具有诱导酚酸积累作用的丹参内生菌及其用图
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种天然药用植物内生细菌一一丹参内生菌及其用途。
【背景技术】
[0002] 丹参（SalviamiltiorrhizaBunge)为唇形科、鼠尾草属植物，双子叶、多年生直 立草本植物，是我国的一种传统中药材，以根、茎入药。丹参用处十分广泛，2010年版《中华 人民共和国药典》记载，丹参可用于治疗活血通经，祛瘀止痛，清心除烦，主治经闭痛经、月 经不调、热痹肿痛、心烦不眠、心绞痛等。现代医学研宄发现，丹参在扩张冠状血管、改善微 循环等方面疗效显著，目前多用于心血管疾病的治疗。随着生物技术的不断进步，对丹参的 药理作用研宄也越来越深入，其市场需求不断扩大。
[0003]据统计我国每年仅复方丹参滴丸的销售额就已超过10亿元，每年丹参原材料需 求量达到近5万吨，且逐年呈上升趋势。然丹参的栽培和生长周期长且有效成分含量低，使 得批量生产和临床使用非常困难；而且野生情况下的丹参的资源有限，采挖野生丹参会破 坏自然界的生态平稳。因此，利用植物组织培养或器官培养，直接获得植物有效成分，必将 成为发展的一种趋势。毛状根因其激素自养、生长迅速、周期短，且具有宿主植物完整代谢 通路等特点，而被公认为较好的生产植物次生代谢产物的原材料。但是毛状根也具有次生 代谢产物产量低等与植物细胞培养一样的问题，这些都影响着毛状根的扩大培养乃至工业 化生产。
[0004] 植物内生菌是能从经过表面消毒的植物组织中分离或者从植物内部的汁液中获 得，并且对植物表观上无危害即不导致明显病症的微生物。植物内生菌包括互惠共利的 (mutualistic)和中性的（neutral)内共生微生物。
[0005] 目前已经从很多植物的各种器官（根、茎、叶、花、果实、种子）中分离到内生菌。它 们在植物体内的普遍性、丰富的生物多样性及功能多样性方面已有不少文献报道。内生菌 经过长期的与植物发生相互作用，它们之间形成较复杂的关系。现已发现内生菌对宿主植 物有以下几个方面的作用：
[0006] (1)促进宿主植物生长，提高宿主的生产力，可增强宿主对病、虫的抗性，因而在农 业生产、生物控制和生物防治方面有着重要意义；
[0007] (2)、增强宿主植物对环境胁迫的抗性。如对干旱、全球气温上升、盐碱、重金属及 其它有毒物质污染等的抗性；
[0008] (3)、促进宿主植物次生代谢产物合成。生长在自然环境中的植物经常遭受不良 因素如微生物入侵与伤害等胁迫，为了抵御不良环境，植物细胞往往产生次生代谢物质。 目前人们已发现多种内生菌中能够促进宿主植物次生代谢产物的积累，如Trichoderma atroviride、Streptomycespactum等。
[0009] 近年来，利用诱导子刺激毛状根，研宄植物次生代谢调控、促进药用植物次级代 谢产物合成一直是国内外研宄的热点。能够诱导植物产生次生代谢物的物质叫做诱导子 (Elicitor)，如酵母提取物等生物诱导因子和金属离子等非生物诱导因子。在生物或者非 生物因子的诱导下，植物的抗逆性会增强，同时促进植物次生代谢物质的积累。将微生物诱 导子接入毛状根，是提高并获得丹参毛状根有效成分含量的崭新途径，必将从根本上解决 当前丹参的质量控制问题和丹参栽培中面临的问题。
[0010] 目前，国内外关于丹参生物诱导子的研宄主要集中于内生真菌，但内生细菌的研 宄较少，更没有绿针假单胞菌（Pseudomonaschlororaphis)促进药用植物次生代谢产物积 累的研宄报告。
【发明内容】
[0011] 本发明要解决的技术问题是提供一种丹参内生菌---绿针假单胞菌，该菌株可促 进丹参毛状根酚酸类物质的积累，从而解决丹参毛状根培养过程中活性成分含量低、质量 不稳定的问题。
[0012] 为了解决上述技术问题，本发明提供一种丹参内生菌，为绿针假单胞菌 LG1(PseudomonaschlororaphisLG1)，其保藏号为：CCTCCN0:M2〇15〇82〇
[0013] 本发明海同时提供了上述丹参内生菌的用途：促进丹参毛状根中酚酸类物质含量 的积累。酚酸类物质主要是指迷迭香酸、丹酚酸B。
[0014] 作为本发明的丹参内生菌的用途的改进：促进丹参毛状根增重。
[0015] 该丹参内生菌是发明人从丹参植株中分离到的一株细菌，经传统方法鉴定和分子 鉴定表明它属于绿针假单胞菌，将其命名为绿针假单胞菌LG1(Pseudomonaschlororaphis LG1)〇
[0016] 分离方法为：
[0017]1)、将丹参的根经表面消毒处理后，加入无菌水进行研磨稀释，涂布于基础NA培 养基平板上，于28~32°C培养1~3天；
[0018] 基础NA培养基斜面配方：蛋白胨10g，牛肉膏3g，NaCl5g，琼脂18g和蒸馏水 1000mL，pH= 7. 2 ~7. 4〇
[0019]2)、挑取单菌落于相同的培养基（S卩，基础NA培养基）平板划线纯化，于28~32°C 培养1~3天；
[0020]3)、重复步骤2)，直至获得纯培养物。
[0021] 本发明的丹参内生菌的保藏信息具体如下：绿针假单胞菌LGIPseudomonas chlororaphisLG1，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉武汉大学，保 藏编号：CCTCCN0:M2015082,保藏时间2015年3月4日。
[0022] 本发明的丹参内生菌--绿针假单胞菌LG1 (以下简称绿针假单胞菌CCTCCN0:M 2015082)具有如下生物学特征：
[0023] 1.菌落形态特征：在NA培养基上生长良好，细菌群落特征：菌落呈圆形，橘黄色， 光滑，边缘整齐，菌落中心凸起，产橙色色素。
[0024] 2.菌体形态特征：短杆状，革兰氏阴性。
[0025]3.主要生理生化特征：该菌可在NA培养基上，在生长温度为20~40°C、pH值为 6. 0~8. 0的环境中生长良好。
[0026]4.遗传学特征：根据《常见细菌系统鉴定手册》（东秀珠，蔡妙英，科学出版社， 2001)，本发明的绿针假单胞菌CCTCCN0:M2015082形态特征上，与国内命名的绿针假单 胞菌（Pseudomonaschlororaphis)最接近；该绿针假单胞菌CCTCCNO:M2015082 的 16S rDNA序列分析表明，与Genbank国际数据库中记录的菌株Pseudomonaschlororaphis strainKY5406(KM030060.1)的相似性为 99%。因此，绿针假单胞菌CCTCCN0:M2015082 应属于绿针假单胞菌。
[0027] 本发明的绿针假单胞菌CCTCCN0:M2015082可促进丹参毛状根中酚酸类物质含 量的积累，可促进毛状根鲜重增加11.3%，迷迭香酸含量提高111%，丹酚酸B含量提高 72%。对人畜无毒无害，对环境不造成污染。可在丹参毛状根培养中得到应用，产生一定的 经济效益。
[0028] 本发明的丹参内生细菌用于促进丹参毛状根酚酸类物质积累时，只需将利用该丹 参内生细菌绿针假单胞菌CCTCCN0:M2015082制备的诱导子接于毛状根培养基中，即 可获得提高丹参毛状根酚酸类物质含量的效果。
【具体实施方式】