香草醛合酶的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及用于产生香草醛的方法以及宿主生物，例如用于此种产生的微生物或 植物。
【背景技术】
[0002] 香草香精（Vanilla)是世界上最流行的香料化合物并用于众多的商业产品，包括 许多食物。天然香草是附生攀爬兰花类香荚兰（VanillaplanifoliaAndrews)和塔希提香 荚兰（Vanillatahitensis)的豆荚中获得的，所述香荚兰属于包括在单子叶植物内的兰目 (orderOrchidales)中的香草属（genusVanilla)。香草酸（3-甲氧基_4_羟基苯甲酸） 是从发酵的香草豆荚中获得的香草提取物中主要的香料化合物。在高浓度下，香草醛是对 活细胞有毒的。在豆荚中，所述香草醛作为无毒的植物抗菌物（phytoanticipin)香草醛葡 糖苷而积累，当组织损伤时，所述香草醛葡糖苷转化为主动防御化合物。在发酵和加工处理 香草豆荚以用作香料成分期间，将香草醛葡糖苷的主要部分水解以提供游离的香草醛。估 计香草醛的总世界市场为每年10500吨。从香草豆荚中产生天然的香草醛是一个费力、缓 慢且成本昂贵的过程。产生1千克香草醛需要约500千克的香草豆荚，对应于约40, 000朵 花的授粉。目前，全球的香草醛产量只有3%是来自香草豆荚。绝大多数香草醛是从不同的 化石碳氢化合物像丁香酚中经合成产生的或通过木质素的酸水解产生的。尚未实现利用编 码香荚兰花途径中的基因之异源表达而在微生物中通过生物技术产生香草醛，因为还未确 定基因。事实上，已经通过表达来自其他生物的基因在酵母、真菌、细菌和体外细胞培养物 中产生香草醛，所述基因编码组合以从结构上与香草醛相关的外源添加物质来形成香草醛 的酶。
[0003] 基于其碳骨架将苯丙氨酸衍生的挥发物分类为化合物。在成熟 的香草豆荚中发现的两种最丰富的化合物香草醛葡糖苷和对羟基苯甲醛葡糖苷两者都是 C6_C^合物。
[0004] 在天然香草中两种主要的芳香化合物是对-羟基苯甲醛和香草醛。因为对羟基苯 甲醛包含一些香草醛的相同结构要素，认为其是作为香草醛的前体。已经推测来自香草醛 的途径构成了所有衍生自苯丙氨酸的代谢物的代谢网格。US2003/0070188描述了可用于 在来自香荚兰（Vanillaplanifolia)的胚胎细胞培养物中产生对羟基苯甲醛的方法。在 US2003/0070188中描述了一种利用4-羟基-苯甲醛合酶（4-HBS)(将其描述为能够催化 对香豆酸的链缩短）来产生对羟基苯甲醛的方法。该文件还描述了 4-HBS在匍匐翦股颖 (creepingbentgrass)中的表达，但是并没有提供有关这种表达的结果的信息。其还描述 了在表达4-HBS的酵母中检测不到4-羟基苯甲醛。
[0005]Podstolski等在2002年描述了在存在硫醇试剂但不需要辅因子的情况下，4-轻 基-苯甲醛合酶（4-HBS)将4-香豆酸非氧化地转化为4-羟基苯甲醛。
【发明内容】
[0006] 因此，需要用于产生香草醛的方法，特别是用于在植物或微生物中产生香草醛的 方法。
[0007] 本发明提供了酶（本文中定名为香草醛合酶），所述酶能够将阿魏酸或阿魏酸衍 生物转变成香草醛。可将这种酶用于在许多不同的宿主生物中以及在体外产生香草醛。
[0008] 因此，本发明的一个方面是提供从阿魏酸产生香草醛的方法，其中所述方法包括 使用表达香草醛合酶的宿主生物，并且其中可将所述阿魏酸添加至所述宿主生物或者所述 宿主生物能够产生阿魏酸。
[0009] 因此，本发明提供了产生香草醛的方法，所述方法包括：
[0010] a)提供微生物，其中所述微生物
[0011] i.能够产生阿魏酸；并且
[0012] ii.包含编码SEQIDN0 :1的香草醛合酶（VpVAN)或与其共享至少80%序列同一 性的其功能同源物的异源核酸；以及
[0013] b)在支持所述微生物生长的培养基中培养所述微生物；
[0014] c)从所述微生物和/或从所述培养基中分离香草醛和/或香草醛葡糖苷。
[0015] 本发明还提供了产生香草醛、香草醇、香草醛葡糖苷和/或香草醇葡糖苷的方法， 所述方法包括：
[0016] a)提供微生物，其中所述微生物
[0017] i.能够产生阿魏酸和/或阿魏酸衍生物；并且
[0018] ii.包含编码香草醛合酶的异源核酸，其中所述香草醛合酶是能够催化阿魏酸的 侧链断裂以形成香草醛的酶；以及
[0019] b)在支持所述微生物生长的培养基中培养所述微生物；
[0020] c)从所述微生物和/或从所述培养基中分离香草醛和/或香草醛葡糖苷。
[0021] 本发明的另一个方面是提供微生物，其中所述微生物
[0022] i?能够产生阿魏酸；并且
[0023] ii.包含编码香草醛合酶的异源核酸，其中所述香草醛合酶是能够催化阿魏酸的 侧链断裂以形成香草醛的酶，例如SEQIDN0 :1的VpVAN或与其共享至少70%、例如至少 80%的序列同一性的其功能同源物。
[0024] 本发明的另一个方面是提供产生香草醛的方法，所述方法包括以下步骤：
[0025] a)提供微生物，其中所述微生物包含编码SEQIDN0 :1的香草醛合酶（VpVAN)或 与其共享至少80%序列同一性的其功能同源物的异源核酸；以及
[0026] b)在阿魏酸和/或阿魏酸衍生物的存在下，在支持所述微生物生长的培养基中培 养所述微生物；以及
[0027] c)从所述微生物和/或从所述培养基中分离香草醛和/或香草醛葡糖苷。
[0028] 本发明的另一个方面是提供产生香草醛、香草醇、香草醛葡糖苷和/或香草醇葡 糖苷的方法，所述方法包括以下步骤：
[0029] a)提供微生物，其中所述微生物包含编码香草醛合酶的异源核酸，其中所述香草 醛合酶是能够催化阿魏酸的侧链断裂以形成香草醛的酶；以及
[0030] b)在阿魏酸和/或阿魏酸衍生物的存在下，在支持所述微生物生长的培养基中培 养所述微生物；以及
[0031] c)从所述微生物和/或从所述培养基中分离香草醛、香草醇、香草醇葡糖苷和/或 香草醛葡糖苷。
[0032] 本发明的另一个方面是提供用于产生香草醛的方法，所述方法包括：
[0033]a)提供阿魏酸和/或阿魏酸衍生物，
[0034]b)使所述阿魏酸和/或阿魏酸衍生物与香草醛合酶相接触，其中所述香草醛合酶 是能够催化阿魏酸的侧链断裂以形成香草醛的酶，例如SEQIDN0 :1的（VpVAN)或与其共 享至少80%序列同一性的其功能同源物，
[0035] 从而产生香草醛。
[0036] 本发明的另一个方面是提供产生香草醛的方法，所述方法包括：
[0037]a)提供包含编码SEQIDN0 :1的VpVAN或与其共享至少80%序列同一性的其功 能同源物的异源核酸的植物；以及
[0038] b)培养所述植物；以及
[0039] c)从所述植物中分离香草醛。
[0040] 本发明的另一个方面是提供产生香草醛、香草醇、香草醛葡糖苷和/或香草醇葡 糖苷的方法，所述方法包括：
[0041] a)提供包含编码香草醛合酶的异源核酸的植物，其中所述香草醛合酶是能够催化 阿魏酸的侧链断裂以形成香草醛的酶；以及
[0042] b)培养所述植物；以及
[0043]c)从所述植物中分离香草醛、香草醇、香草醇葡糖苷和/或香草醛葡糖苷。
[0044] 本发明的又一个方面是提供产生动物饲料的方法，所述方法包括：
[0045]a)提供包含编码香草醛合酶的异源核酸的植物，其中所述香草醛合酶是能够催化 阿魏酸的侧链断裂以形成香草醛的酶，例如SEQIDN0 :1的VpVAN或与其共享至少80%序 列同一性的其功能同源物；以及
[0046] b)培养所述植物；以及
[0047] c)将所述植物加工成动物饲料。
[0048] 本发明的另一个方面是提供产生食物产品的方法，所述方法包括：
[0049]a)提供包含可食用部分的植物，其中所述植物包含编码香草醛合酶的异源核酸， 其中所述香草醛合酶是能够催化阿魏酸的侧链断裂以形成香草醛的酶，例如SEQIDN0 :1 的VpVAN或与其共享至少80%序列同一性的其功能同源物；以及
[0050] b)培养所述植物；以及
[0051] c)收获所述可食用部分；
[0052] 从而得到具有香草醛口味的食物产品。
【附图说明】
[0053] 图1示出了来自体外供应的VpVAN的LC-MS色谱图。该图示出所述酶能够催化阿 魏酸断裂两个碳成为香草醛。该反应不需要CoASH、ATP和NAD+作为辅因子。具有在30°C 下在2. 5mMDTT中用5mM阿魏酸供应1小时的VpVAN之蛋白质溶液的离子色谱图。此外， 在ATP、NAD+的存在下，VAN能够催化阿魏酸CoA断裂两个碳成为香草醛。具有在30°C下在 2. 5mMDIT、0.ImMATP和0.ImMNAD+中用5mM阿魏酸CoA供应1小时的VAN