退火温度60°C 30秒，延伸温度72°C 45秒，最后延伸温度72°C 10分钟。
[0023] (三）对PCR产物进行SSCP检测判断等位基因 SSCP带型。
[0024] SSCP检测试剂为：去离子水，10%过硫酸铵（APS)，变性上样缓冲液，TEMED (四甲 基乙二胺)，非变性聚丙烯酰胺（Acr:Bis=37.5:l)，等位基因标准DNA样本。等位基因标准 DNA样本的核苷酸序列参见序列表中SEQ ID No. 1-5,与检测出的5种等位基因在序列上完 全相同。等位基因标准DNA样本是制备的单链DNA，其唯一特点是标样单链DNA在SSCP电 泳时条带非常清晰明亮，标样DNA与待检测DNA双链样本同步进行SSCP电泳时，可以用肉 眼直接比较标样DNA与待测DNA样本带型差别，以此来判断待测样本DNA是否存在特异等 位基因。
[0025] 为保证检测样本DNA等位基因判读的准确性，等位基因标准DNA与待测样本DNA 同时进行SSCP电泳，参照等位基因标准DNA样本判定检测样本等位基因类型。
[0026] SSCP检测方法为：将20 μ IPCR产物与60 μ 1变性上样缓冲液（98%去离子甲酰胺、 IOmM EDTA、0. 025%溴酚蓝、0. 025%二甲苯青FF)混合，105°C变性5分钟，立即冰浴冷却10 分钟，14%非变性聚丙烯酰胺凝胶在室温7. 5°C、冷循环4. 2°C、390V电压下电泳19小时，银 染后显色拍照。
[0027] 25ml 14%非变性聚丙烯酰胺凝胶的配置方法：40%的非变性聚丙烯酰胺8. 75毫 升、10倍TBEL 25毫升、10%APS150微升、TEMED13. 64微升和蒸馏水14. 84毫升。
[0028] (四）克隆、测序判定等位基因序列。
[0029] 具体如下： PCR产物回收纯化(按宝生物试剂盒说明书进行)、T载体连接（pGEM-T Easy载体，普 洛麦格（Promega)公司，按说明书进行操作)、感受态细胞制备和转化(大肠杆菌DH5 α感受 态试剂盒，宝生物公司，按试剂盒说明书进行)、质粒DNA提取(宝生物公司，按试剂盒说明书 进行)、重组质粒鉴定(酶切鉴定，使用限制性内切酶1)、等位基因阳性克隆的SSCP鉴 定，送北京六合华大公司测序鉴定。
[0030] (五)结果判断：电泳结果发现5种等位基因（A、B、C、D和E)，SSCP带型图如图1所 示，通过上述方法检测绵羊个体FABP4特异等位基因带型和测序，结合产肉性能表型资料， 确定影响产肉性能的特异等位基因。
[0031] 绵羊产肉性能指标(腿部肉重、腰部肉重、肩部肉重、总肉重或腿部肉比例、腰部肉 比例和肩部肉比例）中最具代表性的指标为总肉重，即腿部肉重、腰部肉重和肩部肉重总 和。等位基因 E被检出率很小，建议淘汰。表1对罗姆尼羊FABP4等位基因 A、B、C和D对 总产肉量的影响进行了分析，结果表明等位基因 A对总产肉量有显著影响（P〈0. 05)，等位 基因存在时总产肉量最高（51. 730Kg);等位基因 B和C对总产肉量有影响趋势（P〈0. 1);等 位基因 D对总产肉量无影响（P>0. 15)。
[0032] 表1 FABP4等位基因变异对罗姆尼绵羊总产肉量的影响
【主权项】
1. 一种用于绵羊肉用性能分子选种的PCR-SSCP试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括 绵羊FABP4*A和FABP4*B的标准DNA样本，所述FABP4*A标准DNA样本的核苷酸序列参见序 列表中SEQIDNo. 1，所述FABP4*B标准DNA样本的核苷酸序列参见序列表中SEQIDNo. 2。
2. -种检测和鉴别绵羊肉用性能的PCR-SSCP试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括绵 羊FABP4等位基因，所述FABP4等位基因包括FABP4*A标准DNA样本、FABP4*B标准DNA样 本、FABP4*C标准DNA样本、FABP4*D标准DNA样本和FABP4*E标准DNA样本，所述FABP4*A 标准DNA样本的核苷酸序列参见序列表中SEQIDNo. 1，所述FABP4*B标准DNA样本的核苷 酸序列参见序列表中SEQIDNo. 2,所述FABP4*C标准DNA样本的核苷酸序列参见序列表 中SEQIDNo. 3,所述FABP4*D标准DNA样本的核苷酸序列参见序列表中SEQIDNo. 4,所 述FABP4*E标准DNA样本的核苷酸序列参见序列表中SEQIDNo. 5。
3. 权利要求1所述的用于绵羊肉用性能分子选种的PCR-SSCP试剂盒的使用方法，其特 征在于：步骤如下： (1)收集并处理待测样本DNA; (2 )待测样本DNA的PCR扩增： 所用引物为：上游引物Up:TGTGGGCTTTGCTACCAG;下游引物Dn:ACTTAGATGAAGGTGCTCTG； 反应条件为：预变性95°C 5分钟，变性94°C 30秒，退火温度60°C 30秒，延伸温度72°C 45秒，最后延伸温度72°C 10分钟； SSCP电泳：将绵羊FABP4*A和FABP4*B标准DNA样本与待测样本DNA同时进行SSCP电 泳，待测样本带型与FABP4*A标准DNA样本带型一致的为高产肉性能绵羊品种，与FABP4*B 标准DNA样本带型一致的为产肉性能良好的绵羊品种。
4. 权利要求2所述的检测和鉴别绵羊肉用性能的PCR-SSCP试剂盒的使用方法，其特征 在于：步骤如下： (1)收集并处理待测样本DNA; (2 )待测样本DNA的PCR扩增： 所用引物为：上游引物Up:TGTGGGCTTTGCTACCAG;下游引物Dn:ACTTAGATGAAGGTGCTCTG； 反应条件为：预变性95°C 5分钟，变性94°C 30秒，退火温度60°C 30秒，延伸温度72°C 45秒，最后延伸温度72°C 10分钟； (3)SSCP电泳：将绵羊FABP4*A和FABP4*B标准DNA样本与待测样本DNA同时进行SSCP电泳，待测样本带型与FABP4*A标准DNA样本带型一致的产肉性能为优质；与FABP4*B标准 DNA样本和FABP4*C标准DNA样本带型一致的产肉性能为良好；与FABP4*D标准DNA样本 带型一致的产肉性能为合格；与FABP4*E标准DNA样本带型一致的产肉性能为劣。
5. -种绵羊肉用性能的检测和鉴别方法，其特征在于：步骤如下： (1) 收集并处理待测样本DNA; (2) 待测样本DNA的PCR扩增：所用引物为：上游引物Up:TGTGGGCTTTGCTACCAG;下游 引物Dn!ACTTAGATGAAGGTGCTCTG;作为优选，PCR扩增的反应条件为：预变性95°C5分钟， 变性94°C30秒，退火温度60°C30秒，延伸温度72°C45秒，最后延伸温度72°C10分钟； (3)SSCP电泳：将绵羊FABP4*A和FABP4*B标准DNA样本与待测样本DNA同时进行SSCP 电泳，待测样本带型与FABP4*A标准DNA样本带型一致的产肉性能为优质；与FABP4*B标准DNA样本和FABP4*C标准DNA样本带型一致的产肉性能为良好；与FABP4*D标准DNA样本 带型一致的产肉性能为合格；与FABP4*E标准DNA样本带型一致的产肉性能为劣。
6. -种绵羊肉用性能分子选种的方法，其特征在于：步骤如下： (1) 收集并处理待测样本DNA ; (2)待测样本DNA的PCR扩增：所用引物为：上游引物Up: TGTGGGCTTTGCTACCAG;下游 引物Dn :ACTTAGATGAAGGTGCTCTG ;作为优选，PCR扩增的反应条件为：预变性95°C 5分钟， 变性94°C 30秒，退火温度60°C 30秒，延伸温度72°C 45秒，最后延伸温度72°C 10分钟； SSCP电泳：将绵羊FABP4*A和FABP4*B标准DNA样本与待测样本DNA同时进行SSCP电 泳，待测样本带型与FABP4*A标准DNA样本带型一致的为高产肉性能绵羊品种，与FABP4*B 标准DNA样本带型一致的为产肉性能良好的绵羊品种。
7.权利要求1所述的试剂盒在绵羊肉用性能分子选种中的应用。
8.权利要求2所述的试剂盒在检测和鉴别绵羊肉用性能中的应用。
9.绵羊FABP4*A和FABP4*B标准DNA样本核苷酸序列在绵羊肉用性能分子选种及在制 备绵羊肉用性能分子选种试剂盒中的应用。
10.绵羊FABP4等位基因在检测和鉴别绵羊肉用性能及在制备检测和鉴别绵羊肉用 性能试剂盒中的应用，其中，所述绵羊FABP4等位基因的核苷酸序列为序列表中SEQ ID No. 1-5〇
【专利摘要】本发明提供一种用于绵羊肉用性能分子选种的PCR-SSCP试剂盒，所述试剂盒包括绵羊FABP4*A和FABP4*B的标准DNA样本，所述FABP4*A标准DNA样本的核苷酸序列参见序列表中SEQ ID No.1，所述FABP4*B标准DNA样本的核苷酸序列参见序列表中SEQ ID No.2。本申请人对绵羊特异主效基因FABP4进行检测，共发现5种等位基因（A、B、C、D和E），分析了5种等位基因对绵羊产肉性能指标的影响，确定绵羊高产肉性能特异等位基因：将等位基因A和B作为绵羊肉用性能基因标记，建立了绵羊肉用性能特异主效基因等位基因的标记辅助选择技术，提供了一种新的绵羊肉用性能分子选种的方法。
【IPC分类】C12Q1-68
【公开号】CN104726579
【申请号】CN201510115743
【发明人】闫伟, 罗玉柱, 胡江
【申请人】甘肃农业大学
【公开日】2015年6月24日
【申请日】2015年3月17日