一种通过检测胚芽鞘内病毒增殖速度快速评价水稻srbsdv品种抗性的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及农业科学技术领域，具体地说是一种通过检测胚芽鞘内病毒增殖速度 快速评价水稻SRBSDV品种抗性的方法。
【背景技术】
[0002] 水稻是被子植物门单子叶植物纲莎草目禾本科稻属植物。水稻是最主要的三大 粮食作物之一，播种面积占粮食播种面积的1/5,年产量约4. 8亿吨，占世界粮食总产量的 1/4,全世界二分之一以上的人口以水稻为主食，同时也是我国最主要的栽培作物之一。水 稻原产亚洲热带，是世界主要粮食作物之一。我国水稻播种面占全国粮食作物的1/4,而产 量则占一半以上。栽培历史已有6000-7000年。为重要粮食作物；除食用颖果外，可制淀 粉、酿酒、制醋，米糠可制糖、榨油、提取糠醛，供工业及医药用；稻杆为良好饲料及造纸原料 和编织材料，谷芽和稻根可供药用，在粮食产业安全、加工制造生产中具有重要地位。
[0003] 南方水稻黑条矮缩病是在2001年首次在我国广东省阳西县由周国辉等发现、鉴 定和命名。病害名称中的"黑条矮缩"表示病害的典型症状，即病株矮缩和茎杆表面有黑 色条状排列的小瘤突。"南方"代表该病害首次发现于华南地区，且主要发生于南方稻区。 其田间症状类似于水稻黑条矮缩病，而后者主要发生于气温较低的小麦-水稻种植区。感 染该病的水稻植株矮缩，不抽穗或抽穗困难，籽粒少且不饱满，对产量造成严重损失。南方 水稻黑条矮缩病毒是由南方水稻黑条矮缩病毒（Southern rice black-streaked dwarf virus，SRBSDV)引起的，SRBSDV是呼肠孤病毒科斐济病毒属的一个种，与水稻黑条矮缩病毒 同属不同种。由水稻黑条矮缩病毒引起的水稻黑条矮缩病主要由白背飞虱以持久性方式传 播，自然寄主包括玉米、水稻和小麦等禾本科作物，而由南方水稻黑条矮缩病毒引起的南方 水稻黑条矮缩病主要由白背飞虱带毒传播，是近年来造成越南北部和我国南方省区水稻矮 缩病的主要病原。
[0004] 近年来，南方水稻黑条矮缩病在国内的海南、两广、湖南、江西、江浙以及国外的越 南等地暴发成灾，据不完全统计，2009年受害面积超过30万hm，约6500hm水稻失收。2011 年，农业部成立了南方水稻黑条矮缩病联防联控协作组和专家指导组。加强了对病害的防 控力度，发病面积控制在24. 67万hm左右。2012年病害有所回升，发病面积约40万hm。该 病在我国广东、广西、海南、湖南、湖北、江西、云南和贵州等省（自治区）中稻及晚稻受害 最为严重，常见颗粒无收的重病田块。南方水稻黑条矮缩病的大暴发给我国南方水稻的生 产带来严重的危害，挫折了农民生产积极性，给国家粮食安全带来极大的挑战。
[0005] 作为一种病毒病，目前市场上缺少可有效防治该病的药剂，南方水稻黑条矮缩病 的防控主要采用"治虫防病"的措施，通常是早期采用杀虫剂杀灭稻飞虱以阻断传毒环节。 但是，白背飞虱迀入批次多，虫源地不明，迀入时问难以把握，而且该虫的传毒特性还不十 分清楚。基础研宄的缺失使得对SRBSDV测报困难、防控盲目性大、可用措施不多、长期防控 效果不佳。
[0006] 筛选抗病资源应用于抗病育种生产是最为直接有效的方法，筛选、发掘和创新抗 病种质是开展抗病育种的前提和基础。但迄今SRBSDV抗性QTL检测和遗传效应分析还处 于起步阶段，在生产上也没有发现对SRBSDV免疫的品种，所以对SRBSDV抗性种质进行大规 模筛选和展开SRBSDV抗性遗传特性研宄显得尤为迫切。
[0007] 目前水稻育种上筛选抗病品种、抗病基因定位鉴定抗性家系均采用田间自然发病 鉴定，即将各鉴定品种或品系以小区形式种植于大田，每个小区几十株左右，大田常规栽培 管理，传毒介体白背飞虱自然传毒，待水稻显现病症后调查各鉴定品种(家系）小区的穴发 病率，以此为标准鉴别水稻品种(家系）抗感能力的差异。自然鉴定法是长久以来应用的方 法，但因其受到自然条件的制约，不同年份、不同地点的鉴定结果差异较大，且自然鉴定法 无法有效控制诸如白背飞虱带毒率、接虫量、接种时间等的一致性，因而使得鉴定结果不准 确。
[0008] 为排除田间自然环境的多变性和传毒介体的不可控性对抗病鉴定的影响，对水稻 进行人工定量接种带毒介体成为一种必然。人工接种鉴定法是在借鉴自然鉴定法基础上建 立起来的接种鉴定方法，即在室内条件下以定量带毒白背飞虱在水稻特定生育期接种待测 水稻一定时间，培养待测水稻显症后，根据病害发生的严重度评价待测水稻对SRBSDV的抗 性水平。室内人工饲养白背飞虱和人工接种SRBSDV的方法能够保证鉴定使用的白背飞虱 带毒率和接虫数量的稳定性，能够保证鉴定结果重复性好、可信度高。目前室内鉴定均采用 苗期接虫，待植株分蘖盛期显症后通过调查品种的发病率来确定该种质的抗病能力。然而， 由于水稻对SRBSDV获毒至显症的时间间距非常长，水稻获毒之后需要经历近两个月的潜 伏期，这给水稻种质资源的抗性调查和理论研宄带来很大的不变。因此，迫切需要发展一种 针对水稻种质资源和试验材料能够快速、准确地进行SRBSDV抗性评价的新技术。
[0009] 我们研宄证明对水稻植株接种SRBSDV，不管是抗病还是感病水稻植株体内，均检 测到SRBSDV病毒，另外水稻植株苗期感染SRBSDV病毒之后，症状不凸显，不能确定其抗病 性，需要等到分蘖盛期才能确定其抗病性。令人振奋的是，我们新近研宄发现水稻低氧萌发 所产生的胚芽鞘接种SRBSDV病毒后一段时间胚芽鞘内的SRBSDV病毒增殖速度与水稻品种 抗性直接相关。胚芽鞘是水稻胚芽外的锥形套状物，是一个鞘状结构，胚芽鞘本来是植物叶 片的保护组织，有保护胚芽中更幼小的叶和生长锥的作用。通常水稻植株感染SRBSDV病毒 都是在水稻秧苗期通过灰飞虱传毒的，而种子萌发产生胚芽鞘的传毒研宄被忽略，我们研 宄发现胚芽鞘接种SRBSDV病毒后一段时间胚芽鞘内的SRBSDV病毒增殖速度与水稻品种抗 性直接相关，我们的研宄发现给SRBSDV的抗性鉴定提供了新思路。
[0010] 本发明通过胚芽鞘培养前期激素的低氧诱导和胚芽鞘培养后期激素的抑制培养 来拓展胚芽鞘的生长时间，而在此时间内通过荧光定量RT-PCR技术对接种病毒后胚芽鞘 内的SRBSDV含量进行检测，通过制作SRBSDV增殖趋势图实现了接毒后胚芽鞘内SRBSDV病 毒增殖速度快速而准确地测量，进而快速鉴定水稻品种SRBSDV的抗性水平和抗性等级。
[0011] 利用本方法评价水稻品种对SRBSDV的抗性水平，可以克服传统生物学检测方法 工作量大、耗时长、准确性低而且受季节性限制的难题，大大缩短了鉴定周期，并且大大提 高了鉴定准确度。这一鉴定方法除了可以应用于水稻品种资源的发掘鉴定、品种抗性评价、 抗病品种选育外，亦可以应用于抗病基因定位的表型鉴定和抗性遗传规律研宄等众多领 域。
【发明内容】
[0012] 本发明的目的是针对现有SRBSDV品种抗性室内鉴定周期长、准确度低等缺点，提 供一种鉴定周期短、准确度高的通过检测胚芽鞘内病毒增殖速度快速评价水稻SRBSDV品 种抗性的方法。
[0013] 本发明的目的是通过以下技术方案解决的： 一种通过检测胚芽鞘内病毒增殖速度快速评价水稻SRBSDV品种抗性的方法，其特征 在于：该鉴定方法包括以下步骤： 1) 选择鉴定标尺：根据人工接毒鉴定中不同品种对南方水稻黑条矮缩病抗性表现设置 高抗、中抗、感病三个鉴定标尺，选择三个相应水稻品种做为鉴定标尺； 2) 低氧诱导待测水稻和鉴定标尺品种的胚芽鞘：每个品种取15-20粒种子，用0. 6%次 氯酸钠溶液浸泡15min进行灭菌，超纯水冲洗干净，然后放置于25°C条件下适宜浓度的IAA 溶液中低氧诱导培养3天，诱导出胚芽鞘； 3) 胚芽鞘接种带毒白背飞虱后暗培养：将胚芽鞘用超纯水洗净，放入铺有吸水棉的试 管中，每个试管一个种子，定量接种带毒白背飞虱，用透气纱布封闭试管后平置，传毒24h， 将传毒后胚芽鞘用超纯水冲洗，然后放置于25°C条件下浸润了适宜浓度的ABA溶液的吸水 棉上暗培养； 4) 荧光定量PCR获得各水稻品种周期时间点的SRBSDV病毒S9与内参基因的相对表 达量（RQ值）：按照周期时间点采集待测水稻和鉴定标尺特定位置的胚芽鞘40-60g，每个 品种每个取材时间点取材2-3重复，-70°C保存，提取RNA并纯化，取1 y L上述病毒RNA提 取液，加入荧光定量PCR反应体系，利用引物SRBSDV-F :5' -GAGACCCACCTCCACTGATT-3'和 SRBSDV-R :5' -ACGTTTACCACTGCGCCTTC-3' 按照荧光定量 PCR 扩增程序扩增 SRBSDV 病毒 S9 片段，扩增完毕，进入结果分析界面，以GAPDH为内参，与对照组相比，获得每个品种每个取 样时间点重复的SRBSDV病毒S9与内参基因的相对表达量（RQ值）； 5) 绘制SRBSDV增殖指数趋势线：利用多重复的RQ值统计每个待测品种和鉴定标尺饲 毒后每个取样时间点的RQ值均值，以RQ值均值为纵坐标、饲毒后周期取样时间点为横坐 标，对数据进行统计分析，获得SRBSDV增殖指数趋势线y=Ae kx; 6) 根据SRBSDV增殖指数趋势线公式评价待测水稻品种对南方水稻黑条矮缩病的抗性 水平和抗性等级：根据每