溶解曲线； 图11为TAB3检测的溶解曲线； 图12为TRIF检测的溶解曲线； 图13为IKKa检测的溶解曲线； 图14为RELA检测的溶解曲线； 图15为iKBa检测的溶解曲线； 图16为e-Actin检测的溶解曲线。
【具体实施方式】
[001引 WGenbank公布的引物序列为参考，从NCBI上下载已知序列使用DNASTAR软件进 行序列比对，选取针对各个祀基因高度保守与特异的基因片段，用Premier软件设计了相 关引物，引物方向均为5' -3'，具体序列如下： 用于对化R2进行定量PCR的特异性引物，序列如SEQIDNO;1、SEQIDNO;2所示，该 序列与猪化R2mRNA的一段互补； 用于对化R4进行定量PCR的特异性引物，序列如SEQIDNO;3、SEQIDNO;4所示，该 序列与猪TlRAniRNA的一段互补； 用于对TIRAP进行定量PCR的特异性引物，序列如SEQIDN0;5、SEQIDN0;6所示， 该序列与猪TIRAPmRNA的一段互补； 用于对IRAKI进行定量PCR的特异性引物，序列如SEQIDNO;7、SEQIDNO;8所示， 该序列与猪IRAKlmRNA的一段互补； 用于对1^1(4进行定量口0?的特异性引物，序列如569 10^;9、569 10^;10所示， 该序列与猪IRAK4mRNA的一段互补； 用于对TRAF6进行定量PCR的特异性引物，序列如SEQIDN0;11、SEQIDN0;12所示， 该序列与猪TRAF6mRNA的一段互补； 用于对MyD88进行定量PCR的特异性引物，序列如SEQIDN0;13、SEQIDN0;14所示， 该序列与猪MyD88mRNA的一段互补； 用于对TAK1进行定量PCR的特异性引物，序列如SEQIDNO;15、SEQIDNO;16所示， 该序列与猪TAKlmRNA的一段互补； 用于对TAB2进行定量PCR的特异性引物，序列如SEQIDNO;17、SEQIDNO;18所示， 该序列与猪TAB2mRNA的一段互补； 用于对TAB3进行定量PCR的特异性引物，序列如SEQIDNO;19、SEQIDNO;20所示， 该序列与猪TABSmRNA的一段互补； 用于对RELA进行定量PCR的特异性引物，序列如SEQIDNO;21、SEQIDNO;22所示， 该序列与猪RELAmRNA的一段互补； 用于对IkBa进行定量PCR的特异性引物，序列如SEQIDNO; 23、SEQIDNO; 24所 示，该序列与猪IKBamRNA的一段互补； 用于对IKKa进行定量PCR的特异性引物，序列如SEQIDN0;25、SEQIDN0;26所示， 该序列与猪IKKamRNA的一段互补； 用于对TRIF进行定量PCR的特异性引物，序列如SEQIDNO;27、SEQIDNO;28所示， 该序列与猪TRIFmRNA的一段互补； 用于e-Actin对进行定量PCR的特异性引物，序列如SEQIDN0;29、SEQIDN0;30所 示，该序列与猪0-ActinmRNA的一段互补。
[0014] 一种检测化R2/4介导的NF-kB信号通路中关键分子含量的扩增程序，95°C预变 性30s;进行40个循环扩增；95°C变性15s，60°C延伸30s，同时采集巧光信号强度。
[0015] 含有权利要求1所述的检测化R2/4介导的NF-KB信号通路中关键分子含量的 特异性引物的定量试剂盒，试剂盒包含巧光定量反应预混酶和含有引物的巧光定量96孔 反应板，试剂盒由下述部分组成；2. 5mL巧光定量预混酶；3mL无菌水；含有特异性引物的 PCR96孔反应板一块。
[0016] 图1为96孔反应板的整体布局。举例说明；A1-3,表示A1、A2、A3S孔；TLR2，表 示A1-3中所含的为检测化R2的特异性引物；阴性对照，表示该孔不含有特异性引物，作空 白对照用。
[0017] 表1 96孔反应板的各孔中引物的分布情况
【主权项】
1. 一种检测TLR2/4介导的NF-KB信号通路中关键分子含量的特异性引物，其特征在 于序列如下： 用于对TLR2进行定量PCR的特异性引物，序列如SEQIDNO:1、SEQIDNO:2所示，该 序列与猪TLR2mRNA的一段互补； 用于对TLR4进行定量PCR的特异性引物，序列如SEQIDNO:3、SEQIDNO:4所示，该 序列与猪TLR4mRNA的一段互补； 用于对TIRAP进行定量PCR的特异性引物，序列如SEQIDNO:5、SEQIDNO:6所示， 该序列与猪TIRAPmRNA的一段互补； 用于对IRAKI进行定量PCR的特异性引物，序列如SEQIDNO:7、SEQIDNO:8所示， 该序列与猪IRAKlmRNA的一段互补； 用于对IRAK4进行定量PCR的特异性引物，序列如SEQIDNO:9、SEQIDNO: 10所示， 该序列与猪IRAK4mRNA的一段互补； 用于对TRAF6进行定量PCR的特异性引物，序列如SEQIDN0:11、SEQIDN0:12所示， 该序列与猪TRAF6mRNA的一段互补； 用于对MyD88进行定量PCR的特异性引物，序列如SEQIDN0:13、SEQIDN0:14所示， 该序列与猪MyD88mRNA的一段互补； 用于对TAKl进行定量PCR的特异性引物，序列如SEQIDNO:15、SEQIDNO: 16所示， 该序列与猪TAKlmRNA的一段互补； 用于对TAB2进行定量PCR的特异性引物，序列如SEQIDNO:17、SEQIDNO:18所示， 该序列与猪TAB2mRNA的一段互补； 用于对TAB3进行定量PCR的特异性引物，序列如SEQIDNO:19、SEQIDNO:20所示， 该序列与猪TAB3mRNA的一段互补； 用于对RELA进行定量PCR的特异性引物，序列如SEQIDNO:21、SEQIDNO:22所示， 该序列与猪RELAmRNA的一段互补； 用于对IKBa进行定量PCR的特异性引物，序列如SEQIDNO: 23、SEQIDNO: 24所 示，该序列与猪IKBamRNA的一段互补； 用于对IKKa进行定量PCR的特异性引物，序列如SEQIDNO:25、SEQIDNO:26所示， 该序列与猪IKKamRNA的一段互补； 用于对TRIF进行定量PCR的特异性引物，序列如SEQIDNO:27、SEQIDNO:28所示， 该序列与猪TRIFmRNA的一段互补； 用于0-Actin对进行定量PCR的特异性引物，序列如SEQIDNO:29、SEQIDNO:30所 示，该序列与猪0-ActinmRNA的一段互补。
2. -种检测TLR2/4介导的NF-KB信号通路中关键分子含量的扩增程序，其特征在于： 95°C预变性30s;进行40个循环扩增：95°C变性15s，60°C延伸30s，同时采集荧光信号强 度。
3. 含有权利要求1所述的检测TLR2/4介导的NF-KB信号通路中关键分子含量的特异 性引物的定量试剂盒，其特征在于：试剂盒包含荧光定量反应预混酶和含有引物的荧光定 量96孔反应板，试剂盒由下述部分组成：2. 5mL荧光定量预混酶；3mL无菌水；含有特异 性引物的PCR96孔反应板一块。
【专利摘要】本发明公开了一种检测TLR2/4介导的NF-κB信号通路中关键分子含量的特异性引物，序列如下：用于对TLR2进行定量PCR的特异性引物，序列如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2所示，该序列与猪TLR2mRNA的一段互补。本发明的有益效果是：TLR2/4介导的MyD88依赖型NF-κB信号通路中关键分子的差异表达在抗病毒的研究中有着至关重要的作用，对病毒性疾病的防治具有重要意义。通过本发明设计，各种引物的反应温度都进行了标准化，片段长度也进行了标准化，所有的mRNA定量均可以在相同条件下完成，使不同的实验间具有可比性。
【IPC分类】C12N15-11, C12Q1-68
【公开号】CN104774935
【申请号】CN201510154093
【发明人】宋月, 魏战勇, 杨国宇, 徐端红, 索江华, 郑兰兰
【申请人】河南农业大学
【公开日】2015年7月15日
【申请日】2015年4月2日