检测TLR2/4介导的NF-κB信号通路中关键分子含量的特异性引物、扩增程序及定量试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及生物技术领域，是一种基于聚合酶链式反应（PCR)的分子生物学方法， 特别是设及巧光定量聚合酶链式反应（Q-PCR)。
【背景技术】
[0002]NF-kB信号通路的作用十分广泛，尤其是在天然抗病毒免疫防御中起到重要的作 用。根据目前的研究表明，病毒可W通过激活NF-KB信号通路，进而诱导固有免疫功能改 变，目前研究病毒致病或者感染机制中更注重宿主在病毒感染过程中免疫反应变化。在病 毒感染机体后，快速有效的检测NF-KB通路中关键分子的差异性表达对我们研究病毒的 感染机制是非常必要的，但是目前的检测方法由于技术缺陷、操作繁琐、试验时间长、无标 准化、成本高等原因让试验者面临很大的困难。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的是开发出一种准确、快速、简单费用低廉的检测化R2/4介导的 MyD88依赖型NF-KB信号通路中关键分子mRNA表达水平的技术。本发明基于巧光定量，通 过一整套的特异引物进行巧光定量分析，进行相对定量的检测，解决了目前对化R2/4介导 的MyD88依赖型NF-KB信号通路中关键分子快速检测的技术瓶颈。同时，我们对检测的关 键分子在96孔板上进行合理排布，使其得到更加充分的利用，能过更加高效的进行研究分 析。
[0004] 本发明的技术方案是： 一种检测化R2/4介导的NF-KB信号通路中关键分子含量的特异性引物，序列如下： 用于对化R2进行定量PCR的特异性引物，序列如SEQIDNO;1、SEQIDNO;2所示，该 序列与猪化R2mRNA的一段互补； 用于对化R4进行定量PCR的特异性引物，序列如SEQIDNO;3、SEQIDNO;4所示，该 序列与猪I^RAniRNA的一段互补； 用于对TIRAP进行定量PCR的特异性引物，序列如SEQIDN0;5、SEQIDN0;6所示， 该序列与猪TIRAPmRNA的一段互补； 用于对IRAKI进行定量PCR的特异性引物，序列如SEQIDNO;7、SEQIDNO;8所示， 该序列与猪IRAKlmRNA的一段互补； 用于对1^1(4进行定量口0?的特异性引物，序列如569 10^;9、569 10^;10所示， 该序列与猪IRAK4mRNA的一段互补； 用于对TRAF6进行定量PCR的特异性引物，序列如SEQIDN0;11、SEQIDN0;12所示， 该序列与猪TRAF6mRNA的一段互补； 用于对MyD88进行定量PCR的特异性引物，序列如SEQIDN0;13、SEQIDN0;14所示， 该序列与猪MyD88mRNA的一段互补； 用于对TAKl进行定量PCR的特异性引物，序列如SEQIDNO;15、SEQIDNO;16所示， 该序列与猪TAKlmRNA的一段互补； 用于对TAB2进行定量PCR的特异性引物，序列如SEQIDNO;17、SEQIDNO;18所示， 该序列与猪TAB2mRNA的一段互补； 用于对TAB3进行定量PCR的特异性引物，序列如SEQIDNO;19、SEQIDNO;20所示， 该序列与猪TABSmRNA的一段互补； 用于对RELA进行定量PCR的特异性引物，序列如SEQIDNO;21、SEQIDNO;22所示， 该序列与猪RELAmRNA的一段互补； 用于对IkBa进行定量PCR的特异性引物，序列如SEQIDNO; 23、SEQIDNO; 24所 示，该序列与猪IkBamRNA的一段互补； 用于对IKKa进行定量PCR的特异性引物，序列如SEQIDN0;25、SEQIDN0;26所示， 该序列与猪IKKamRNA的一段互补； 用于对TRIF进行定量PCR的特异性引物，序列如SEQIDNO;27、SEQIDNO;28所示， 该序列与猪TRIFmRNA的一段互补； 用于e-Actin对进行定量PCR的特异性引物，序列如SEQIDN0;29、SEQIDN0;30所 示，该序列与猪0-ActinmRNA的一段互补。
[0005] 一种检测化R2/4介导的NF-kB信号通路中关键分子含量的扩增程序，95°C预变 性30s;进行40个循环扩增；95°C变性15s，60°C延伸30s，同时采集巧光信号强度。
[0006] 含有权利要求1所述的检测化R2/4介导的NF-KB信号通路中关键分子含量的 特异性引物的定量试剂盒，试剂盒包含巧光定量反应预混酶和含有引物的巧光定量96孔 反应板，试剂盒由下述部分组成；2. 5mL巧光定量预混酶；3mL无菌水；含有特异性引物的 PCR96孔反应板一块。
[0007] 一种快速检测对化R2/4介导的MyD88依赖型NF-KB信号通路中关键分子相对 含量的技术，可W反映机体或者是体外培养的细胞在病毒感染的不同阶段NF-KB信号通 路中关键分子的表达情况。设计了 15对特异性引物，分别为；TLR2、化R4、TIRAP、IRAKI、 1^1(4、1^。6、]\17〇88、141(1、1482、1483、11?^、1邸〇、1^^\、11〇6〇、6-4別111。配套此检测 的内参引物e-Actin，用于巧光定量分析。mRNA检测扩增程序，用于化R2/4介导的MyD88 依赖型NF-KB信号通路中关键分子化32、TLR4、TIRAP、IRAK1、IRAK4、TRAF6、MyD88、TAK1、 TAB2、TAB3、TRIF、I邸a、RELA、IKBa、P-Actin的检测，W达到同时检测15种关键分子 的目的。
[000引一种用于化R2/4介导的MyD88依赖型NF-KB信号通路中关键分子检测的相对定 量检测试剂盒，试剂盒内巧光定量反应预混酶和巧光定量反应96孔板，试剂盒由下述试剂 组成；2. 5mL巧光定量预混酶；3mL无菌水；含有引物的PCR96孔反应板一块。
[0009] 本发明的有益效果是；TLR2/4介导的MyD88依赖型NF-KB信号通路中关键分子 的差异表达在抗病毒的研究中有着至关重要的作用，对病毒性疾病的防治具有重要意义。 已经表明，多种病毒性疾病在感染机体的过程中引起化R2/4介导的MyD88依赖型NF-KB 信号通路中关键分子mRNA表达，通过本发明设计，各种引物的反应温度都进行了标准化， 片段长度也进行了标准化，所有的mRNA定量均可W在相同条件下完成，使不同的实验间具 有可比性。本发明能够建立在mRNA检测的巧光定量PCR技术平台上，不仅可W缩短实验 时间，减少实验经费使用，提高实验结果的准确性和说服力，提供一个全新的检测标准和评 估体系。通过病毒感染后组织采样或者人工培养细胞系快速完成总RNA的提取，并于巧光 定量PCR上进行检测。总结也上过程可W发现，此方法可W有效的缩短实验时间、减少经 费的使用等。通过优化的实验反应体系和反应条件，组成检测灵敏、方便的试剂盒，为检测 化R2/4介导的MyD88依赖型NF-KB信号通路中关键分子提供可靠的检测技术。
[0010] 通过建立巧光定量PCR技术平台，开发出便捷的检测方法。该方法依靠PCR技术的 高灵敏性和巧光定量技术，可W-次性对化R2/4介导的MyD88依赖型NF-KB信号通路中 的多个关键分子基因进行相对定量，检测病毒感染后不同时期TLR2/4介导的MyD88依赖型 NF-KB信号通路中关键分子的表达量的差异，并通过巧光定量的方法将结果直观的表现出 来，W更加简便快捷的研究病毒的致病机制。
[0011] 通过对感染病毒机体组织或者体外感染细胞，完成RNA的提取，在巧光定量PCR仪 上进行检测，快速获得结果。该个过程可W有效的缩短实验时间，减少经费使用和试剂仪器 使用。本发明可W同时检测多种mRNA的动态变化，使的原来很难采用统一常规技术检测的 一组数据可W通过标注化的试剂盒在短时间内得到表达差异，并完成定量分析。
【附图说明】
[0012] 图1为96孔反应板的整体布局； 图2为标本化R2检测的溶解曲线； 图3为标本化R4检测的溶解曲线； 图4为TIRAP检测的溶解曲线； 图5为IRAKI检测的溶解曲线； 图6为IRAK4检测的溶解曲线； 图7为TRAro检测的溶解曲线； 图8为MyD88检测的溶解曲线； 图9为TAK1检测的溶解曲线； 图10为TAB2检测的