快速鉴定西瓜新品种红和平杂交种子纯度的方法以及采用的引物和试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及快速检测西瓜新品种'红和平'杂交种子纯度 的方法以及采用的引物和试剂盒。
【背景技术】
[0002] 西瓜新品种【Citrulluslanatus(Thunb. )Matsum. &Nakai】是一种重要的经济作 物。我国每年西瓜新品种种植面积约为1. 73X106hm2,总产量约为6. 28X107t，面积和产量 分别占世界的54%和60%以上，均居世界第一位。因此，西瓜新品种种子纯度对种植者来 说是必需保证的。
[0003] 西瓜新品种杂交种制种的过程中，母本和父本分别种植在不同的区域，雌花开花 前，把母本上所有的雄花都去除。开花期用父本的花粉授到母本的雌花柱头上，从而产生杂 交种。如果母本上的雄花去除不彻底，花粉就可能落到雌花柱头上产生自交种，出现杂种。 因此，杂交种必需进行种子纯度鉴定。
[0004] 传统的西瓜新品种种子纯度鉴定主要是通过将杂交种种植后对其进行形态学鉴 定。西瓜新品种的全生育期需要80~100天，漫长的生长周期易受环境影响。某些易受环 境影响的性状就会难以判定，所以需要对其品种特性极其了解的专业育种者。这些都使得 鉴定过程受到了极大的限定。为了解决传统鉴定困难的问题，农业工作者进行了研宄，其中 黄永红等采用同工酶的方法检测西甜瓜种子纯度，张国良采用叶形进行鉴定。但前者仍需 要15-20天的时间，后者不能鉴别叶形相同的亲本且对种植环境要求苛刻。
[0005] 随着分子标记的快速发展，将分子标记应用到其中将加速种子纯度的鉴定过程， 而且鉴定过程不需要特定的育种家。分子标记对种子纯度的鉴定主要是依据父母本及杂交 一代中的遗传信息存在多样性，因此鉴定过程包括分子标记所需引物的开发，DNA的提取， 筛选等等。西瓜新品种基因组测序的完成，为采用分子标记进行种子纯度鉴定提供了可能。 发明基于SSR分子标记技术的种子纯度检测方法，将对规范西瓜新品种种子产业，保护育 种者的合法权益及种植户的切身利益等都有重要的意义。
【发明内容】
[0006] 本发明针对目前西瓜新品种种子纯度鉴定大多靠田间表型观察的方法、存在受季 节限制大，鉴定所需时间长等缺陷，本发明的第一个目的是提供了一种不依赖季节、快速、 准确、低成本检测西瓜新品种"红和平"种子纯度的方法。本发明的第二个目的是提供了上 述方法采用的引物。本发明的第三个目的是提供了上述方法采用的试剂盒。
[0007]为了实现上述第一个目的，本发明采用的技术方案如下：
[0008] 西瓜新品种'红和平'种子纯度的鉴定方法，该方法包括以下步骤：
[0009] 1)西瓜新品种基因组SSR引物的开发：根据公布的西瓜新品种基因组序列进行全 序列的下载，使用Mr印s2. 5SSR序列鉴定程序，鉴定DNA序列上含SSR的序列区段，设计出 跨越SSR位点的PCR引物；
[0010] 2)单粒西瓜新品种种仁基因组DNA提取：米用SDS法提取西瓜新品种种仁基因组 DNA;对提取的DNA样品进彳丁评估；
[0011] 3)PCR反应体系及程序：在200y1PCR管中加入基因组DNA50ng、 10pm〇l/yl引物各lyl，该引物由上游引物和下游引物，所述的上游引物的序列为 5 ' -CCAAGAAACGAGAAATTCGC-3 '和下游引物 5 ' -GCAAGCTCCTCCATAAACCC-3 '，12. 5y1 混合液，混合液包括10XBuffer、dNTP、Mg2+、TaqDNA聚合酶，灭菌双蒸水补充到25y1，同时 设置空白对照实验，空白对照实验以无菌水代替基因组DNA;混匀后置于PCR反应仪上进行 扩增，PCR反应程序：94°C预变性3min;94°C变性30s，56°C退火30s，72°C延伸60s，共40个 循环；最后72°C延伸7min;4°C保存；
[0012] 4)PCR扩增产物的凝胶电泳分析：将扩增产物采用8%非变性聚丙烯酰胺凝胶进 行电泳分离，在扩增产物中加入上样缓冲液，上样于经30分钟预电泳的变性聚丙烯酰胺凝 胶上，70W恒功率电泳至溴酚蓝刚刚到达凝胶的另一端，凝胶经硝酸银染色后再可见光下观 察、照相；将PHF/PHR引物的亲本和F1电泳图绘制成标准图谱；
[0013] 5)待测样品种子纯度鉴定利用PHF/PHR引物，将待测样品种子按上述步骤制备出 指纹图谱后，再分别与'红和平'品种标准图谱进行比对；如果相同，即可确定为'红和平' 杂交种，否则为杂种；种子纯度按以下公式计算：
[0014] 种子纯度=(检测所得真种子数/检测种子总数）X100%。
[0015] 作为优选，所述的步骤2)提取西瓜新品种种仁基因组DNA的方法如下：在1. 5ml 离心管中加入200y1SDS的提取缓冲液；取1粒种子，去除种壳后放入上述缓冲液，研磨呈 糊状，用600y1SDS提取缓冲液冲洗玻璃棒；颠倒混匀后65°C水浴15min，短暂离心；加入 500y1氯仿：异戊醇=24 :1混合液，翻转混匀，12,OOOrpm离心5min，将上清转入一新的 1. 5ml的离心管中；加入500y1氯仿，翻转混勾，12,OOOrpm离心5min，将上清转入一新的 1. 5ml的离心管中；加入2. 5倍体积的无水乙醇，缓慢翻转，静置5min，10,OOOrpm，室温离心 5min，弃上清；于沉淀中加入lml70%的乙醇洗绦，12,OOOrpm离心2min。倒掉上清液，通 风干燥；加入25y1含有1y1 10mg/mlRNaseA的TE缓冲液溶解，37°C温育30min，-20°C 保存。
[0016] 作为优选，所述的步骤2)根据西瓜新品种action基因设计引物，W_actinF:5'>A ATGTGCCTGCTATGTATGTCG〈3' ；W-actinR:5' >GATGGAGTTGTAGGTAGTITCG〈3' ；对提取的DNA样 品进彳丁评估。
[0017] 为了实现上述第二个目的，本发明采用的技术方案如下：
[0018] 一种用于检测西瓜新品种'红和平'杂交种纯度的引物，该引物由上游引物和 下游引物，所述的上游引物的序列为V-CCAAGAAACGAGAAATTCGC-3 ^和下游引物V -GCAAGCTCCTCCATAAACCC-3 ' 〇
[0019] 为了实现上述第三个目的，本发明采用的技术方案如下：
[0020] 一种用于检测西瓜新品种品种"红和平"种子纯度的试剂盒，该试剂盒包括盒体 和7支PCR管及标准图谱照片；其中，在5支PCR管中分别装有MgCl2,dNTP，lOXBuffer， Taq聚合酶及1oadingbuffer，在另外2支PCR管中分别装有鉴定"红和平"西瓜新品 种种子纯度的引物：上游引物的序列为5 ' -CCAAGAAACGAGAAATTCGC-3 ^和下游引物 5 ' -GCAAGCTCCTCCATAAACCC-3 ' 〇
[0021] 本发明由于采用了上述的技术方案，本发明的优势：
[0022] 1、快速高效，该方法检测过程仅需要1-2天，且不受环境的限制；
[0023] 2、准确性高：基因组DNA不受环境的影响，避免了田间表型鉴定因为环境影响带 来的误差；
[0024] 3、操作简单：本方法所需的设备和试剂都是常规实验室拥有的，简便易行；
[0025] 4、成本低廉：该方法避免了种植西瓜新品种所需的各种设备及管理，节省了大量 的人工、土地和物力。
[0026] 本发明相比于传统田间鉴定（需要80~100天），该方法仅需1~2天，且具有不 依赖季节、快速、准确、低成本等优点，能够替代传统西瓜新品种杂交种鉴定方法。本发明可 在'红和平'的制种、繁种、经销企业推广应用。
【附图说明】
[0027] 图1为提取的西瓜新品种种仁基因组DNA1 %琼脂糖凝|父电泳和染色不意图； M:markerl:水 2-5 :种仁DNA。
[0028] 图 2 为利用引物W-actinF:5' >AATGTGCCTGCTATGTATGTCG〈3' ；W-actinR:5'>GATG GAGirGTAGGTAGITTCG〈3' ；对提取的基因组DNA进行检测的电泳图；1:marker1-5 :种子6 : 水。
[0029]图 3 为利用引物PHF:5 ' -CCAAGAAACGAGAAAITCGC-3 '和下游引物 5 ^ -GCAAGCTCCTCCATAAACCC-3 ^ ;获得的凝胶图谱；M:marker;P1 :母本；P2 :父本；1-5 : 杂交F1代。
[0030] 图4为待测样品种子制备出指纹图谱。
【具体实施方式】
[0031] 下面结合实例对本发明作进一步的说明。
[0032] 材料说明："红和平"（浙审瓜2013003)系浙江省农科院蔬菜所选育的设施西瓜新 品种。全生育期l〇〇d左右，果实发育期30d。果实圆球形，果面绿，覆深绿齿条带，有蜡粉； 果肉大红色，中心可溶性固形物含量11 %~12%，肉质致密，口感好；单瓜质量4~5kg，果 皮韧，耐贮运；易坐瓜，耐低温，中抗枯萎病，产量42t?hm-2左右，商品率高。
[0033] 实施例1用于西瓜新品种'红和平'种子纯度鉴定开发的SSR引物：
[0034] 首先，根据公布的西瓜新品种基因组序列（www.icugi.org/)进行全序列的下载。 随后