一种海洋光合细菌规模化生产方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种细菌的培养方法，特别涉及一种海洋光合细菌的高效大规模生产 方法，属于生物技术领域。
【背景技术】
[0002] 光合细菌（photosyntheticbacteria，简称PSB)通常是指一大类能够在有光照 缺氧的环境中能进行不放氧的光合作用的一群微生物，光合细菌细胞内只有一个光系统即 PSI，区别于绿色植物的是，它们的光合作用是不产氧的。光合细菌光合作用的原始供氢体 不是水，而是一些有机物，其光合作用的结果是可以分解有机物，光合细菌独特的生理特性 使它们在生态系统中的地位显得极为重要。尤其在水环境污水处理和水产养殖中由于其具 有较强净化污水功能而广泛被使用水质净化以及水环境生态改良剂。
[0003] 另外光合细菌还具有非常重要营养及保健功能，光合细菌是营养成份很丰富的菌 类之一，其蛋白质含量高达65%，氨基酸组成丰富；光合细菌还含有丰富的维生素，特别是 人和动物幼体发育所必需的B族维生素类，如B12、叶酸等，光合细菌菌体生物素的含量很 高，是啤酒酵母和小球藻的20至60多倍。此外还含有多种微量元素、促生长因子、促免疫 因子和辅酶Q、5_氨基乙酰丙酸（5-ALA)、卟啉、核糖核酸（RNA)和类胡萝卜素等重要生理活 性物质。国外的一些保健品的品种中都有加不同比重的光合细菌菌液。
[0004] 由于这些特点，近年来在有机污水处理，水产养殖，生物菌肥，农业种植，食品，医 疗和保健等领域掀起了使用光合细菌的热潮。
[0005] 相对于光合细菌的巨大需求，我国在光合细菌的生产技术上、规模化生产等方面 目前还非常不成熟。尤其在海洋光合细菌的规模化生产方面技术不成熟，其中主要表现在 以下几个方面： 1、光合细菌的常规培养方法依赖于光照，而大规模生产受限于昂贵的光反应器的投资 成本，国内多目前多采用粗放光静止培养方法，利用透明玻璃瓶、塑料瓶、玻璃缸、塑料袋或 塑料桶等容器进行光照静置小体积培养，在大体积培养方面偶尔用槽式，池子等半开放或 开放式培养，但这些培养方式进行光合细菌生产的存在规模小，或者培养效率低，菌体浓度 和纯度低，易遭杂菌污染。
[0006] 2、由于目前海洋光合细菌生产多采用光照静置培养，光合细菌是进行光自养或光 异养生长，细菌的倍增时间长，造成生产周期长，通常需要7-20天。尤其是在规模化生产 中，当从少量的菌种扩大生产到几十立方的规模，常规的光静置培养需要很长的时间，生产 周期长，降低了设备利用率，增加了生产成本。
[0007] 3、目前海洋光合细菌的规模化生产通常使用半开放和开放式的生产方式，培养基 易染菌，光合细菌的得率低，菌体浓度通常低于1〇 7cfu/ml，并且开放生产中杂菌率非常高， 影响广品品质。
[0008] 4、目前海水光合细菌的培养基中沿袭淡水光合细菌培养方式，过度使用磷酸盐， 容易与海水中的钙镁离子形成沉淀，一方面造成试剂浪费，并且会影响培养基的透明度，干 扰生长过程对菌体生长密度的检测，同时浑浊的培养基还会减少有效光照强度。
[0009] 由于上述这些问题的存在，极大限制了我国海洋光合细菌的规模化生产及其应 用。
【发明内容】
[0010] 针对海洋光合细菌规模化生产中存在的问题，本发明的目的是提供一种生产效率 高，生产成本低的海洋光合细菌规模化生产方法，以促进海洋光合细菌产品在水产、食品、 医药和环境保护等领域的应用。
[0011] 本发明根据光合细菌自身的代谢特点：即能够在需氧不需光的条件下快速异养生 长来增加细胞数量，又能够在光厌氧的条件下高效率利用低分子的有机物进行生长，以及 合成一些生物活性物质的特点，通过设计需氧不需光的暗反应与光厌氧发酵两阶段相耦合 的生产工艺，并根据光合细菌在需氧异养条件下可快速生长的特点，设计了适合该阶段的 营养丰富的培养基，促进光合细菌迅速生长，快速增加细胞的数量，此阶段生产装置只需要 一般好氧发酵的发酵罐，不需要昂贵的光反应发酵罐；而第二阶段通过在厌氧光合管道中 利用不会产生沉淀的，低营养发酵培养基进行光厌氧发酵，这个阶段的生产规模可灵活的 通过增减光合管道来设置，并且还可以通过在光厌氧发酵中应用不同补料方式实现分批发 酵，间歇补料，和连续补料等方式生产，具有投资少，高度灵活性，可根据具体的情况采用不 同生产方式和不同生产规模的特点。
[0012] 本发明的具体技术方案如下：一种海洋光合细菌规模化生产方法，包括需氧不需 光发酵过程和光厌氧发酵过程两个阶段；首先在需氧不需光的发酵过程中，海洋光合细菌 菌种与需氧不需光发酵阶段培养基按1:(5-20)的体积比混合后置于需氧不需光的普通 微生物发酵罐中发酵，需氧不需光发酵阶段培养基的营养成分及质量百分比为：乙酸钠： 0? 15-0. 5%、酵母粉：0? 0001-0. 5%、蛋白胨：0? 001-0. 5%、氯化铵：0? 01-0. 2%、糖（葡萄糖或 蔗糖、麦芽糖等其他常用碳源）：〇. 0001-2%、H2P04-:0 . 001-1%、Fe3+:0. 00001-0. 01% ;培养基 其余成分为无污染的海水或者人工海水，培养基通过1-5 M的乙酸和1-5 M氢氧化钠调节 酸碱度，最终的培养基的pH介于6. 0-7. 5之间，培养基经115-121°C高温灭菌后使用。此 阶段发酵容器可以是试管、三角烧瓶或发酵罐，并且对光照没有要求，有光无光都可发酵， 发酵容器或设备要求要求能够高压115-121°C灭菌，抗海水腐蚀，发酵过程中要求温度可 控和无菌通气供氧。在此阶段光合细菌发酵过程中光合细菌种子液按照比例加入培养基 后好氧发酵，发酵期间温度控制在20-40°C，发酵时，发酵液的溶氧分压为50%-100%饱和 溶氧分压。发酵罐发酵过程pH控制在6.3-8. 0之间；需氧不需光的发酵阶段的发酵时间 为24-48小时，当发酵罐中的光合细菌浓度达到波长660nm下光密度值（即0D66Q)大于0. 8 时可以停止发酵，并将发酵罐中的发酵液按照1 :(3-15)的体积比用灭菌的管道输送到 第二阶段进行光厌氧发酵：此过程的培养基营养成分低于需氧不需光的过程的培养基，并 且不含葡萄糖，蔗糖或麦芽糖等碳源成分，光厌氧发酵培养基成分及质量百分比为：乙酸 钠：0? 15-0. 5%、酵母粉：0? 0001-0. 1%、蛋白胨：0? 0001-0. 1%、氯化铵：0? 0001-0. 1%、H2P(V : 0. 0001-0. 01%、Fe3+: 0. 00001-0. 001%，培养基其余成分为无污染的海水或人工海水，培养基 酸碱度通过1-5M的乙酸或1-5M氢氧化钠调节，最终pH应介于与6.0-7. 5之间。培养基要 除菌消毒，除菌消毒的方法可以通过在密闭不锈钢容器中煮沸30-60分钟，或者经高压灭 菌设备110-121°C灭菌20-30分钟，也可利用高氯酸或二氧化氯等含氯的消毒剂除菌，保 证除菌后的培养基中的杂菌应低于3cfu/ml，并且残留的游离氯应低于0.06mg/L。光厌 氧发酵过程中发酵温度为15-40 °C，可通过日光温室，或者水浴进行温度调节，光源可利用 自然光照或者人工辅助光源，但应避免太阳光暴晒，每天保证8-24小时光照时间，光强度 应介于1200Lux-8000Lux之间；通常使用日光灯等人工辅助光源能增加光照时间，进而 加快光厌氧阶段光合细菌的生长速率，缩短发酵周期。海洋光合细菌光厌氧发酵阶段在透 明的管道内发酵，2-15天后当菌体的浓度OD66(|大于1. 2时，并且继续延长发酵时间菌体的 浓度增加缓慢，即〇D_每天的增长量小于0. 1时，终止发酵。
[0013] 发酵后的海洋光合细菌可直接灌装或离心浓缩液体或通过其他载体吸附、干燥等 工艺包装制成可用于食品、医药、水产、种植、养殖、环保等领域的光合细菌制剂。
[0014] 光厌氧发酵阶段使用的透明管道可采用透明玻璃，透明有机玻璃，或其他 透明塑料如聚乙稀，聚丙稀，聚碳酸醋，聚氨醋（Polyurethane，PU)，热塑性聚氨醋 (Thermoplastic Urethane，TPU)等材料，可以是透明的硬质管道或软管道，管道要求能够 耐受大于〇. 15兆帕的静水压，管道的直径介于90mm-600mm之间，并且能够耐受3M的盐酸 或5M的烧碱处理100小时以上。管道与管道直接可以通过不锈钢法兰或卡箍进行连接。管 道的长度可以根据生产需要和生产场地具体而定，一般单条管道长几米到上千米。该阶段 可同时进行多条管道的并联发酵，扩大发酵规模。管道之间可设置相应口径的不锈钢的阀 门控制管道液体的流向和流量。还可以通过三通或阀门连接耐酸碱腐蚀的泵，用于管道消 毒或者管道清洗，培养基发酵液混合等。
[0015] 本发明具有以下优点： 1、 设备投资少，不需要昂贵的光合反应发酵罐，便于放大进行规模化生产； 2、 根据光合细菌生长代谢特点设计了能够满足光合细菌快速增殖的需氧不需光-光 厌氧耦合发酵工艺； 3、 在需氧不需光的发酵阶段的培养基中添加了葡萄糖等可发酵碳源，并且在光厌氧培 养基中提高的有机氮源如蛋白胨、酵母粉和无机氮源如氯化铵或硫酸铵的浓度，提高了光 合细菌好氧异养生长繁殖速率高，可快速增加菌体的生物量，相对于常规的光照静止培养 能大大缩短发酵时间2-8倍，并且活菌数提高2-10倍； 4、 本发明的光厌氧发酵阶段使用透明管道，可通过调整管道的长短控制生产规模，并 且光厌氧发酵阶段也可单独使用，并根据补充培养基的方式进行分批发酵、连续发酵或流 加发酵，具有非常高的灵活性和可控程度；透明管道光厌氧发酵可利用自然光源或人工光 源提高了光合细菌的生长率。
【具体实施方式】
[0016] 下面通过具体实施例来进一步详细说明本发明。
[0017] 实施例1: 材料与方法