一种用于绵羊肉用性能分子选种的pcr-sscp试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种用于绵羊肉用性能分子选种的PCR-SSCP试剂盒。
【背景技术】
[0002] 绵羊肉用性能(产肉量）是重要的经济性状，检测并选留具有优良肉用性能的绵羊 可以显著提高养殖户经济效益。随着现代生物技术的发展，利用分子遗传学方法能够准确 检测并选留具有优良肉用性能的绵羊。基于动物DNA序列影响表型性状的基本生物学原 理，应用现代分子遗传学方法，寻找鉴定影响绵羊肉用性能的高效特异等位基因是评价绵 羊肉用性能的有效手段之一。绵羊肉用性能(产肉量)是数量性状，受微效多基因调控，也有 效应较大的主基因 （Major gene)。目前，检测影响绵羊肉用性能的基因大多数为微效基因， 而微效基因数量大且并非随机分布，通过检测微效基因评估绵羊肉用性能的准确性不高， 多个微效基因的检测结果可能互相冲突且费时费力。而通过寻找和分析效应较大的主基因 DNA序列，检测影响绵羊产肉性能的主基因特异等位基因，可以有效提高绵羊肉用性能评估 的准确性，缩短绵羊肉用性能改良进程，进而提高绵羊个体经济效益。
【发明内容】
[0003] 本发明提供了一种用于绵羊肉用性能分子选种的PCR-SSCP试剂盒，采用绵羊肉 用性能分子标记选种技术，主要针对特异主效基因 FABP4,利用PCR-SSCP技术检测特异等 位基因，然后根据检测结果评估携带不同等位基因个体的肉用性能等级，从而判断是否留 做种用。
[0004] 绵羊FABP4基因定位于9号染色体，包括4个外显子和3个内含子，经试验验证， 其是影响绵羊肉质性状的主要候选基因之一。绵羊FABP4基因具有丰富的变异，而剖析各 个等位基因对肉用性能的影响程度有利于开发DNA标记物。
[0005] 本发明提供一种用于绵羊肉用性能分子选种的PCR-SSCP试剂盒，所述试剂盒包 括绵羊FABP4*A和FABP4*B的标准DNA样本，所述FABP4*A标准DNA样本的核苷酸序列参 见序列表中SEQ ID No. 1，所述FABP4*B标准DNA样本的核苷酸序列参见序列表中SEQ ID No. 2 〇
[0006] 本发明的第二个目的是提供一种检测和鉴别绵羊肉用性能的PCR-SSCP试剂盒， 所述试剂盒包括绵羊FABP4等位基因，所述FABP4等位基因包括FABP4*A标准DNA样本、 FABP4*B标准DNA样本、FABP4*C标准DNA样本、FABP4*D标准DNA样本和FABP4*E标准DNA 样本，所述FABP4*A标准DNA样本的核苷酸序列参见序列表中SEQ ID No. 1，所述FABP4*B 标准DNA样本的核苷酸序列参见序列表中SEQ ID No. 2,所述FABP4*C标准DNA样本的核苷 酸序列参见序列表中SEQ ID No. 3,所述FABP4*D标准DNA样本的核苷酸序列参见序列表中 SEQ ID No. 4,所述FABP4*E标准DNA样本的核苷酸序列参见序列表中SEQ ID No. 5。
[0007] 本发明的第三个目的是提供用于绵羊肉用性能分子选种的PCR-SSCP试剂盒的使 用方法，步骤如下： (I)收集并处理待测样本DNA ; (2 )待测样本DNA的PCR扩增： 所用引物为：上游引物Up: TGTGGGCTTTGCTACCAG;下游引物Dn: ACTTAGATGAAGGTGCTCTG ； 反应条件为：预变性95°C 5分钟，变性94°C 30秒，退火温度60°C 30秒，延伸温度 72°C 45秒，最后延伸温度72°C 10分钟； (3) SSCP电泳：将绵羊FABP4*A和FABP4*B标准DNA样本与待测样本DNA同时进行 SSCP电泳，待测样本带型与FABP4*A标准DNA样本带型一致的为高产肉性能绵羊品种，与 FABP4*B标准DNA样本带型一致的为产肉性能良好的绵羊品种。
[0008] 本发明的第四个目的是提供用于检测和鉴别绵羊肉用性能的PCR-SSCP试剂盒的 使用方法，步骤如下： (1)收集并处理待测样本DNA ; (2 )待测样本DNA的PCR扩增： 所用引物为：上游引物Up: TGTGGGCTTTGCTACCAG;下游引物Dn: ACTTAGATGAAGGTGCTCTG ； 反应条件为：预变性95°C 5分钟，变性94°C 30秒，退火温度60°C 30秒，延伸温度 72°C 45秒，最后延伸温度72°C 10分钟； (3)SSCP电泳：将绵羊FABP4*A和FABP4*B标准DNA样本与待测样本DNA同时进行SSCP 电泳，待测样本带型与FABP4*A标准DNA样本带型一致的产肉性能为优质；与FABP4*B标准 DNA样本和FABP4*C标准DNA样本带型一致的产肉性能为良好；与FABP4*D标准DNA样本 带型一致的产肉性能为合格；与FABP4*E标准DNA样本带型一致的产肉性能为劣。
[0009] 本发明的第五个目的是提供一种绵羊肉用性能的检测和鉴别方法，步骤如下： (1) 收集并处理待测样本DNA ; (2) 待测样本DNA的PCR扩增：所用引物为：上游引物Up: TGTGGGCTTTGCTACCAG ;下游 引物Dn !ACTTAGATGAAGGTGCTCTG ;作为优选，PCR扩增的反应条件为：预变性95°C 5分钟， 变性94°C 30秒，退火温度60°C 30秒，延伸温度72°C 45秒，最后延伸温度72°C 10分钟； (3) SSCP电泳：将绵羊FABP4*A和FABP4*B标准DNA样本与待测样本DNA同时进行SSCP 电泳，待测样本带型与FABP4*A标准DNA样本带型一致的产肉性能为优质；与FABP4*B标准 DNA样本和FABP4*C标准DNA样本带型一致的产肉性能为良好；与FABP4*D标准DNA样本 带型一致的产肉性能为合格；与FABP4*E标准DNA样本带型一致的产肉性能为劣。
[0010] 本发明的第六个目的是提供一种绵羊肉用性能分子选种的方法，步骤如下： (1) 收集并处理待测样本DNA ; (2) 待测样本DNA的PCR扩增：所用引物为：上游引物Up: TGTGGGCTTTGCTACCAG ;下游 引物Dn !ACTTAGATGAAGGTGCTCTG ;作为优选，PCR扩增的反应条件为：预变性95°C 5分钟， 变性94°C 30秒，退火温度60°C 30秒，延伸温度72°C 45秒，最后延伸温度72°C 10分钟； (3) SSCP电泳：将绵羊FABP4*A和FABP4*B标准DNA样本与待测样本DNA同时进行 SSCP电泳，待测样本带型与FABP4*A标准DNA样本带型一致的为高产肉性能绵羊品种，与 FABP4*B标准DNA样本带型一致的为产肉性能良好的绵羊品种。
[0011] 本发明的第七个目的是提供用于绵羊肉用性能分子选种的试剂盒在绵羊肉用性 能分子选种中的应用。
[0012] 本发明的第八个目的是提供检测和鉴别绵羊肉用性能的试剂盒在检测和鉴别绵 羊肉用性能中的应用。
[0013] 本发明的第九个目的是提供绵羊FABP4*A和FABP4*B标准DNA样本核苷酸序列在 绵羊肉用性能分子选种及在制备绵羊肉用性能分子选种试剂盒中的应用。
[0014] 本发明的第十个目的是提供绵羊FABP4等位基因在检测和鉴别绵羊肉用性能及 在制备检测和鉴别绵羊肉用性能试剂盒中的应用，其中，所述绵羊FABP4等位基因的核苷 酸序列为序列表中SEQ ID No. 1-5。
[0015] 本申请人对绵羊特异主效基因 FABP4进行检测，共发现5种等位基因（A、B、C、D和 E)，分析了 5种等位基因对绵羊产肉性能指标的影响，确定绵羊高产肉性能特异等位基因： 将等位基因 A和B作为绵羊肉用性能基因标记，建立了绵羊肉用性能特异主效基因等位基 因的标记辅助选择技术，提供了一种新的绵羊肉用性能分子选种的方法。
【附图说明】
[0016] 附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实 施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中： 图1为绵羊肉用性能特异主效基因等位基因 SSCP带型图。
【具体实施方式】
[0017] 以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自 常规生化试剂商店购买得到的。
[0018] 实施例1 应用本发明的试剂盒检测和鉴别绵羊肉用性能特异主效基因等位基因的方法如下： (一）收集具有产肉性能指标(腿部肉重、腰部肉重、肩部肉重、总肉重或腿部肉比例、腰 部肉比例和肩部肉比例）的绵羊DNA血样。
[0019] (二）PCR扩增所收集的DNA血样。
[0020] PCR扩增时所使用引物为： 上游引物18bp核苷酸，下游引物20bp核苷酸，扩增片段大小约为350bp，具体引物序列 如下： 上游引物 Up: TGTGGGCTTTGCTACCAG ; 下游引物 Dn :ACTTAGATGAAGGTGCTCTG。
[0021] PCR反应体系为： 10XPCR 缓冲液（2. 5mM) 2 μ I Mg2+ (3. 0 μ M) I. 2 μ I 5XQ 溶液（1.5mM) 2 μ I dNTP (150 μ Μ) 1. 2 μ 1 上下游混合引物（0. 25 μ Μ) 1 μ 1 Taq 聚合酶 0· 5U 0. 1 μ 1 模板DNA用量 1个滤纸小圆盘（I. 2mm) 去尚子水 12. 5 μ 1。
[0022] 上述特异等位基因扩增引物的PCR反应条件为：预变性95°C 5分钟，变性94°C 30秒，