一种水溶酶解法制备冻干活性胎盘粉的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于一种水溶提取和酶解相结合的制备生物活性胎盘冻干粉的方法。属于 保健食品的研制与开发领域。
【背景技术】
[0002] 胎盘又名"紫河车"，在我国作为传统中药滋补品已有悠久历史，现代科学研宄发 现，胎盘中含有丰富的免疫蛋白、营养多肽、细胞因子、萜类和激素类物质，具有提高造血能 力、卵巢保健、促进泌乳和美容等功能。胎盘的鲜品、干品均可入药，《本草纲目》对其性质、 药效作了详细的阐述：紫河车"味甘或咸"、"性平偏温"，归心、肺、肾经，具有安心养血、益 气、补精、解毒、补血的作用，对疲劳、消瘦、衰弱者有奇效，"久服者，耳聪目明，须发黑，延年 益寿，有夺造化之功"。《本草图经》中曰其主治"男女虚损劳极，不能生育，下元衰惫。"现 代医学发现，在临床上胎盘提取物制品可用于预防肝硬化、改善人体免疫力、治疗病毒性肝 炎、白细胞减少症、重症肌无力等免疫性疾病以及恶性肿瘤等。这是因为胎盘富含对人体有 用的蛋白质、糖、钙、维生素、干扰素、免疫球蛋白、生长因子、溶菌酶、激肽酶、蛋白酶等活性 物质，主要成分是蛋白质和各种酶。值得关注的是，新鲜人胎盘中还含有人绒毛膜促性腺激 素（HCG)、卵泡激素、黄体激素、催乳素等多种雌激素和孕激素。对人体内分泌调节，尤其是 对女性不孕不育和产后泌乳等有治疗和促进作用。
[0003] 胎盘中还含有大量的微小核糖核酸(微小RNA，或称microRNA) [Ouyang Y, Mouillet JF, Coyne CB, Sadovsky Y. Placenta-specific microRNAs in exosomes -good things come in nano-packages. Placenta. 2014;35 Suppl:S69-73. doi: 10. 1016/j. placenta. 2013. 11. 002.]。微小RNA是一种小的内源性非编码RNA分子，大约 由21 - 25个核苷酸组成。这些小的miRNA通过翻译水平的抑制或断裂靶标mRNAs而调节 一个或多个基因的表达。至今为止已经发现了 3000多个miRNA，其中胎盘衍生的多种微小 RNA在造血调控中发挥关键性作用，是最主要的基因表达调控因子之一，能够通过母婴传播 和通过肉食间接传递，并长期滞留，发挥调控作用。
[0004] 紫河车的传统炮制工艺主要采用烘、烤、焙干等方法干燥，处理温度都在100°c以 上，然后将干燥物研磨成细粉，由于制造温度高，导致胎盘中的活性蛋白肽、激素和微小RNA 等一些热敏性营养成分大量丢失，这样胎盘对人体的有用功效将大打折扣。同时烘烤得到 的产品腥臭难闻，服用后容易引起恶心、反胃等不良反应。
[0005] 胎盘中含有大量大分子的胶原物质和纤连蛋白，其不易被人体消化吸收。现有的 制备胎盘冻干粉的方法，如2014. 02. 12公布的"一种猪胎盘素的分离提取方法"，未经酶 解，仅提取了水溶性物质，损失了胎盘中丰富的胶原等成分；又如2010年3月3日公开的公 开号为10165853A的"利用液氮低温排氧从羊胎盘中提取羊胎素的方法"专利，公开的方法 是在胎盘中加入液氮，粉碎温度24-25?，将胎盘浆进行酶解60分钟，温度40°C，然后用生 理盐水提取、无机膜过滤、超高压灭菌。该方法的主要缺点是：1)粉碎在液氮下进行，条件 苛刻，设备投入高，生产成本高；2 )未将羊胎盘中的天然肽类活性物质，例如水溶性激素、细 胞因子、小分子核糖核酸分离出来就进行酶解，而蛋白酶也水解上述活性物质，破坏了上述 肽类活性物质，产品活性低；3)而且现有的酶解制备工艺，如2011年12月26日申请的申 请号为201110438853. X的"一种制备羊胎盘素和羊胎盘水解胶原浓缩液的方法"中，采用 截留分子量为2000-10000Da的超滤方法浓缩提及，丢失了大量的小分子活性物质。
【发明内容】
[0006] 为了解决以上技术问题，本发明提供了一种三步法制备胎盘生物活性粉的方法。
[0007] 本发明是通过以下技术方案利用水溶和酶解获得胎盘生物活性物质并冷冻干燥 成粉，以足月妊娠之健康胎盘为原料，先制备胎盘浆，然后经水溶浸出液获得水溶性蛋白肽 和核酸成分，不溶性残渣经蛋白酶酶解后短期高温失活，两种组分合并后，再冷冻干燥研磨 获得胎盘活性物质冻干粉，并经臭氧消毒处理即可，具体共包括以下步骤： 1) 采集足月正常妊娠的人胎盘，清洗，装入聚丙乙烯塑料样本袋，立即放入-20°c冷冻 保存； 2) 将冷冻胎盘初步解冻并清洗表面，切成约3cm3的小块后，用绞肉机搅为糜状的胎盘 浆； 3) 将胎盘浆与NaCl溶液按照质量（g):体积（mL)为1:8-1:12的比例，与0. 05-0. 8%的 NaCl溶液混匀，在4-10°C的温度下，200-300转/分钟搅拌提取0. 5-1. 5小时，对浸出液以 3000-10000转/min的速度进行管式离心机分离30min，对水溶性上清液进行-20°C冷冻保 存备用，对不溶性沉淀进行酶解操作； 4) 将胎盘不溶性沉淀加入恒温容器中，根据100~250U/g胎盘沉淀的浓度比例加入胃 凝乳蛋白酶，充分混匀后在36°C水浴环境中酶解2. 5h，再根据15~100U/g胎盘的浓度比例 加入胰蛋白酶，在36°C水浴环境中酶解0. 5h，最后在95°C水浴中加热20min使胰蛋白酶失 活，得到胎盘酶解液； 5) 将步骤4)所得的胎盘酶解液与步骤3)所得的水溶性上清合并，放入样品盘中，厚度 0. 5-1. 5cm，在-40°C冻结，置于真空冷冻干燥机隔板上，隔板设置温度为_25°C至_45°C，抽 真空度为抽真空度达到0. 161，冷阱温度-50°C，隔板温度-40°C，真空度0. 161，保持此状态 6-10h ;加热隔板温度至25°C，持续冷冻干燥l_2h。最终产品水分含量小于3. 5%，即进行下 一步粉碎处理； 6) 用带冷却夹套的粉碎机，在通入4-10°C冷却水的情况下，在4000-5000转/分的条 件下，粉碎10-15分钟，通过高速粉化制成胎盘酶解冻干粉，粉碎完成后，使用50-100目的 分样筛进行筛分，未过筛的颗粒再次进行粉碎； 7) 将胎盘冻干粉置于臭氧灭菌机中，在IPPM的臭氧浓度中，灭菌30min，细菌灭菌率 平均为95. 2%，霉菌灭菌率平均为95. 7%。其中细菌灭菌率最高为99.9%，最低灭菌率为 92. 8% ;霉菌灭菌率最高为100%，最低为92. 8%。
[0008] 应用本发明，利用人胎盘制备酶解冻干粉的水解度最高为35. 36%，冻干粉产率最 高为20%，经电泳检测，显示大分子蛋白降解成了小分子肽段。
[0009] 本发明研宄形成了一整套利用人胎盘三步法：水溶提取、酶解大分子蛋白技术和 真空冷冻干燥技术制备人胎盘冻干粉的优化工艺，为利用胎盘资源生产高附加值的营养保 健品提供了切实可行的技术方法和检测方法，具有产业化前景。
[0010] 该方法具有营养物质利用充分，操作步骤简单实用，资源综合利用率高，环保无污 染等特点。本发明的机理是：首先使用水溶液溶解胎盘浆中的水溶性激素、免疫因子、纤 连蛋白、氨基酸、小分子RNA和钙铁锌等营养成分，剩余残渣含有大分子组织蛋白和胶原蛋 白，可用蛋白酶短时间酶解获得酶解短肽链，两个部分合并后一起经过冷冻真空干燥，制备 出胎盘冻干粉，并经臭氧消毒后装胶囊成品。该生产工艺既可保持胎盘中水溶性营养小分 子的生物学活性，又能促进人体对胶原物质和纤连蛋白的吸收，达到对胎盘营养价值的最 大化，我们所采用的水溶+酶解的生产工艺，能最大程度的保留水溶性物质和大分子物质 全组分活性营养物质，并维持其生物学功能不变。
[0011] 在食品和药品等行业中都应用到各类干燥技术，公认的最适合于保持生物活性的 干燥