二乙酯原液充分混合，并于40°C震荡处理40min，将处理过的菌液经梯度稀释后涂布于氯化锂平板。
[0045](3)高产菌种的初筛
[0046]将上述涂布均匀的平板，置40°C培养48h，在长出菌落的平板上初筛出水解圈与菌落直径比值较大者挑至斜面保存，纯化后获得三株菌L1-2013-01，L1-2013-02,L1-2013-03
[0047](4)摇瓶发酵复筛
[0048]将获得的三株菌L1-2013-01，L1-2013-02，L1-2013-03在含有30mL发酵培养基的250mL摇瓶中进行摇瓶发酵，种子接种量10% (V/V)，40°C、100r/min培养72h，离心取发酵上清液制得粗酶液。
[0049](5)酶活测定
[0050]酶活单位的定义:ImL粗酶液,于105°C、pH4.2条件下，Imin液化Img可溶性淀粉，即为I个酶活力单位，以U/mL表示。
[0051]经测定，菌株L1-2013-02，为稳定的最高产菌株，且酶活达到30000U/mL，比原始菌株酶活提高1.6倍。
[0052]所述氯化锂平板:淀粉I %，蛋白胨 I %，(NH) 2S040.4 %，K2HPO40.8%, CaCl20.2%,氯化锂0.9%,琼脂2%。
[0053]所述的种子培养基:酵母粉0.5%，蛋白胨I %，可溶性淀粉I %，NaCl I %。
[0054]所述的发酵培养基:玉米粉5%?15%，豆饼粉4%?10%，(NH) 2S040.4 %,K2HP040.8%, CaC120.2%?
[0055]所述的摇瓶培养条件:该菌在含有30mL发酵培养基的250mL摇瓶中，接种量10%(V/V)，100r/min、40°C 发酵培养 72h。
[0056]由菌株L1-2013-02发酵获得了一种耐高温的α -淀粉酶，其酶学性质如下:
[0057](I)该酶温度适应范围较宽，最适作用温度在105_115°C之间，且在110°C以下保存的温度稳定性较好，而115°C以上保存长时间温度稳定性较差。
[0058](2)该酶最适反应pH值为4.2。在pH值3.0_7.0之间均有较高酶活力，在pH值为3.0时酶活完全稳定。
[0059](3)酶活性:由本发明所提供的突变株L1-2013-02，制备的耐高温α -淀粉酶酶活力为 30000-35000U/ml。
[0060]1、本发明使用紫外线-氯化锂-硫酸二乙酯复合诱变的方法获得了一株高产耐高温α -淀粉酶的枯草芽孢杆菌L1-2013-02，该菌株具有强耐酸、耐热性，产酶活力高的特点。
[0061]2、有该菌株生产所得的耐高温α -淀粉酶酶活力高达30000-35000u/ml，；适用温度范围为25-115°C，最适反应温度110°C，在110°C酶活完全稳定；适用反应pH值范围为
3.0-7.0，在pH值为3.0时酶活完全稳定，最适反应pH值为4.2，比现有的耐高温α -淀粉酶酶活力高，酶作用最适PH值范围宽泛，耐温度高，特别适合反应温度高、液化工艺与糖化工艺并存的工业化需求。
[0062]实施例1
[0063]提供一种绿色微生态复合肥:重量份数组成为:黑曲霉培养物6份，胶质芽孢杆菌菌剂5份，解磷巨大芽孢杆菌菌剂5份，枯草芽孢杆菌培养物10，泡盛曲霉培养物6，植物乳杆菌剂3份。
[0064]采用的菌种如下:
[0065]枯草芽抱杆菌(Bacillussubtilis subsp)CGMCC7926
[0066]植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)CICC20764
[0067]泡盛曲霉(Aspergillusawamori)CGMCC3.6484
[0068]黑曲霉(Aspergillusniger)L1-2013-03 保藏号为 CGMCC N0.7927。
[0069]泡盛曲霉菌剂的制备方法:
[0070]技术方案如下:
[0071]斜面菌种活化培养:将泡盛曲霉斜面菌种转接到斜面培养基上，27°C培养3天。
[0072]固体一级种子培养:挑取泡盛曲霉斜面菌种接入装有100克培养基的500毫升三角瓶中进行种子培养，30°C培养3天即可。
[0073]固体二级种子培养:将上述培养好的固体一级种子搅拌为碎块后加入装有1000克培养基的5000毫升三角瓶中进行种子培养，培养条件:30°C培养3天即可。
[0074]固体发酵培养:将二级摇瓶种子粉碎，加入装有灭菌培养基的发酵池或托盘中混合均匀后培养，曲料培养温度控制在26-35°C，湿度80-90%，每隔10小时翻料一次，培养时间5-7天；固体曲料的培养采用常用曲料培养技术；待培养料长满菌丝即可结束培养，培养基预先经高温蒸煮灭菌处理，灭菌条件控制温度121°C，时间I小时。
[0075]干燥粉碎:发酵结束培养料在流化床或其他干燥设备上进行干燥，干燥温度控制在60°C，干燥到水分含量在10%以下，然后将固体培养料进行粉碎，物料粉碎孔径在60目以上。
[0076]培养基组成:固体原料:麸皮80%，豆饼粉10%，玉米淀粉10%，添加等量自来水；初始PH自然。
[0077]枯草芽孢杆菌培养物的制备方法:
[0078]1.发酵液的获得:采用斜面菌种逐级扩培获得枯草芽孢杆菌发酵液；
[0079](I) 一级种子培养:将枯草芽孢杆菌斜面菌种接入500毫升摇瓶中，培养基装量100毫升，旋转式摇床180转/分，培养温度30°C，培养时间24小时；
[0080](2) 二级种子培养:将一级种子按照10%的接种量接入500毫升二级种子摇瓶中，培养条件与一级种子相同；
[0081](3)三级种子培养:将二级种子以10%接种量接入5000晕升三级种子摇瓶中，培养基装量1000毫升，旋转式摇床100转/分，培养温度30°C，培养时间24小时；
[0082](4) 一级种子罐培养:将三级种子以10%接种量接入总容积为150L的一级种子罐，发酵培养基装量100L，培养温度28°C，搅拌速度100转/分，通风量(V/V) 1:0.5，罐压0.05Mpa，培养时间24小时；
[0083](5)发酵培养:将一级种子罐菌种以10%接种量接入总容积为1.5吨二级种子罐，发酵培养基装量I吨，培养条件培养温度28°C，搅拌速度100转/分，通风量(V/V) I:0.5,罐压0.05Mpa,培养时间24小时。
[0084]培养基组成:葡萄糖6%，酵母提取物1%，蛋白胨0.2%，CaC03l%，pH6.8。
[0085]植物乳杆菌剂的制备方法:
[0086](I) 一级种子培养:将植物乳杆菌菌种接入500毫升摇瓶中，培养基装量100毫升，培养温度30°C，培养时间24小时；
[0087](2) 二级种子培养:将一级种子按照10%的接种量接入500晕升二级种子摇瓶中，培养条件与一级种子相同；
[0088](3)三级种子培养:将二级种子以10%接种量接入5000晕升三级种子摇瓶中，培养基装量1000毫升，培养温度30°C，培养时间24小时；
[0089](4) 一级种子罐培养:将三级种子以5%接种量接入总容积为150L的一级种子罐，发酵培养基装量100L，培养温度30°C，罐压0.05Mpa,培养时间18小时；
[0090](5)发酵罐培养:将一级种子罐菌种以5%接种量接入总容积为3吨二级种子罐，发酵培养基装量2吨，培养条件培养温度30°C，罐压0.05Mpa,培养时间22小时。发酵完毕发酵液经低温负压真空浓缩到原体积的45%，得到菌浓缩液。添加载体:向浓缩液中添加混合好的载体，混合均匀；浓缩液与载体的重量比为0.5:1，载体组成为:CaC0325份，糊精12份。流化床干燥，干燥温度50°C。
[0091]培养基组成为:酪蛋白胨1%，牛肉提取物I %，酵母提取物0.5%，葡萄糖0.5%，乙酸钠 0.5%,柠檬酸二胺 0.2%, Tween800.1 %，K2HPO40.2%，MgSO4.7Η200.02%，MnSO4.H2O0.005%, CaC032%, ρΗ6.8。
[0092]实施例2
[0093]基本同实施例1
[0094]提供一种绿色微生态复合肥:重量份数组成为:黑曲霉培养物5份，胶质芽孢杆菌菌剂7份，解磷巨大芽孢杆菌菌剂6份，枯草芽孢杆菌培养物12，泡盛曲霉培养物6，植物乳杆菌剂2份。
[0095]产品效果实验
[0096]试验地的选择与试验设计:试验于2009年3月20日-9月30日在宁夏盐池县花马池镇八堡村进行。
[0097]试验田达到田种植玉米10亩，分别在种植时使用本发明产品每亩0.7公斤，出苗I个月左右通过锄地松土方式使用发明产品0.6公斤，对照组使用常规肥料。
[0098]发明产品使用玉米地玉米产量达到650公斤，对照组达到510公斤；该地块在第2年种植春小麦，春小麦产量达到了 400公斤，比对照组单产提高了 20%。且试验田土壤结构良好，无大块和板结。
【主权项】
1.一种绿色微生态复合肥，重量份数组成为:黑曲霉培养物5-10份，胶质芽孢杆菌菌剂3-8份，解磷巨大芽孢杆菌菌剂3-8份，枯草芽孢杆菌培养物5-12，泡盛曲霉培养物4-7，植物乳杆菌剂2-4份；黑曲霉(Aspergillus niger)保藏号为CGMCC N0.7927。
2.根据权利要求1所述绿色微生态复合肥，所述枯草芽孢杆菌培养物制备:从斜面转接培养枯草芽孢杆菌，逐级扩培后的种子液转接入发酵罐中，发酵完毕发酵液经过板框过滤、干燥后获得枯草芽孢杆菌培养物。
3.根据权利要求1所述绿色微生态复合肥，所述枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilissubsp)为 CGMCC7926。
4.根据权利要求1所述绿色微生态复合肥，所述绿色微生态复合肥重量份数组成为:黑曲霉培养物6份，胶质芽孢杆菌菌剂5份，解磷巨大芽孢杆菌菌剂5份，枯草芽孢杆菌培养物10，泡盛曲霉培养物6，植物乳杆菌剂3份。
5.根据权利要求1所述绿色微生态复合肥，所述绿色微生态复合肥重量份数组成为:黑曲霉培养物5份，胶质芽孢杆菌菌剂7份，解磷巨大芽孢杆菌菌剂6份，枯草芽孢杆菌培养物12，泡盛曲霉培养物6，植物乳杆菌剂2份。
【专利摘要】本发明公开了一种绿色微生态复合肥及其制备方法，绿色微生态复合肥组成为：黑曲霉培养物，胶质芽孢杆菌菌剂，解磷巨大芽孢杆菌菌剂，枯草芽孢杆菌培养物，泡盛曲霉培养物，植物乳杆菌剂。本发明的肥料营养丰富，有机质含量高。能够满足有机食品的生产需要。本发明的肥料由复合微生物发酵而成，能够改善土壤的微生态环境，为农作物的生长提供有益条件。CGMCC No792720130715 CGMCC No792620130715
【IPC分类】C12R1-01, C12N1-20, C12R1-685, C12N1-14, C12R1-07, C12R1-125
【公开号】CN104673675
【申请号】CN201310636693
【发明人】李政, 张健飞, 王玉, 李绩
【申请人】天津工业大学
【公开日】2015年6月3日
【申请日】2013年11月28日