R检测电泳图，其中泳道M为DNA marker DL 2000,泳道1为空白对照，泳道2-7为 带有3'端序列的质粒；图IE为PCR获得trkH基因完整ORF的，其中泳道M为DNA marker DL 2000,泳道1为空白对照，泳道2和3为trkH基因完整0RF。
[0018] 图2为TrkH的保守域；
[0019] 图3为TrkH的系统发育树分析；
[0020] 图4为TrkH的跨膜结构域分析；
[0021] 图5为转基因酵母的功能互补实验结果；
[0022] 图6为转基因酵母在3mM K+浓度下的离子耗竭实验结果；
[0023] 图7为转基因酵母在不同K+/Na+浓度下的生长情况比较实验结果。
【具体实施方式】
[0024] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实例仅用于说明本发明而 不用于限制本发明的应用范围。下面实施例中未注明具体实验条件的方法，通常按照常规 条件或分子克隆中所述条件，或按照产品说明书上所提供的条件。下面实施例中所用的材 料、试剂等如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0025] 试验中使用的试剂盒以及试剂：无缝连接试剂盒：Trangene公司，pEASY-Uni Seamless Cloning and Aseembly Kit ;质粒提取试剂盒：Sangon Biotech 公司，SanPrep 柱 式质粒DNA小量抽提试剂盒。
[0026] 实施例1trkH基因的克隆与分析
[0027] 1.海洋微生物组DNA的提取
[0028] 海洋微生物采集：海水取自中国大连黑石礁海域，经过沙滤装置得到能直接用于 养殖的干净海水。将干净海水进行抽滤，微生物则留在滤膜上，再用洁净的刀片轻轻刮取并 用海水冲洗离心，获得海洋微生物混合样品。将该海洋微生物混合样品迅速保存于4°C，并 尽快用于后续DNA提取实验。结合物理化学的细胞裂解法和多种酶消化法，从海洋微生物 样品中提取并纯化得到质量好纯度高的海洋微生物宏基因组DNA (图1A)。
[0029] 2.根据已知Trk亚族基因设计简并引物，序列分别为表1中的HYS和HYA。以海 洋微生物宏基因组DNA为模板，简并引物HYS和HYA分别作为上游引物和下游引物，PCR扩 增trkH基因的部分保守片段，对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，回收720bp的DNA片段（图 1B)。将回收的片段连接到T载体上，并用热激转化法将载体导入DH5a感受态细胞内。将 细胞涂布于含有Amp抗生素的平板上进行筛选培养，待生长出阳性单菌落后，挑取菌落在 液体培养基中摇菌并提质粒送测序，测序后即可确定trkH基因的部分片段信息。根据已克 隆得到的trkH基因部分已知序列，向两侧方向各设计3条特异性巢式引物。5'端的巢式 引物序列分别为表1中的5-AU5-A2和5-A3,3'端的巢式引物序列分别为表1中的3-S1、 3-S2和3-S3。两侧的锚定实验分别先用最外侧引物进行单引物扩增PCR反应，再用dGTP 对产物进行加尾反应，然后以OiIgO d (C) 18和内侧的巢式引物进行巢式PCR，产物进行琼脂 糖凝胶电泳。根据NCBI上对已知部分序列进行的比对和分析，初步判断基因两侧剩余未知 区域的大小。5'端约650bp，3'端约200bp，切胶回收时切取目的大小及以上区域的胶块， 回收纯化连接到PMD18-T克隆载体上，连接产物转化大肠杆菌DH5 α感受态细胞，37°C过夜 培养；挑取单菌落摇菌，进行菌液PCR，再将阳性结果的菌液提取质粒，进行质粒PCR检测并 测序（图IC和图1D)。用Blast对上述实验中测序得到的序列信息进行比对和拼接，然后 用NCBI ORF Finder确定trkH基因完整ORF序列，设计全长引物Trk-S和Trk-A，以宏基因 组DNA为模板，进行PCR，回收纯化目的片段，连接到pMD18-T克隆载体上，连接产物转化大 肠杆菌DH5 α感受态细胞，37 °C过夜培养；挑取单菌落摇菌，进行菌液PCR，再提取阳性结果 菌液的质粒，进行质粒PCR检测（图1E)，确定阳性克隆并测序。测序结果表明此全长序列 与拼接序列相同，是正确完整的trkH基因。经过简并PCR和锚定PCR，将所得片段进行测序 和拼接，最终得到的trkH基因长度1392bp，编码一个由463个氨基酸构成的蛋白TrkH。
[0030] 用NCBI上的Protein Blast在线分析软件对TrkH蛋白的氨基酸序列进行分析， 结果显示序列具有一定保守性，属于TrkH超家族（图2)。与部分已做过功能分析的微生物 TrkHs蛋白进行同源性分析，同源性在22-36%之间（如表2)。利用ClustalX、BioEdit和 MEGA5. 0等软件对TrkH蛋白和已做过功能验证的其他细菌TrkHs氨基酸序列进行比较和系 统发育树分析，并用大肠杆菌EcTrkA(调节蛋白）序列做外群，以确保结果的准确性。结果 显示TrkH和已做过功能验证的其他细菌TrkHs之间亲缘关系较远（图3)。利用SMART软 件（ http://smart.embl-heidelberg.de/)对TrkH进行跨膜结构分析，结果表明其含有10 个跨膜结构域，与典型的原核微生物TrkH蛋白跨膜结构一致，证实是细菌来源的钾转运跨 膜蛋白（图4)。
[0031] 表1 trkH基因的克隆与分析中所用引物
[0032]
【主权项】
1. 一种来源于海洋微生物的钾离子转运蛋白基因trkH，其特征在于，具有如SEQ ID NO: 1所示的碱基序列。
2. 具有与SEQ ID NO: 1所示的碱基序列95%以上的同源性，且编码与SEQ ID NO: 1所 示的碱基序列编码的蛋白质具有相同生物学功能的蛋白质的碱基序列。
3. 如权利要求1所述基因编码的蛋白质TrkH，其具有如SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序 列。
4. 权利要求3所述蛋白质的衍生蛋白质，其特征在于，其具有如SEQ ID N0:2所示的氨 基酸序列经过一个或几个氨基酸残基取代、缺失或添加而产生的氨基酸序列，且该衍生蛋 白质与权利要求3所述的蛋白质具有相同的生物学功能。
5. 含有权利要求1或2所述基因的重组表达载体。
6. 含有权利要求5所述的重组表达载体的宿主细胞。
7. 根据权利要求6所述的宿主细胞，其特征在于，该宿主细胞为酿酒酵母CY162。
8. 权利要求1所述的基因在培育能够生长在低钾、盐胁迫环境下的农作物中的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种来源于海洋微生物的钾离子转运蛋白基因trkH，该基因具有如SEQ ID NO:1所示的碱基序列。本发明的基因trkH来源于海洋细菌，其编码的蛋白TrkH具有钾离子转运蛋白的功能，能提高转基因K+吸收缺陷型酿酒酵母的K+吸收效率和对Na+的不敏感性，从而提高其在缺钾且盐胁迫条件下的生长状况。这是该类基因首次在真核系统中鉴定到相关蛋白功能，培育相应转基因植物，将在农作物钾高效利用方面具有很高的应用价值，同时能够很好的应用于缺钾高盐环境中优良性状农作物的培育。
【IPC分类】C12R1-865, C12N15-81, C07K14-195, A01H5-00, C12N1-19, C12N15-31
【公开号】CN104862321
【申请号】CN201510292844
【发明人】苏乔, 张晓燕
【申请人】大连理工大学
【公开日】2015年8月26日
【申请日】2015年6月1日