一种dna三维纳米结构人工酶前体及其制备与应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及生物技术领域，具体设及一种DNAS维纳米结构人工酶前体及其制备 与应用。
【背景技术】
[0002] 人工酶在生物医学和化学工业等领域研究中拥有巨大的应用潜力，同时它也是科 学家研究蛋白质催化原理的重要工具。天然酶是生物长期进化的结果，而人工酶则是科学 家通过模拟生物进化的过程，按照蛋白质的形成规律，从而达到改造蛋白质的目的而构建 的。人工酶的构建不仅使我们能够充分地利用自然界存在的基因和蛋白质，而且还能在分 子水平上对蛋白质进行设计和改造，在短期内完成自然界几百万年进化才能完成的过程， 进而创造出自然界不存在的蛋白质。传统的人工酶是通过基因工程的手段构建的，该方法 不仅繁琐、耗时而且进化效果与预期相差甚远，经常需要重新设计并进行改造，从而导致需 要经历多次实践摸索才能达到改进蛋白质性能的目标。科学家们常用的构建人工酶的方法 是将一个天然酶的催化活性中屯、迁移到另一个生物分子或人工分子骨架上，从而形成新的 人工酶。
[0003] 某些核酸和酶蛋白一样，也具有催化作用，我们称之为核酸酶。G-四链体 (G-qua化uplex)是一段富G碱基的DNA序列。它可W与辅酶血红素化emin)结合，形成具 有过氧化物酶催化活性的复合物（简称为G4-DNAzyme)。该酶已被广泛用于生物分子、金属 离子W及基因的检测中。虽然核酶并不具有蛋白质一样的高度多样化的功能基团且催化能 力较弱，但由于核酸比蛋白质性质稳定、结构简单、容易贬存而且制备简单，因此人们一直 致力于研究并改进该些核酸酶，期望提高其底物特异性和催化活性，从而使其能够应用于 工业生产中。根据调查研究，推测该些核酸酶的催化活性较低，是由于没有精妙的生物分子 骨架为其提供足够的化学环境，从而降低其稳定性W及催化能力。因此，可W为核酸酶构建 一个精密坚固的骨架W提高该些核酸酶的催化活性。
[0004] DNA纳米技术的出现为达到上述目的提供了新的解决方法。它使得我们不仅可W 构建具有动态结构的dm纳米结构，而且可W控制其形态W及性质。同时该些构建的DNA纳 米结构不仅能够跨越S维空间的界限，而且生物相容性好，因此它们已经成为蛋白质、DNA、 RNA、纳米颗粒化及药物等生物分子的优良载体。其中，四面体DNA则是现有的纳米结构中 最成熟和稳定的DNA纳米结构。它最早是由英国牛津大学的化bedield小组在2004年设 计并构建的。该DNA四面体是由4条DNA单链组成，每条DNA单链长度均为55个碱基，每 条棱为17个碱基杂交形成的双链，所构成的直径为7皿左右的正四面体S维结构。利用 碱基互补的特性，只需要经过一个简单的退火过程，即可在十分钟内完成自组装过程。由于 DNA四面体设计简单、制备容易、结构及性质稳定并且形状可控，因此它被认为是蛋白、纳米 颗粒、适配体W及microRNA的优良载体。2005年，Goodman等又进一步优化和改进，使得四 面体的组装效率可W高达95 %，并且具有良好的机械刚性。2006年化be计ield利用DNA 双链结构的稳定性和周期性的特点，成功地将细胞色素C修饰在DNA四面体的空腔内，可 W调控细胞色素C与外界生物分子的作用，具有潜在的生物医学应用。2010年樊春海课题 组将DNA四面体进行修饰，使其S个顶点带上琉基，与金电极相互作用连接到电极上，发展 了一种基于DNA四面体纳米结构的分子传感平台。2010年Willner等将G-四链体DNA酶 (G4-DNAzyme)组装在金电极，揭示了它的生物电催化能力和催化还原&〇2的活性，被用来 开发电化学传感器追踪葡萄糖氧化酶的活性W及检测DNA或低分子量底物（AMP)。该种方 法的优势是无需对DNA酶-底物进行巧光标记；DNA酶组装在金电极上形成单层结构，减少 了传感矩阵的容量，还可W再生传感表面；普通的光学传感平台缺少一个放大元件，DNA酶 电催化的特性可W放大传感事件。电化学检测方法具有操作简单、快速、灵敏、准确、仪器简 便、易于微型化、集成化、能耗低、适用于即时检测、床边检测等独特的优势，因而在临床检 巧。、科学研究中具有非常大的潜力。
【发明内容】
[0005] 鉴于W上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种DNA四面体纳米结构 人工酶前体，所述DNA四面体纳米结构人工酶前体相对于传统核酶，具有稳定性好，催化活 性高，灵敏度高的优点。
[0006] 本发明的另一目的在于提供所述DNA四面体纳米结构人工酶前体的制备方法及 其应用。
[0007] 本发明是通过W下技术方案实现的：
[000引本发明的第一方面，提供了一种DNA四面体纳米结构人工酶前体，所述DNA四面体 纳米结构人工酶前体包括一个DNA四面体骨架和连接在所述DNA四面体骨架上的一段核酸 酶核巧酸，所述DNA四面体纳米结构人工酶前体由分别记为S1、S2、S3、S4的四条单链DNA 自组装形成且具有一个四面体底座，所述四条单链DNA中的一条单链DNA S1的5'端延伸 出来一段核酸酶核巧酸。
[0009] 优选地，所述核酸酶核巧酸为自由的G四链体的核巧酸，其序列如SEQ ID NO. 1所 巧，具体为；GGGTAGGGCGGGTTGGGo
[0010] 优选地，所述四条单链DM中的一条单链DM S2的核巧酸序列如SEQ ID NO. 2所 示，具体为：
[001U CATGCGAGGGTCCAATACCGACGATTACAGCTTGCTACACGATTCAGACTTAGGAATGTTCG。
[0012] 优选地，所述S2的5'端修饰了琉基。得到的S2的整体结构为：
[0013] SH-C6-CATGCGAGGGTCCAATACCGACGATTACAGCTTGCTACACGATTCAGACTT AGGAATGTTCG。甜是指琉基，C6是指6个邸2。
[0014] 优选地，所述四条单链DNA中的一条单链DNA S3的核巧酸序列如SEQ ID NO. 3所 示，具体为：
[00巧]CTACTATGGCGGGTGATAAAACGTGTAGCAAGCTGTAATCGACGGGAAGAGCATGCCCATCC。
[0016] 优选地，所述S3的5'端修饰了琉基。得到的S3的整体结构为：
[0017] SH-Ce-CTACTATGGCGGGTGATAAAACGTGTAGCAAGCTGTAATCGACGGGAAGA GCATGCCCATCC。 甜是指琉基，Ce是指6个邸2。
[0018] 优选地，所述四条单链DNA中的一条单链DNA S4的核巧酸序列如SEQ ID NO. 4所 示，具体为：
[0019] CGGTATTGGACCCTCGCATGACTCAACTGCCTGGTGATACGAGGATGGGCATGCTCTTCCCG。
[0020] 优选地，所述S4的5'端修饰了琉基。得到的S4的整体结构为：
[002U SH-Ce-CGGTATTGGACCCTCGCATGACTCAACTGCCTGGTGATACGAGGATGGGCA TGCTCTTCCCG。 甜是指琉基，Ce是指6个邸2。
[002引优选地，5'端延伸出来一段核酶核巧酸序列的单链DNAS1的核巧酸序列如SEQID NO. 5~9所示。
[002引优选地，S1的核巧酸序列如SEQIDNO. 5所示，具体为：
[0024] GGGTAGGGCGGGTTGGGCCAGGCAGTTGAGACGAACATTCCTAAGTCTGAAATTTATCACCCGCCATAG TAGACGTATCA。
[0025] 此时，S1与S2、S3和S4自组装形成的DNA四面体纳米结构人工酶前体，其G四链 体位于DNA四面体骨架底座的内部。
[0026] 优选地，S1的核巧酸序列如SEQIDNO. 6所示，具体为；
[0027] GGGTAGGGCGGGTTGGGCAGTTGAGACGAACATTCCTAAGTCTGAAATTTATCACCCGCCATAGTAGAC GTATCACCAGGo
[002引此时，S1与S2、S3和S4自组装形成的DNA四面体纳米结构人工酶前体，其G四链 体位于DNA四面体骨架底座的外部。
[0029] 优选地，S1的核巧酸序列如SEQIDNO. 7所示，具体为：
[0030] GGGTAGGGCGGGTTGGGAGTCTGAAATTTATCACCCGCCATAGTAGACGTATCACCAGGCAGTTGAGAC GAACATTCCTA。
[0031] 此时，S1与S2、S3和S4自组装形成的DNA四面体纳米结构人工酶前体，其G四链 体位于DNA四面体骨架侧面的外部。
[003引优选地，S1的核巧酸序列如SEQIDNO. 8所示，具体为；
[0033] GGGTAGGGCGGGTTGGGTCCTAAGTCTGAAATTTATCACCCGCCATAGTAGACGTATCACCAGGCAGTT GAGACGAACAT。
[0034] 此时，S1与S2、S3和S4自组装形成的DNA四面体纳米结构人工酶前体，其G四链 体位于DNA四面体骨架侧面的内部。
[0035] 优选地，S1的核巧酸序列如SEQ ID NO. 9所示，具体为：
[00化]GGGTAGGGCGGGTTGGGATTTATCACCCGCCATAGTAGACGTATCACCAGGCAGTTGAGACGAACATTC CTAAGTCTGAA。
[0037]此时，S1与S2、S3和S4自组装形成的DNA四面体纳米结