的互变导致的错误配对；
⑵碱基的脱氨基作用，即碱基的环外氨基自发脱落，从而胞嘧啶会变成尿嘧啶、腺嘌呤会变成次黄嘌呤(H)、鸟嘌呤会变成黄嘌呤(X)等；
⑶脱嘌呤与脱嘧啶，自发的水解可使嘌呤和嘧啶从DNA链的核糖磷酸骨架上脱落下来；
⑷碱基修饰与链断裂，细胞呼吸产生胸腺嘧啶乙二醇、羟甲基尿嘧啶等碱基修饰物，还可能引起DNA单链断裂等损伤，体内DNA的甲基化，羟甲基化等结构变化；
(5)烷化剂造成的碱基烷基化、碱基脱落、DNA链断裂。
[0019]进一步，所述气单胞菌溶素纳米孔通道在DNA测序、DNA损伤、Micro-RNA检测中的应用，能用于端粒不同长度的检测；所述端粒由DNA序列构成，其长短与人体寿命相关，可通过该方法能对不同DNA序列作分辨，进行端粒不同长度的检测。
[0020]进一步，所述气单胞菌溶素纳米孔通道在DNA测序、DNA损伤、Mic1-RNA检测中的应用，能用于无需探针标记检测多种Micro-RNA ;所述Micro-RNA具有调节人体内基因的表达的作用，人体内Micro-RNA的水平与多种疾病直接相关，通过本发明提供的检测应用，能无需标记的在单分子水平特异性上检测实际样品中Micro-RNA的水平，从而进行疾病的临床诊断。
[0021 ] 本发明的积极效果是:
(I)制备的气单胞菌溶素纳米孔通道结构稳定，一旦获得可长时间保持其稳定开孔状态且不受外界条件改变的干扰，能在很高浓度变性剂条件下性质稳定。
[0022](2)分辨率高，由于气单胞菌溶素具有天然的小口径，因此无需修饰或进行氨基酸突变即可获得优于其他孔道的分辨率。
[0023](3)内腔整体带正电荷，使得带负电的DNA分子与气单胞菌溶素纳米孔内腔作用，能降低过孔速度，对实现单碱基分辨十分有利。
[0024](4)无需修饰即可用于检测应用，操作简单。
【附图说明】
[0025]图1为本发明气单胞菌溶素纳米孔通道的制备方法的流程框图。
[0026]图2为检测池I的结构示意图。
[0027]图3为检测池II的结构示意图。
[0028]图4为I，2-二植烷酰基磷脂的分子结构图。
[0029]图5为提拉法原理示意图。
[0030]图6为具有一个不同碱基的DNA序列单碱基分辨示意图。
[0031]图7为通过嵌入环糊精进行DNA测序的示意图。
[0032]图8为甲基化前后胞嘧啶的结构图。
[0033]图9为用phi29 DNA聚合酶进行DNA测序的示意图。
[0034]图中的标号分别为:
1、顺室；2、提拉孔；3、反室；
4、小孔；5、聚缩醛树脂检测池；6、电解质溶液；
7、磷脂双分子层；8、环糊精；9、剪切酶；
10、单个核苷酸；11、模板链；12、引物链；
13、低聚DNA链；14、DNA聚合酶。
【具体实施方式】
[0035]以下结合附图介绍本发明气单胞菌溶素纳米孔通道的制备方法的【具体实施方式】，提供5个实施例；7个应用实施例。但是应该指出，本发明的实施不限于以下的实施方式。
[0036]实施例1
参见图1。一种气单胞菌溶素纳米孔通道的制备方法，包括以下步骤:
(I)气单胞菌溶素的前处理
将trypsin-EDTA溶液和气单胞菌溶素以1:100混合并在室温下培养lOmin，活化后的气单胞菌溶素用PBS缓冲液配置并在_20°C冰箱中存储，储存浓度为0.lmg/ml。
[0037](2)用提拉法制备磷脂双分子层
用聚缩醛树脂检测池5作为载体制备磷脂双分子层7，所述聚缩醛树脂检测池5含有检测池I (也即顺室1，参见图2)和检测池II (也即反室3，参见图3)，所述检测池II嵌入所述检测池I中；在磷脂双分子层7形成后将所述聚缩醛树脂检测池5分为两个区域:由于所述气单胞菌溶素纳米孔插入磷脂膜时是单向的，因此，定义气单胞菌溶素纳米孔嵌入磷脂膜后与大口端对应的是顺室I (即检测池I)，与小口端对应的为反室3 (即检测池II);在所述检测池II上有直径为50 μ m的小孔4，用于形成磷脂双分子层7 ;在检测池I的侧边有与池体连通的提拉孔2，用于插入注射器对内部溶液进行提拉；将形成磷脂双分子层膜7所用的1，2_ 二植烷酰基磷脂(参见图4)储存在氯仿溶液中，保存在_20°C冰箱中。
[0038]具体过程为:
①涂抹磷脂正癸烷溶液，备磷脂双分子层膜前须先将I，2-二植烷酰基磷脂氯仿溶液中的氯仿抽去，然后将90μ I正癸烷加入抽好的1，2_ 二植烷酰基磷脂中配置成磷脂正癸烷溶液。
[0039]②涂抹磷脂正癸烷溶液，用貂毛画笔在ImL检测池II的小孔4内外两侧均匀涂抹磷脂正癸烷溶液并用N2吹干。
[0040]③施加电压，将检测池I和检测池II组装后分别加入ImL电解质溶液6，将一对Ag/AgCl电极浸入电解质溶液6中，通过电流放大器探头向磷脂双分子层7膜两端施加10mV电压并指定顺室I为虚拟接地端。
[0041]④反复提拉溶液(提拉法原理参见图5)，在反室3的小孔4处形成磷脂双分子层膜，在磷脂双分子层7成膜过程中，通过电容监测其形成质量并利用电压考察磷脂双分子层膜的机械强度，对所得磷脂膜施加400mV电压；若磷脂双分子层膜被击破则应重新拉起，重新提拉后的磷脂双分子层膜的电容与被击破的磷脂双分子层膜的电容相同或更大，该磷脂双分子层膜能用于形成纳米孔；若所述电容减小则应继续施加400mV电压。
[0042]⑤检测与重复，若磷脂双分子层膜在400mV电压下不能被击破，应用貂毛画笔将其刷破，再重新提拉成膜，重复步骤③和④，直至得到可用于形成纳米孔的磷脂双分子层膜。
[0043](3)形成气单胞菌溶素纳米孔通道
在稳定的磷脂双分子层膜形成后，在所述顺室I中加入10 μ I气单胞菌溶素，施加10mV电压使气单胞菌溶素嵌入所述磷脂双分子层膜，当气单胞菌溶素在磷脂双分子层膜上形成稳定的纳米通道时，离子流会发生跃升；在10mV电压下获得电流在50 土 5ρΑ的单个气单胞菌溶素纳米孔通道。
[0044]对实施例1制备的气单胞菌溶素纳米孔通道的检测分析:
为了确定得到的气单胞菌溶素纳米孔通道能否用于检测，首先，应确定制备的气单胞菌溶素纳米孔通道显示的电流值是否在正常范围，即10mV电压下单个纳米孔对应的电流值在50±5ρΑ内；其次，得到制备的气单胞菌溶素纳米孔通道后，应记录不同电压下(_200mV?+200mV)未加待测物时的时间-电流曲线，用于判断所得气单胞菌溶素纳米孔通道是否稳定，若记录的时间-电流曲线稳定表示可用于检测。
[0045]实施例1制备的气单胞菌溶素纳米孔通道经检测分析的结果表明:可进行检测应用。
[0046]实施例2
一种气单胞菌溶素纳米孔通道的制备方法，包括以下步骤:
(I)气单胞菌溶素的前处理，基本同实施例1，所不同的是:活化后气单胞菌溶素的存储浓度为10mg/ml。
[0047](2)用提拉法制备磷脂双分子层(同实施例1)。
[0048](3)形成气单胞菌溶素纳米孔通道，基本同实施例1，所不同的是:在稳定的磷脂双分子层膜形成后，在所述顺室I加入I μ I气单胞菌溶素，施加200mV电压使气单胞菌溶素嵌入磷脂双分子层膜，当气单胞菌溶素在磷脂双分子层膜上形成稳定的纳米通道时，离子流会发生跃升；在200mV电压下获得电流在100±5pA的单个气单胞菌溶素纳米孔通道。
[0049]对实施例2制备的气单胞菌溶素纳米孔通道的检测分析基本同实施例1。
[0050]将电压调至10mV,可验证实施例2制备的气单胞菌溶素纳米孔通道的电流是否在50 土 5pA范围内。
[0051]实施例3
一种气单胞菌溶素纳米孔通道的制备方法，包括以下步骤:
(I)气单胞菌溶素的前处理，基本同实施例1，所不同的是:活化后气单胞菌溶素存储的浓度为1.5mg/mlo
[0052](2)用提拉法制备磷脂双分子层(同实施例1)。
[0053](3)形成气单胞菌溶素纳米孔通道，基本同实施例1，所不同的是:在稳定的磷脂双分子层膜形成后，在所述顺室I加入3ul气单胞菌溶素施加+300mV电压使气单胞菌溶素嵌入磷脂双分子层膜，当气单胞菌溶素在磷脂双分子层膜上形成稳定的纳米通道时，离子流会发生跃升；在300mV电压下获得电流在150±5pA的单个气单胞菌溶素纳米孔通道。<