定，同 时提取质粒EcoRI、Notl双酶切鉴定(酶切鉴定体系同步骤1)，为增加结果的可靠性，可增 加选取5'端编码区引物FF扩增检测（引物同步骤1中（3))。
[0060] 将初步鉴定正确的阳性单克隆菌株送金唯智（北京）生物科技有限公司进行进一 步测序鉴定。
[0061] 重组质粒DNA测序结果表明，重组质粒中插入片段的序列与红林蚁乙酰胆碱酯酶 (AChE)mRNA-致，由此证明成功地将红林蚁乙酰胆碱酯酶（AChE)的编码序列插入了真核 表达载体，且插入方向正确。即经PCR扩增出的红林蚁乙酰胆碱酯酶（AChE)基因全序列， 成功地插入了真核表达载体pPICZaA中，成功地构建了真核重组质粒表达载体。
[0062]、将步骤2所构建的真核重组质粒表达载体转化进入毕赤酵母宿主细胞，培养，诱 导表达红林蚁乙酰胆碱酯酶（AChE) 电击法将步骤2所构建的真核重组质粒表达载体转化进入毕赤酵母X33感受态菌株， 筛选阳性菌株，扩增培养，甲醇诱导红林蚁乙酰胆碱酯酶(AChE)表达，具体步骤如下： (1)毕赤酵母X33感受态菌株的制备： 将毕赤酵母X33菌种划YH)平板29°C培养3天直至菌体长至合适大小，挑单菌落至3mL YH)液体培养震荡培养（29°C、220rpm)至0D6QQ=0. 6。
[0063] 1% 体积量转接至 20. 0mLYH)继续扩大培养（29°C、220rpm)至 0D6QQ=0. 6。
[0064] 4°C、1500Xg离心5min，弃上清。室温下用 8.0mLX液（100mMLiAC，10mMDTT， 0. 6M山梨醇和lOmMTris-Hcl，PH=7. 5)重悬菌体，常温作用30min。
[0065] 4°C、1500Xg离心5min，弃上清。用1mL冰上预冷的山梨醇（1M)重悬；转至 I. 5mLEP管中，4°C，1500Xg离心5min，弃上清，重复三次进行洗涤。
[0066] 最后用80iiL冰上预冷的山梨醇（1M)重悬菌体，即为毕赤酵母X33感受态菌体， 置冰上待用。
[0067] (2)酶切、浓缩真核重组质粒表达载体： 限制性内切酶SacI酶切线性化步骤2所得真核重组质粒表达载体，酶切体系如下： 步骤2的真核重组质粒表达载体，30yL; lOXCutSmartBuffer, 10uL； SacI,5uL； ddH20 加至lOOuL。
[0068] 37DC反应 4h〇
[0069] 跑胶鉴定正确后，浓缩酶切产物，具体步骤如下： 将SacI酶切后体系80°C保持10min，然后依次加入1/10体积的NaAc(1M)，2. 5倍体 积的无水乙醇，_20°C反应2. 5h。
[0070] 12000rpm离心 7min，弃上清。
[0071]加500iiL的75%乙醇轻洗，4°C、12000rpm离心7min,弃上清，重复一次。
[0072] 将EP管开口置于37°C培养箱中直至无乙醇气味后，加入12LddH20重溶酶切 产物(重溶后取其中2yL用于跑胶检测浓缩效果，剩余10yL-20°C保存备用）。
[0073] (3 )电击法转化毕赤酵母X33感受态菌株 将步骤（2)浓缩的酶切后的真核重组质粒表达载体10yL加入到步骤（1)制备的 80iiL的毕赤酵母X33感受态菌液中，轻轻混匀后转入电转杯内（电转杯提前冰上预冷30 min),冰上放置5min。
[0074] 电击转化（2KV，25iiF，186Q)，作用5ms。电击后迅速加入1mL冰上预冷的 山梨醇（1M)，轻轻混匀后转至新的1.5mLEP管内，30°C孵育1h。
[0075] 然后将电转液均匀涂布于Zeocin(100iig/mL)抗性的YPD平板上，29°C倒置培 养三天，直至菌体长至合适大小。
[0076] (4)扩增培养，甲醇诱导红林蚁乙酰胆碱酯酶(AChE)表达 挑取步骤（3)中阳性单一菌落至液体YPD(Zeocin，100yg/mL)培养基，振荡培养12 II。 然后转接到8丽￥培养基培养24 11，41：、1500\8离心5 111111，弃上清。
[0077]BMGY培养基重悬菌体并继续培养，同时按1%的体积量添加甲醇进行红林蚁乙酰 胆碱酯酶（AChE)的诱导表达。
[0078] 每隔24h取出培养液上清检测酶活，酶活达到最高峰时停止培养。
[0079] 停止培养后菌液4°C、10000r/min离心10min，取上清，即可获得重组后的红林蚁 乙酰胆碱酯酶（AChE)的粗酶液。
[0080]4、红林蚁乙酰胆碱酯酶（AChE)的纯化 由于本发明所采用的真核表达载体pPICZaA特异性表达6XHis标签，因而步骤3所 得的红林蚁乙酰胆碱酯酶（AChE)的粗酶液中的重组后的红林蚁乙酰胆碱酯酶（AChE)的 C-端带有组氨酸标签，进一步通过Ni-NTAHis-BindResins柱（TAKARA公司）即可获得纯 化的红林蚁乙酰胆碱酯酶（AChE)，纯化过程简要介绍如下： 在层析柱中装入适量Ni-NTAHis-BindResins，用5倍体积的结合缓冲液平衡树脂。
[0081] 用48%饱和度的硫酸铵沉淀步骤3所得的重组后的红林蚁乙酰胆碱酯酶（AChE)的 粗酶液，4°C、12000rpm离心10min,弃上清，收集沉淀。
[0082] 适量结合缓冲液溶解沉淀，让溶解后的重组红林蚁乙酰胆碱酯酶（AChE)流过层析 柱，弃流出液。用5倍体积的结合缓冲液洗涤层析柱，弃流出液。
[0083] 用3倍体积的洗脱缓冲液洗脱，收集洗脱液。
[0084] 将收集到的洗脱液用10倍体积的生理盐水（pH=7. 0)反复透析，除去咪唑即可得 到纯化的红林蚁乙酰胆碱酯酶（AChE)。
[0085] 分别对步骤3中毕赤酵母X33菌体发酵液甲醇诱导前菌液、甲醇诱导培养24h后 菌液、甲醇诱导结束后未纯化的菌液、甲醇诱导醇化后的红林蚁乙酰胆碱酯酶（AChE)进行 SDS-PAGE电泳，结果如图2所示。
[0086] 从图2可以看出，甲醇诱导后的重组红林蚁乙酰胆碱酯酶（AChE)在约64KD大小 的位置有明显的AchE条带，因而可以证实红林蚁乙酰胆碱酯酶（AChE)在毕赤酵母中获得 了高水平的表达；纯化后的重组红林蚁乙酰胆碱酯酶条带单一且大小正确，表明纯化成功。
[0087] 实施例2 针对实施例1所制得的红林蚁乙酰胆碱酯酶（AChE)，发明人进一步进行了活性检测和 抑制率检测，简要介绍如下。
[0088] 实施例1纯化后所得红林蚁乙酰胆碱酯酶（AChE)的活性检测 按照GB/T5009. 199-2003配制检测试剂： PH=8. 0缓冲液：分别取11. 9g无水磷酸氢二钾与3. 2g磷酸二氢钾，用1000mL蒸馏 水溶解； 显色剂：分别取160mg二硫代二硝基苯甲酸（DTNB)和15. 6mg碳酸氢钠，用20mL上述配制的PH=8. 0缓冲液溶解，4°C保存。
[0089] 底物：取25mgS-乙酰基硫代乙酰胆碱，加3. 0mL蒸馏水溶解，4°C保存。
[0090] 按照Ellman的方法，取实施例1纯化后的红林蚁乙酰胆碱酯酶(AChE)酶液100 yL，添加2. 5mL磷酸钾缓冲液（1M，PH=8. 0)，37°C水浴15min，然后加入100iiL显色剂迅 速混匀后加入100UL底物；在412nm(比色皿，712型分光光度仪）条件下检测3min的 吸光值(A)的变化量，变化量越大就表明蛋白酶活越高。
[0091] 根据酶活公式计算酶活，公式如下：
【主权项】
1. 红林蚁乙酰胆碱酯酶基因，其特征在于，碱基序列如序列表序列1所示。
2. 权利要求1所述红林蚁乙酰胆碱酯酶基因所编码的红林蚁乙酰胆碱酯酶，其特征在 于，氨基酸序列如序列表序列2所示。
3. 权利要求2所述红林蚁乙酰胆碱酯酶的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步 骤： (1) 构建并PCR扩增红林蚁乙酰胆碱酯酶基因全序列； (2) 利用步骤（1)所构建的红林蚁乙酰胆碱酯酶基因全序列构建真核重组质粒表达载 体； (3) 将步骤（2)所构建的真核重组质粒表达载体转化进入毕赤酵母宿主细胞，培养，诱 导表达红林蚁乙酰胆碱酯酶； (4) 将步骤（3)表达后的红林蚁乙酰胆碱酯酶纯化。
4. 如权利要求3所述红林蚁乙酰胆碱酯酶的制备方法，其特征在于，步骤（2)中所述真 核表达载体为pPICZ a A质粒。
5. 如权利要求3所述红林蚁乙酰胆碱酯酶的制备方法，其特征在于，步骤（3冲所述毕 赤酵母采用毕赤酵母X33菌株。
6. 如权利要求3所述红林蚁乙酰胆碱酯酶的制备方法，其特征在于，步骤（4)中所述纯 化采用Ni-NTA His-Bind Resins柱进行纯化。
【专利摘要】本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种红林蚁乙酰胆碱酯酶（AChE）基因、所编码的红林蚁乙酰胆碱酯酶（AChE）、制备该酶的方法。红林蚁AChE基因及所编码的红林蚁AChE，其碱基序列及氨基酸序列如序列表所示。该酶的制备方法包括以下步骤：（1）构建并PCR扩增红林蚁AChE基因全序列；（2）构建红林蚁AChE全序列构建真核重组表达载体；（3）转化毕赤酵母宿主细胞，培养，诱导表达；（4）纯化。本发明通过实验证明，所制备的红林蚁AChE相较于现有的果蝇AChE具有更高的活性和灵敏度，因而在未来的农药检测试剂制备技术领域具有较好的应用前景。
【IPC分类】C12N15-81, C12N15-55, C12N9-18
【公开号】CN104593393
【申请号】CN201510004412
【发明人】翁海波, 张佳丽, 李倩, 张欢, 安秀丽
【申请人】郑州大学
【公开日】2015年5月6日
【申请日】2015年1月6日