板栗种仁α-1,6-葡聚糖及其制备方法以及在抗肿瘤药物中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种植物多糖及其制备方法与应用，尤其是涉及一种板栗种仁 a -1,6-葡聚糖及其制备方法以及在抗肿瘤药物中的应用。
【背景技术】
[0002] 板栗为壳斗科栗属植物的果实，味甘，性温，无毒，有益气补脾、厚肠胃、补肾强筋、 活血止血、清热解毒、止泻治咳等功效。临床上，板栗还可用于治疗反胃、泄泻、腰腿软弱、吐 血、便血、金疮等症。多糖作为板栗种仁的重要组成物质，因其生物功能广泛、毒副作用小等 诸多优势，受到各国研发人员的极大重视。
[0003] 从镇安板栗中分离得到多糖组分CPS-a和CPS-b，具有抗氧化和抗疲劳作用（板 栗多糖的分离纯化、结构分析及体外抗氧化研宄，陕西师范大学，硕士论文，2011 ;板栗多糖 的分离纯化、结构分析及抗疲劳作用的研宄，食品与生物技术学报，2013, 32, 767-772)。罗 田板栗中的多糖由葡萄糖、甘露糖、木糖和阿拉伯糖组成，比例为〇. 58 :1. 00 :0. 33 :0. 18， 平均分子量为164. OkDa，具有抗氧化、抗肿瘤、抗凝血和升高白细胞等活性，浓度为Img/ mL时，对人肝癌细胞H印G2和宫颈癌细胞HeLa的抑制率分别为32. 8%和12. 1% (罗田 板栗多糖的分离纯化及成分分析，中国药学杂志，37 (1)，63-64, 2002 ;板栗多糖的提取、成 分分析及活性测定，武汉理工大学学报，32(11)，14-16,2010 ;板栗多糖的分离纯化、结构 鉴定及其活性研宄，江苏大学，硕士论文，2013)。燕龙板栗多糖对人肝癌细胞Bel-7402、 肺癌细胞A-549和子宫癌细胞HCT-8的抑制作用较明显，多糖浓度为0. 3mg/mL时，抑制 率分别为69. 5%、51.4%和55.3% (板栗不同品种（系）多糖结构和活性的初步研宄， 河北科技师范学院，硕士论文，2013)。Barbat等从欧洲板栗碱提取物中，分离得到木聚 糖，结构为4-0-甲基葡萄糖醛酸木聚糖和同木聚糖，其中4-0-甲基葡萄糖醛酸木聚糖 可抑制人表皮癌细胞A431的增生、迀移和侵袭的能力（Structural Characterization and Cytotoxic Properties of a 4-〇-MethylglucuronoxyIan from Castanea sativa. 2. evidence of a structure-activity relationship,Journal of Natural Product，71，1404 - 1409, 2008) 〇
[0004] 以上研宄中提取得到的多糖均由多种单糖组成，为结构复杂的杂聚多糖，其仅显 示出在抗氧化、抗疲劳和抗肿瘤活性上面的性能。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的就是提供一种板栗种仁α -1，6-葡聚糖。
[0006] 本发明的另一目的是提供一种以迀西板栗种仁为原料制备板栗种仁α -1，6-葡 聚糖的方法。
[0007] 本发明的进一步的目的是提供板栗种仁α -1，6-葡聚糖在制备抗肿瘤药物上的 应用。
[0008] 本发明的更进一步的目的是提供一种以板栗种仁α -1，6-葡聚糖为有效成分的 药物组合物。
[0009] 本发明的目的是这样实现的：
[00?0] -种板栗种仁α -1，6_匍聚糖，其结构式为[(1 - 6) - a -Glcp (1 - ]η，其中η为 正整数，其重均分子量范围为1600~2400kDa，平均分子量为2000kDa。
[0011] -种以迀西板栗种仁为原料制备所述板栗种仁α -1，6-葡聚糖的方法，包括以下 步骤：
[0012] a.多糖提取：迀西板栗种仁干燥、粉碎，乙醇脱脂，水提，离心，上清液减压浓缩， 醇沉，冷冻干燥，得板栗水提粗多糖；
[0013] b.多糖纯化：上述板栗水提粗多糖经Sevag法脱蛋白，离心，上清液先用截留分 子量为3500的透析袋透析，再依次采用阴离子交换色谱柱和凝胶渗透色谱柱分离纯化，得 α-1，6_葡聚糖。
[0014] 优选地，所述方法包括以下步骤：
[0015] a.多糖提取：将迀西板栗种仁干燥、粉碎，用95%乙醇脱脂，室温干燥，得板栗种 仁粉末；取板栗种仁粉末，加水，二者的质量体积比为Ig : 10~30ml，室温静置2~4h后， 冷水提取，提取液离心后沉淀重复提取2~4次，所得上清液合并后减压浓缩，加入2~5 倍体积的95%乙醇，4°C静置过夜，抽滤，所得沉淀冷冻干燥，得板栗水提粗多糖；
[0016] b.多糖纯化：板栗水提粗多糖配制成水溶液，加入等体积的氯仿/正丁醇混合液， 室温剧烈搅拌1~3h，静置分液，上层水相重复上述操作1~3次，合并上层水相并浓缩，浓 缩后的上层水相用截留分子量为3500的透析袋对蒸馏水透析3~5d，对透析袋内的液体浓 缩，采用Q-Sepharose Fast Flow阴离子交换色谱柱进行分离，以水进行洗脱，收集水洗脱 组分，浓缩后，溶于0. 2mol/L的碳酸氢铵溶液中，离心后经S印hacryl S-300凝胶渗透色谱 柱分离纯化，得α-1，6-葡聚糖。
[0017] 优选地，所述步骤a中板栗种仁粉末与水的质量体积比为Ig :20ml。
[0018] 优选地，所述步骤a的醇沉操作中95%乙醇的加入量为浓缩后上清液体积的3倍。
[0019] 另一方面，本发明提供所述板栗种仁α -1，6-葡聚糖在制备抗肿瘤药物方面的应 用，具体地说，所述肿瘤为宫颈癌、乳腺癌或耐药乳腺癌，尤其是耐阿霉素乳腺癌。
[0020] 再一方面，本发明提供药物组合物，其包含本发明所述的板栗种仁α -1，6-葡聚 糖作为有效成份，以及一种或多种药学上可接受的辅料。
[0021] 本发明提供的药物组合物，含有板栗种仁α-l，6-葡聚糖、制药学上许可的载体 或以板栗种仁α -1，6-葡聚糖作为活性成分的混以药用赋形剂或稀释剂的组合。
[0022] 所述的药物组合物的制药学上许可的载体是指药学领域常规的药物载体，例如： 稀释剂如水等，赋形剂如淀粉、蔗糖等，粘合剂如纤维素衍生物、藻酸盐、明胶等，润湿剂如 甘油等，崩解剂如琼脂、碳酸钙、碳酸氢钙等，吸收剂如季铵化合物等，表面活性剂如十六烷 醇等，吸附载体如高岭土等，润滑剂如滑石粉、硬脂酸钙、硬脂酸镁等。另外还可以在组合物 中加入其它辅剂如香味剂、甜味剂等。
[0023] 本发明提供的药物组合物可以通过口服、鼻吸入、直肠或肠胃外给药的方式施用 于需要这种治疗的患者。用于口服时，可将其制成常规的固体制剂如片剂、粉剂、粒剂、胶囊 等，制成液体制剂如水或油悬浮剂或其他液体制剂如糖浆、酊剂等；用于肠胃外给药时，可 将其制成注射用的溶液、水或油性悬浮剂等，优选的形式是片剂、胶囊和注射剂。
[0024] 本发明提供的药物组合物的各种剂型可以按照药学领域的常规生产方法制备，例 如使活性成分与一种或多种载体混合，然后将其制成所需的剂型。
[0025] 本发明提供的板栗种仁α -1，6-葡聚糖为均聚多糖，通过本发明提供的制备方法 制得的板栗种仁α -1，6-葡聚糖，糖链的结构完整性好。其除体外对宫颈癌细胞HeLaU7I 癌细胞MCF-7具有显著的抑制活性，还对耐阿霉素乳腺癌细胞MCF-7/ADR的增殖具有更优 良的抑制活性。
【附图说明】
[0026] 图1是α -1，6-葡聚糖的纯度鉴定图。
[0027] 图 2 是 α -1，6-葡聚糖的 13C NMR(DEPT)谱图。
【具体实施方式】
[0028] 在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法， 所用试剂未标明来源、规格的均为市售分析纯或化学纯。
[0029] 实施例1
[0030] 将迀西板栗种仁（产地为河北省迀西县）干燥、粉碎，所得粉末用95%乙醇脱脂2 天，室温干燥后，取100g的板栗种仁粉末加入2000mL的水，室温静置2h后，冷水搅拌提取 2h，离心，残渣以相同条件再重复提取2次，合并上清液，减压浓缩至150mL，在搅拌下加入3 倍体积的95%乙醇，4°C静置过夜，抽滤，无水乙醇脱水，所得沉淀冷冻干燥，得板栗水提粗 多糖9. 6g。
[0031] 取板栗水提粗多糖Ig配制成1 %的水溶液（W/V，质量体积浓度），采用Sevag 法脱蛋白，加入等体积的氯仿/正丁醇混合液（氯仿：正丁醇=4:1 ;V/V，体积比），室温 剧烈搅拌2h，静置分液，上层水相重复脱蛋白步骤2次，合并上层水相并浓缩。浓缩后的 上层水相用截留分子量为3500的透析袋对蒸馏水透析3d，对透析袋内的液体浓缩，采用 Q-Se