G-ODN可以人工合成，来源易得，这对于丧失手术时机以及处于晚期等各种原因难于获取病人肿瘤抗原的病例，同样可以诱导和扩增出较高抗癌活性的免疫细胞群。本发明提供的CpG-DCIK细胞主要用于自体瘤的治疗，术后即时施治有效防转移防复发，也能够作为化疗的辅助治疗，此外，CpG-DCIK细胞也能够用于某些传染性疾病的免疫治疗。
【具体实施方式】
[0033]下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。
[0034]实施例1高效免疫活性细胞CpG-DCIK的制备
[0035]包括如下步骤:
[0036]步骤(I)外周血单个核细胞(PBMC)的制备
[0037]取肿瘤病人抗凝外周血20_50ml，用生理盐水对倍稀释后，用比重为1.077的淋巴细胞分离液分离外周血单个核细胞(PBMC)，所述分离采用水平转头的离心机，离心的速度为2000rpm，离心的时间我20分钟，然后用Hanks平衡液洗涤2?3次再进行显微镜下细胞计数，最后用淋巴细胞培养液完全F12/DMEM1:1调节细胞密度成3?5X10_6/ml的细胞悬液；
[0038]步骤⑵外周血淋巴细胞(PBL)和粘附细胞的分离
[0039]将步骤(I)所述细胞悬液移入6孔板，每孔3?5ml，置37°C、体积比5% CO2、饱和湿度的培养箱中温育2?3小时，然后用移液管冲洗细胞，将非黏附的细胞收集在50ml离心管中作为外周血淋巴细胞(PBL)悬液，6孔板留下的粘附细胞用于DC的诱导；
[0040]步骤⑶CIK细胞的诱导和扩增
[0041]在外周血淋巴细胞(PBL)悬液中添加重组人干扰素-γ，重组人干扰素-γ的终浓度为1000单位/晕升，然后移入表面积为75平方厘米的培养瓶中，每个培养瓶装量20晕升，置于37°C、体积比5% CO2、饱和湿度的培养箱中温育24小时，然后添加⑶3单抗、IL-1和IL-2，终浓度分别为50纳克/毫升、100微克/毫升和800单位/毫升，继续培养48-72小时后，显微镜下细胞计数，然后用CIK培养液调节细胞浓度为3xl0_5/毫升(CIK细胞培养液为完全F12/DMEM1:1或者AM-V，含浓度分别是100u/ml、800u/ml的IL-1和IL-2)，分配到75平方厘米培养瓶中，每瓶20毫升，进行扩大培养，此后，每瓶48-72小时按上述相同条件扩大培养一次，培养至第8天收集CIK细胞待用；
[0042]步骤(4) DC的诱导和扩增
[0043]在步骤⑵中的留有粘附细胞的6孔板中，每孔加入含有重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和白介素-4(IL-4)的DC培养液3毫升，重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和白介素-4(IL-4)的终浓度分别是1000单位/毫升和500单位/毫升，然后置于37°C、体积比5% CO2、饱和湿度的培养箱中培养3天，然后在各孔中加入CpG-0DN2006 (CpG_0DN2006为人工合成的寡核苷酸，可以通过公开途径购买获得，其序列为:5’ -TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT-3’，整个序列硫代化修饰，其中的CpG基序均为去甲基化的，CpG-0DN2006的合成及稀释过程均要求无菌)，CpG-0DN2006的终浓度为3微摩尔/毫升，继续培养至第5天，加入肿瘤坏死因子(TNF-a)，肿瘤坏死因子(TNF-a)的终浓度为100单位/毫升，培养至第8天，用移液管冲洗，收集非粘附和半粘附的DC待用；
[0044]步骤(5) DC与CIK细胞共培养制备CpG-DCIK细胞
[0045]将步骤(4)获得的DC与步骤(3)获得的CIK细胞分别计数，离心弃上清后，分别用上述CIK培养液调节细胞密度为6xl0_5/ml和2xl0_5/ml，再等体积混合后移入75平方厘米培养瓶中，每瓶20ml，每隔48-72小时按上述细胞密度分瓶扩大培养一次，即可获得CpG-DCIK 细胞。
[0046]实施例2高效免疫活性细胞CpG-DCIK的抗肿瘤应用
[0047]裸鼠右耳皮下接种人源前列腺癌细胞(Alva41) 1χ10_7/只，一周后成瘤率100%，14天后会阴部转移100%，开始连续腹腔接种实施例1获得的CpG-DCIK细胞悬液2-3xl0_8/只/次，隔日一次，共4次，至35天，生理盐水对照组生存率O % (0/4)，CIK细胞治疗组20 %(1/5)，DCIK 细胞治疗组 50% (3/6)，CpG-DCIK 治疗组为 70% (6/8)，而 CpG-DCIK 组瘤重明显小于CIK细胞组瘤重，与DCIK组瘤重差异不明显，说明上述实施例1获得的CpG-DCIK具有明显的抗肿瘤免疫活性。
[0048]以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。
【主权项】
1.一种高效免疫活性细胞CpG-DCIK的制备方法，其特征在于，包括以下步骤:先利用CpG及细胞因子诱导DC细胞，再用细胞因子诱导同源CIK细胞，然后将所述DC细胞与所述CIK细胞混合培养，即得:寡核苷酸诱导树突细胞与细胞因子诱导杀伤细胞共培养细胞，定名为 CpG-DCIK。
2.如权利要求1所述的的制备方法，其特征在于，包括以下具体步骤: 步骤(I)外周血单个核细胞的制备 取肿瘤病人抗凝外周血20-50ml，用生理盐水对倍稀释后，用比重为1.077的淋巴细胞分离液分离外周血单个核细胞，所述分离采用水平转头的离心机，离心的速度为2000rpm，离心的时间为20分钟，然后用Hanks平衡液洗涤2_3次再进行显微镜下细胞计数，最后用淋巴细胞培养液调节细胞密度成3-5xl0_6/ml的细胞悬液； 步骤(2)外周血淋巴细胞和粘附细胞的分离 将步骤⑴所得的细胞悬液移入6孔板，每孔3-5ml，置37°C、5% (体积)CO2、饱和湿度的培养箱中温育2-3小时，然后用移液管冲洗细胞，将非黏附的细胞收集在50ml离心管中作为外周血淋巴细胞悬液，6孔板留下的粘附细胞用于DC的诱导； 步骤(3) CIK细胞的诱导和扩增 在外周血淋巴细胞悬液中添加重组人干扰素-γ，重组人干扰素-γ的终浓度为1000单位/毫升，然后移入表面积为75平方厘米的培养瓶中，每个培养瓶装量20毫升，置于37°C、5% (体积)CO2、饱和湿度的培养箱中温育24小时，然后添加⑶3单抗、IL-1和IL-2，终浓度分别为50纳克/毫升、100微克/毫升和800单位/毫升，继续培养48-72小时后，显微镜下细胞计数，然后用CIK培养液调节细胞浓度为3xl0_5/毫升，分配到75平方厘米培养瓶中，每瓶20毫升，进行扩大培养，此后，每瓶48-72小时按上述相同条件扩大培养一次，培养至第8天收集CIK细胞待用； 步骤(4) DC的诱导和扩增 在步骤(2)中所得的留有粘附细胞的6孔板中，每孔加入含有重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子和白介素-4的DC培养液3毫升，重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子和白介素-4的终浓度分别是1000单位/毫升和500单位/毫升，然后置于37°C、5% (体积)CO2、饱和湿度的培养箱中培养3天，然后在各孔中加入CpG-0DN2006，CpG-0DN2006的终浓度3微摩尔/毫升，继续培养至第5天，加入肿瘤坏死因子，肿瘤坏死因子的终浓度为100单位/毫升，培养至第8天，用移液管冲洗，收集非粘附和半粘附的DC待用； 步骤(5) DC与CIK细胞共培养制备CpG-DCIK细胞 将步骤(4)获得的DC与步骤(3)获得的CIK细胞分别计数，离心弃上清后，分别用CIK培养液调节细胞密度为6xl0_5/ml和2xl0_5/ml，再等体积混合后移入75平方厘米培养瓶中，每瓶20ml，每隔48-72小时按上述细胞密度分瓶扩大培养一次，即得CpG-DCIK细胞。
3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述淋巴细胞培养液为完全F12/DMEMl: 1、完全 PRM1-1640 或者完全 AM-V。
4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述CIK培养液为含白细胞介素-1和白细胞介素-2的完全F12/DMEM1:1或者AM-V。
5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述移液管和离心管为聚丙烯材料，所述6孔板和培养瓶为聚苯乙烯材料。
6.权利要求1至5任一项所述制备方法获得的高效免疫活性细胞CpG-DCIK在制备抗肿瘤药物中的应用。
【专利摘要】本发明涉及一种高效免疫活性细胞CpG-DCIK的制备方法及应用，所述制备方包括以下步骤：利用CpG及细胞因子诱导DC细胞，用细胞因子诱导同源CIK细胞，然后将所述DC细胞与所述CIK细胞混合培养，得到一种新的免疫效应细胞群，即：寡核苷酸诱导树突细胞与细胞因子诱导杀伤细胞共培养细胞，定名为CpG-DCIK。本发明采用体外CpG-ODN联合细胞因子诱导DC，然后与同源CIK共培养，以获得增殖活性和细胞毒活性更强的免疫效应细胞群，这对于丧失手术时机或处于晚期等原因难于获取肿瘤抗原的病例，同样可以诱导和扩增出较高抗癌活性的免疫细胞群，从而扩大了抗肿瘤的适用范围。
【IPC分类】A61P35-00, C12N5-0783, A61K35-17, C12N5-0784
【公开号】CN104651312
【申请号】CN201510063766
【发明人】李丽
【申请人】上海力沃生物科技有限公司
【公开日】2015年5月27日
【申请日】2015年2月6日