一种融合多肽及其在促进成骨和血管形成中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物化学与分子生物学技术领域，具体涉及一种融合多肽及其在促进 成骨和血管形成中的应用。
【背景技术】
[0002] 骨形态发生蛋白（BMPs)是一类能够异味成骨的一组细胞因子，迄今为止发现了 20多种，其中，BMP-2是BMP家族中最重要的生长因子，BMP-2诱导骨髓间充质干细胞向成 骨方向分化的能力最强，但是，该蛋白半衰期短，难以持续发挥作用。其制备及其纯化的步 骤比较复杂，不容易得到，因此，研宄其活性部位的多肽段，采用化学合成方法合成，成为一 种研宄趋势。目前，BMP-2的活性部位研宄已经成熟，但是，该片段在体内的活性与天然蛋 白相比，活性降低较多，且不容易靶向固定。天然BMP-2活性肽分子在体内容易降解，体内 的活性非常低。
[0003] 血管形成多肽是一类能够促进血管生成的多肽因子，组织工程，组织再生中血管 形成是关键，目前的技术是形成不足，没有血供任何再生都不能成功，天然血管形成多肽分 子小，在体内极易降解，体内的活性非常低。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供一种能同时促进骨生长和血管形成的融合多肽。
[0005] 本发明的目的还在于提供上述同时促进骨生长和血管形成的融合多肽的制备方 法及其应用。
[0006] -种具有促进骨生长和血管形成的融合多肽，由具有促进骨生长作用的多肽和具 有促进血管生成作用的多肽融合而成；所述具有促进骨生长作用的多肽的氨基酸序列如序 列表SEQ ID NO :1所示；所述具有促进血管生成作用的多肽如序列表SEQ ID NO :2所示。
[0007] 所述具有促进骨生长作用的多肽为序列表SEQ ID NO :1所示的氨基酸残基序列经 过1至3个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有促进骨生长作用的多肽。
[0008] 所述具有促进血管生成作用的多肽为序列表SEQ ID NO :2所示的氨基酸残基序列 经过1至3个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有促进血管生成作用的多肽。
[0009] 上述的融合多肽在制备促进骨生长和血管形成的药物中的应用。
[0010] 一种包含上述融合多肽的药物组合物。
[0011] 所述药物组合物除含融合多肽外，还包括药学上可接收的载体，赋形剂或者佐剂。
[0012] 所述药学上可接收的载体为钥孔血蓝蛋白，牛血清白蛋白，卵清蛋白或血红蛋白。
[0013] 所述赋形剂为阿拉伯胶，羊毛脂，椰油，土豆淀粉，番薯淀粉，羧甲基淀粉钠，低取 代羟丙基纤维素，交联聚乙烯吡咯烷酮，泡腾崩解剂中的一种或一种以上。
[0014] 所述佐剂为弗氏完全佐剂，弗氏不完全佐剂，氣氧化错佐剂、短小棒状杆囷，脂多 糖，细胞因子。
[0015] 本发明的有益效果：本发明的融合多肽由具有促进骨生长和血管形成的多肽融合 而成，兼具促进骨生长和血管形成的功效，本发明的突变融合多肽具有更强促进骨生长和 血管形成的功效，为促进骨生长和血管形成的药物的研发提供基础。
【具体实施方式】
[0016] 下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。
[0017] 实施例1
[0018] 1、融合肽的制备
[0019] 通过本领域中公知的FMOC/tBu固相多肽合成法得到本实施例的融合多肽：
[0020] 成骨多肽 SEQ ID NO :1(KIPKASSVPTELSAISTLYL);
[0021] 血管生成多肽 SEQ ID NO :2(KLTWQELYQLKYKGI);
[0022] 融合多肽 SEQ ID NO :3(KIPKASSVPTELSAISTLYLKLTWQELYQLKYKGI)。
[0023] 2、成骨生成细胞实验
[0024] 试验相关材料：
[0025] SD MSC -株（RASMX-01001)，来源：Cyagen
[0026] 细胞状态：细胞状态好，形态均一。
[0027] 细胞无菌检测结果：阴性
[0028] 试验相关试剂：
[0029] 人胚胎干细胞培养基 mTeSRl(加拿大 Stemcell 公司）、1XPBS(PBS-10001_100)，
[0030] 人间充质干细胞成骨诱导分化培养基CP1202(深圳市伟通生物公司），0. 25% Trypsin-0. 0,4% EDTA(TEDTA-10001-100)、BMP-2(北京义翘神舟生物技术有限公司）
[0031] 本发明的诱导成骨多肽碱性磷酸酶测定试剂盒（南京建成科技有限公司）。
[0032] 试验步骤：
[0033] I、细胞准备：在SD MSC细胞融合达80 %时，将细胞进行传代，接种于经0. 1 %明胶 包被过的24孔板中，用于成骨诱导。
[0034] A.细胞消化、接种：
[0035] a.弃去上清，用 IXPBS清洗细胞2次，加入 ImlPBS和 Iml 0.25%Trypsin-0.04% EDTA消化细胞；
[0036] b.消化1-2分钟，显微镜下可见细胞间隙增大，细胞变圆，用手轻拍培养器皿的 壁，立即加入2mL的SDMSC完全培养基终止消化。
[0037] c.用吸管吸取液体，轻轻吹打培养器皿表面，反复3-5次，使细胞彻底脱离瓶皿底 壁，将细胞移入离心管中，再向培养瓶中加入I XPBS洗1-2次，并将洗液一并转移至离心管 中。
[0038] d. IlOOrpm进行离心4分钟；
[0039] e.弃去上清加入完全培养液，充分混匀，平均接种于3个包被过明胶的12孔板中， 摇匀，放置于37°C的二氧化碳培养箱中培养。
[0040] II、诱导成骨多肽的准备：将诱导成骨多肽称量分装成3份（lmg/份），取其中一 份进行溶解，其他保存于_20°C冰箱以供备用。加入1ml无菌用水溶解Img成骨素于离心管 中，过滤，分装于EP管中，保存于-80°C冰柜中以供使用。
[0041] III、诱导成骨：
[0042] A.初诱导：待细胞融合达80%左右时，进行成骨诱导。每组两个复孔，其中2孔阴 性对照：使用间充质干细胞完全培养液培养；2孔阳性对照：使用间质干细胞成骨诱导分化 完全培养液培养；2孔含10ug/ml的BMP-2间充质干细胞完全培养液培养；2孔含30ug/ml 的
[0043] BMP-2间充质干细胞完全培养液培养；2孔含lOug/ml的本发明的诱导成骨多肽间 充质干细胞完全培养液培养；2孔含30ug/ml的本发明的诱导成骨多肽间充质干细胞完全 培养液培养。2板重复。
[0044] B.每3天进行诱导换液。
[0045] IV.碱性磷酸酶检测：
[0046] 取不同检测时间点细胞，根据碱性磷酸酶（AKP)测定试剂盒（南京建成）对各组 AKP含量进行检测。具体操作如下：
[0047] A.消化各孔细胞，离心后，进行细胞计数，调整细胞数量，保证50ul细胞重悬液含 有大于5X105的细胞。用0. 05ml缓冲液重悬细胞，依次加入相应溶液：测定管中加入0. 05mL 细胞悬液，〇. 〇5mL缓冲液，0. 05mL基质液；标准管中加入0. 05mL 0. lmg/ml酚标准应用液， 0. 05mL缓冲液，0. 05mL基质液；空白管中加入0. 05mL双蒸水，0. 05mL缓冲液，0. 05mL基质 液。充分混匀37°C水浴15分钟，加入I. 5mL显色液，混匀，520nm，0. 5cm或者Icm光径比色， 空白管调零，测各管吸光度。
[0048] V.实验结果
[0049] 两周碱性磷酸酶测定：
[0050]
【主权项】
1. 一种具有促进骨生长和血管形成的融合多肽，其特征在于，由具有促进骨生长作用 的多肽和具有促进血管生成作用的多肽融合而成，其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO :3所 示；所述具有促进骨生长作用的多肽的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO :1所示；所述具有 促进血管生成作用的多肽如序列表SEQ ID NO :2所示。
2. 根据权利要求1所述一种具有促进骨生长和血管形成的融合多肽，其特征在于，所 述具有促进骨生长作用的多肽为序列表SEQ ID NO: 1所示的氨基酸残基序列经过1至3个 氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有促进骨生长作用的多肽。
3. 根据权利要求1所述一种具有促进骨生长和血管形成的融合多肽，其特征在于，所 述具有促进血管生成作用的多肽为序列表SEQ ID NO :2所示的氨基酸残基序列经过1至3 个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有促进血管生成作用的多肽。
4. 权利要求1-3所述的融合多肽在制备促进骨生长和血管形成的药物中的应用。
5. -种包含权利要求1-3所述融合多肽的药物组合物。
6. 根据权利要求5所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物除含融合多肽外， 还包括药学上可接收的载体，赋形剂或者佐剂。
【专利摘要】本发明公开了属于生物化学与分子生物学技术领域的一种融合多肽及其在促进成骨和血管形成中的应用。由具有促进骨生长作用的多肽和具有促进血管生成作用的多肽融合而成，其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：3所示。本发明的融合多肽由具有促进骨生长和血管形成的多肽融合而成，兼具促进骨生长和血管形成的功效，本发明的突变融合多肽具有更强促进骨生长和血管形成的功效，为促进骨生长和血管形成的药物的研发提供基础。
【IPC分类】A61P19-08, C07K19-00, A61P9-00, A61K38-18
【公开号】CN104861076
【申请号】CN201510317325
【发明人】别晓梅, 赵彦涛, 朱加亮, 衷鸿宾, 侯树勋, 白玉龙, 韩丽伟
【申请人】北京奥斯特赛医学科技有限公司
【公开日】2015年8月26日
【申请日】2015年6月11日