微杆菌及其用图
【技术领域】
[0001 ] 本发明涉及一株微杆菌及其在丹参毛状根培养体系中的应用。
【背景技术】
[0002] 丹参（SalviamiltiorrhizaBunge)又名赤参，紫丹参，红根等，为唇形科植物， 其干燥根和根茎可入药。其作为药材使用的记录，最早见于《神农本草经》，而后在梁朝、唐 朝、五代以及明朝的中医药著作中也都有对丹参入药的记载。分布在我们的河北、山西、陕 西、山东、河南、江苏、浙江、安徽、江西及湖南等地，在日本也有丹参的分布。丹参具有活血 调经，祛瘀止痛，凉血消痈，清心除烦，养血安神等作用。丹参根主要含脂溶性的二萜类成分 和水溶性的酚酸成分，还含黄酮类，三萜类，留醇等其他活性成分。起初人们对脂溶性丹参 酮类物质的药理研宄相对较多，但现在水溶性的酚酸类成分也越来越受到人们的重视。水 溶性的酚酸类物质主要有咖啡酸、迷迭香酸、丹酚酸A、丹酚酸B、肉桂酸、丹参素等。研宄 表明水溶性成分具有不同于脂溶性成分的活性（包括抗氧化、神经保护、保护心脏、保护血 管、治疗二型糖尿病及抗细胞凋亡等）。因此丹参的市场需求日益增大，而丹参约80%为野 生资源，且有效活性成分不稳定，生长周期长，远远不能满足市场的需求。又由于人们长期 过度采挖导致资源日渐萎缩；人工栽培又面临无良种、品质退化、生产周期长、种子带病与 农药残留超标，在不同环境下生长，其药效成分组成和含量有很大差异、临床治疗上不稳定 等问题。毛状根的培养技术可以大量生产丹参药材资源、改良丹参品质、并大幅提高丹参药 效成分产量、质量及稳定性。但目前所建立起来的丹参毛状根培养系统仍存在着活性产量 低的问题，从而影响培养的进一步放大和工业化。
[0003] 因此，筛选能够更有效提高丹参毛状根活性成分含量的诱导子具有非常重要的意 义。能够诱导植物产生次生代谢物的物质叫做诱导子（Elicitor)，如酵母提取物等生物诱 导因子和金属离子等非生物诱导因子。在生物或者非生物因子的诱导下，植物的抗逆性会 增强，同时促进植物次生代谢物质的积累。将微生物诱导子接入毛状根，是提高并获得丹参 毛状根有效成分含量的崭新途径，从而解决当前丹参的质量控制问题和丹参栽培中面临的 问题。
【发明内容】
[0004] 本发明要解决的技术问题是提供一种微杆菌，该菌株可促进丹参毛状根中迷迭香 酸和丹酚酸B的积累。
[0005] 为了解决上述技术问题，本发明提供一种微杆菌，为Microbacterium arborescensLG2,其保藏号为：CCTCCN0:M2015083。
[0006] 本发明还提供了上述微杆菌的用途：促进丹参毛状根中迷迭香酸和丹酚酸B的积 累。
[0007] 作为本发明的微杆菌的用途的改进：促进丹参毛状根增重。
[0008] 该微杆菌MicrobacteriumarborescensLG2是发明人从丹参植株中采用平板稀 释法分离得到的一株内生细菌，经鉴定其发酵液和菌体具有促进丹参毛状根迷迭香酸和丹 酚酸B成分积累的作用。
[0009] 分离方法为：
[0010] 1)、将丹参的根经表面消毒处理后，加入无菌水进行研磨稀释，涂布于营养琼脂 上，于28~32°C培养1~3天；
[0011] 营养琼脂配方：蛋白胨l〇g，牛肉膏3g，NaCl5g，琼脂18g和蒸馏水1000mL，pH= 7. 2 ~7. 4。
[0012] 2)、挑取单菌落于相同的营养琼脂平板划线纯化，于28~32°C培养1~3天；
[0013] 3)、重复步骤2)，直至获得纯培养物。
[0014] 本发明的微杆菌的保藏信息具体如下：MicrobacteriumarborescensLG2,保 藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉武汉大学，保藏编号：CCTCCN0:M 2015083,保藏时间2015年3月4日。
[0015] 本发明的微杆菌一MicrobacteriumarborescensLG2(CCTCCN0:M2015083)在 营养琼脂培养24h后菌落呈圆形，表明光滑，菌落较小，边缘整齐，产橙黄色色素。
[0016] 该菌株革兰氏染色阳性，好氧，细杆状，不产芽胞；过氧化氢酶阳性，氧化酶阴性； 在生长温度为20~40°C、pH值为6. 0~8. 0的环境中生长良好；能代谢葡萄糖产酸；产生 硫化氢，能水解明胶，不能水解淀粉。
[0017] 该MicrobacteriumarborescensLG2(CCTCCN0:M2015083)的 16SrDNA序列分 析表明，与Genbank国际数据库中记录的菌株Microbacteriumarborescens的相似性为 99%〇
[0018] MicrobacteriumarborescensLG2(CCTCCN0:M2015083)在丹参毛状根培养体 系中作为诱导子促进迷迭香酸和丹酚酸B积累的作用。
[0019] 本发明的MicrobacteriumarborescensLG2(CCTCCN0:M2015083)，其菌体诱导 子可促进毛状根迷迭香酸含量提高183%，丹酚酸B含量提高69% ;菌液诱导子可促进毛 状根迷迭香酸含量提高7%，丹酚酸B含量提高105%，而鲜重增加20%。对人畜无毒无 害，对环境不造成污染。可在丹参毛状根培养中得到应用，产生一定的经济效益。
[0020] 本发明的微杆菌在用于促进丹参毛状根酚酸类物质积累时，只需将 MicrobacteriumarborescensLG2(CCTCCN0:M2015083)在营养肉汤培养基中培养后，离 心收集的上清液及菌体可分别作为诱导子接于丹参毛状根培养基中，即可促进丹参毛状根 中迷迭香酸和丹酚酸B含量的增加。
[0021] 本发明的有益效果主要体现在：利用本发明提供的Microbacteriumarborescens LG2(CCTCCN0:M2015083)发酵上清液和菌体的诱导子，添加到丹参毛状根培养体系中即 可提高迷迭香酸和丹酚酸B的含量，进而提高总酚酸类的含量，所诱导的丹参毛状根能用 于迷迭香酸和丹酚酸B单品的提取。
【具体实施方式】
[0022] 下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于 此。
[0023] 实施例 1、MicrobacteriumarborescensLG2(CCTCCN0:M2015083)分离培养方 法如下：
[0024] 1、于四川中江采集野生丹参植株，根部洗净后25KHz超声波处理5分钟；
[0025] 2、在无菌条件下，对步骤1所得的材料用灭菌去离子水冲洗3次，并分别用75% (v/v)的酒精和3% (m/V)次氯酸钠溶液表面消毒，从而杀灭供试材料表面微生物；
[0026] 3、在无菌环境中，将步骤2所得的供试材料用无菌水冲洗3次，取100y1最后1 次冲洗的无菌水冲洗液涂布接种于营养琼脂培养基上，30°C培养24h后，进行无菌验证。
[0027] 如无菌落产生，则继续后续的步骤4 ;如有菌落产生，则返回步骤2继续表面消毒 处理。
[0028] 营养琼脂培养基为：蛋白胨10g，牛肉膏3g，NaCl5g，琼脂18g和蒸馏水1000mL， pH= 7. 2 ~7. 4〇
[0029] 4、在超净台中，取处理好的丹参根样品1~2g，在无菌研钵中充分研磨，并加 入5mL无菌水，混匀，静置15min，取100yl上清稀释涂布于营养琼脂培养基中，置28~ 32°C(较佳30