Q64R/P45F；Q60I/Q64R/G42D/D44H/P45F；Q60I/Q64R/M86Y；Q60I/Q64R/Q105R； Q60I/Q64R/Q105K;Q60I/Q64R/K110N;M86Y/P45F和M86Y/Q105K。
[0243] 17.项I的变体，其包含Q60I/Q64R/M86Y或Q60I/Q64R/G42D/D44H/P45F替代。
[0244] 18. -种嵌合分子，其包含依照项1至17任一项的变体。
[0245] 19?项18的嵌合分子，其是免疫粘附素。
[0246] 20.项19的嵌合分子，其中所述CRIg变体比SEQIDNO: 2之全长CRIg短。
[0247] 21.项20的嵌合分子，其包含CRIg胞外结构域。
[0248] 22. -种药物组合物，其包含与药学可接受赋形剂混合的依照项1至17任一项的 CRIg变体。
[0249] 23. -种药物组合物，其包含与药学可接受赋形剂混合的依照项19的免疫粘附 素。
[0250] 24. -种用于预防或治疗补体相关疾病或状况的方法，包括对需要此类处理的受 试者施用预防或治疗有效量的依照项1至17任一项的CRIg变体或包含此类变体的免疫粘 附素。
[0251] 25.项24的方法，其中所述补体相关疾病是炎性疾病或自身免疫性疾病。
[0252] 26.项25的方法，其中所述补体相关疾病选自下组：类风湿性关节炎（RA)，成人 呼吸窘迫综合征（ARDS)，缺血和再灌注后远端组织损伤，心肺旁路手术期间补体活化，皮肌 炎，天疱疮，狼疮肾炎及所致肾小球肾炎和血管炎，心肺旁路，心脏停搏诱导的冠状内皮功 能障碍，II型膜性增生性肾小球肾炎，IgA肾病，急性肾衰竭，冷球蛋白血症，抗磷脂综合 征，年龄相关黄斑变性，葡萄膜炎，糖尿病视网膜病，同种异基因移植，超急性排斥反应，血 液透析，慢性阻塞性肺窘迫综合征（COPD)，哮喘，吸入性肺炎，荨麻瘆，慢性特发性荨麻瘆， 溶血性尿毒症综合征，子宫内膜异位症，心源性休克，缺血再灌注损伤和多发性硬化（MS)。
[0253] 27.项25的方法，其中所述补体相关疾病选自下组：炎性肠病（IBD)，系统性红斑 狼疮，类风湿性关节炎，青少年慢性关节炎，脊椎关节病，系统性硬化（硬皮病），特发性炎 性肌病（皮肌炎，多肌炎），斯耶格伦氏综合征，系统性血管炎，结节病，自身免疫性溶血性 贫血（免疫性全血细胞减少，阵发性睡眠性血红蛋白尿），自身免疫性血小板减少（特发性 血小板减少性紫癜，免疫介导的血小板减少），甲状腺炎（格雷夫斯氏病，桥本氏甲状腺炎， 青少年淋巴细胞性甲状腺炎，萎缩性甲状腺炎），糖尿病，免疫介导的肾病（肾小球肾炎，小 管间质性肾炎），中枢和周围神经系统的脱髓鞘病诸如多发性硬化，特发性多神经病，肝胆 病诸如传染性肝炎（甲型，乙型，丙型，丁型，戊型和其它非亲肝性病毒的肝炎），自身免疫 性慢性活动性肝炎，原发性胆汁性肝硬化，肉芽肿性肝炎和硬化性胆管炎，炎性和纤维化肺 病（例如囊性纤维化病），麸胶敏感性肠病，惠普尔氏病，自身免疫或免疫介导皮肤病包 括大疱性皮肤病，多形性红斑和接触性皮炎，银肩病，肺的变应性疾病诸如嗜曙红细胞性肺 炎，特发性肺纤维化和超敏感性肺炎，移植相关疾病包括移植物排斥，移植物抗宿主病，阿 尔茨海默氏病，阵发性睡眠性血红蛋白尿，遗传性血管水肿，动脉粥样硬化和II型膜性增 生性肾小球肾炎。
[0254] 28.项25的方法，其中所述补体相关疾病是类风湿性关节炎（RA)。
[0255] 29.项25的方法，其中所述补体相关疾病是补体相关眼状况。
[0256] 30.项29的方法，其中所述补体相关眼状况选自下组：所有阶段的年龄相关黄斑 变性（AMD)，葡萄膜炎，糖尿病性和其它缺血相关视网膜病，眼内炎和其它眼内新血管疾病。
[0257] 31.项30的方法，其中所述眼内新血管疾病选自下组：糖尿病黄斑水肿，病理性近 视，von Hippel-Lindau病，眼的组织胞浆菌病，视网膜中央静脉阻塞（CRVO)，角膜新生血管 形成和视网膜新生血管形成。
[0258]32.项29的方法，其中所述补体相关眼状况选自下组：年龄相关黄斑变性（AMD)， 脉络膜新生血管形成（CNV)，糖尿病视网膜病（DR)和眼内炎。
[0259] 33.项32的方法，其中所述AMD是湿性AMD。
[0260] 34.项32的方法，其中所述AMD是干性或萎缩性AMD。
[0261] 35.项24的方法，其中所述受试者是哺乳动物。
[0262] 36.项35的方法，其中所述哺乳动物是人。
[0263] 37. -种用于在哺乳动物中抑制C3b变体片段生成的方法，包括对所述哺乳动物 施用有效量的依照项1至17任一项的CRIg变体或包含所述变体的免疫粘附素。
[0264] 38.-种用于在哺乳动物中选择性抑制旁路补体途径的方法，包括对所述哺乳动 物施用有效量的依照项1至17任一项的CRIg变体或包含所述变体的免疫粘附素。
[0265] 表1:噬菌体文库。设计了五个软随机化文库来覆盖CRIg与C3b之间的接触区。
[0266] 表1:菌体文库
[0267]
【主权项】
1. 一种CRIg变体，其包含在选自下组的区域中的氨基酸替代：SEQ ID N0:2之氨基酸 序列的 E8-K15, R41-T47, S54-Q64, E85-Q99 和 Q105-K111。
2. -种嵌合分子，其包含依照权利要求1的变体。
3. 权利要求2的嵌合分子，其是免疫粘附素。
4. 一种药物组合物，其包含与药学可接受赋形剂混合的依照权利要求1的CRIg变体。
5. -种药物组合物，其包含与药学可接受赋形剂混合的依照权利要求3的免疫粘附 素。
6. -种用于预防或治疗补体相关疾病或状况的方法，包括对需要此类处理的受试者施 用预防或治疗有效量的依照权利要求1的CRIg变体或包含此类变体的免疫粘附素。
7. -种用于在哺乳动物中抑制C3b变体片段生成的方法，包括对所述哺乳动物施用有 效量的依照权利要求1的CRIg变体或包含所述变体的免疫粘附素。
8. -种用于在哺乳动物中选择性抑制旁路补体途径的方法，包括对所述哺乳动物施用 有效量的依照权利要求1的CRIg变体或包含所述变体的免疫粘附素。
【专利摘要】本发明关注亲和力成熟的CRIg变体。具体而言，本发明关注具有提高的对C3b的结合亲和力且保留胜过C3的对C3b的选择性结合的CRIg变体。
【IPC分类】C07K14-705, A61K38-17, G01N33-68, C07K19-00, A61P37-00, A61P29-00
【公开号】CN104558151
【申请号】CN201410686051
【发明人】萨科德夫·S·西多, 李冰, 曼诺·范卢克伦坎帕格尼, 克里斯琴·威斯曼
【申请人】健泰科生物技术公司
【公开日】2015年4月29日
【申请日】2009年5月6日
【公告号】CA2720685A1, CN102015763A, CN102015763B, EP2280996A2, US20100150908, WO2009137605A2, WO2009137605A3