)，当天加入IFN-γ (1000 U/ml)，置 于培养箱培养；第2天加入IL-2 (500 U/ml)和抗⑶3单克隆抗体（50 ng/ml)，第3天补加 含等量因子的培养基；以后每2~3天更换新鲜培养基，补加等量因子。每隔1天通过台盼蓝 染色法计数并检测细胞免疫表型和活性，共培养15天后收获细胞。
[0024] 经过15天的培养扩增细胞数量均明显增多，镜下观察可见细胞快速增殖形成 的克隆球（图2中B所示)，对照组细胞总数平均由培养前平均细胞数4. 6±0.38X IO7 达到培养后细胞数5. 6±0. 45X 108,而添加50yg/mL胎盘粉的实验组细胞总数达到 7±0. 75X 108,高于对照组，但无统计学差异（图2中C所示)。 取上述各组扩增前后MNC细胞，各IXlO6个细胞。按Trizol试剂盒说明提取总 RNA;进行RT-PCR获得cDNA，检测颗粒酶（granzyme ) A、颗粒酶B、GM-CSF、颗粒溶素（ Granulysin )、IFN-γ、TGF-betal、TNF-α 和穿孔素（perforin )基因的表达，以 GAPDH 为内参基因，采用SYBR Green Dye I法在PCR仪MX 3000P进行定量PCR反应，以直接分离 的脐血MNC细胞作为对照组并将其结果设为1，实验数据通过CellQuest软件分析。结果 显示添加50 μ g/ml胎盘冻干粉的实验组淋巴细胞扩增后，其TNF- a、GM-CSF和IFN- γ等 相关细胞因子的mRNA表达水平均有不同程度增加，与未添加胎盘粉的对照组相比较，其中 IFN-γ、TGF-betal上调较为明显（/Χ0. 05)，其余因子均大幅上调（/Χ0. 01)。见图2中D所 不O
[0025] 如图2胎盘活性冻干粉能促进正常淋巴细胞的增殖和杀瘤能力.：A&B淋巴细胞 的增殖形态学观察（Mag 40X ) ;C:淋巴细胞增殖15天前后计数比较；D :淋巴细胞表达的 主要杀瘤基因的表达检测，对照组的表达量设为1，可见主要的杀瘤相关基因包括颗粒霉素 A/ B和肿瘤坏死因子alpha的表达均可被50 μ g/ml的胎盘冻干粉所促进，胎盘冻干粉组 中的造血相关因子GM-CSF表达也显著提高，而IFN-γ的表达变化不显著，* p〈 0. 05，林 p〈 0· 01。 4. 胎盘活性冻干粉能提高造血干细胞的集落生成能力 取新鲜正常分娩的健康脐带血，梯度密度离心法获得单个核细胞，调整细胞密度为 I X IO7个/100 μ L后，加入封闭液，置4°C放置20min，然后加入抗⑶34免疫磁珠标记细胞， 在4°C孵育30min后使用MACS的磁柱分离细胞，标记细胞在通过置于磁场中的分离柱时， CD34-细胞被洗脱除去，将分离柱移出磁场，加压洗脱，收集组分为CD34+细胞。将分选的 ⑶34+细胞与2ml半固体培养基混合均匀，种于35-mm培养皿，每孔lml，每孔接种1万个细 胞。维持在37°C、5% CO2饱和湿度环境培养14天，实验组在对照组半固体培养基的基础上 再添加终浓度为50 μ g/ml的胎盘冻干粉。在光学显微镜下根据集落中形成的多种血细胞 系的形态特征原位对集落形成细胞进行分类和计数。根据集落的形态可以分为红系集落 (CFU-E)，粒系集落（CFU-G)，巨核系集落（CFU-M)，粒-巨核系集落（CFU-GM)和混合系集落 (CFU-GEMM)，见图3中A ;集落计数统计结果见图3中B，可见添加50 μ g/ml胎盘冻干粉的 实验组的各组集落均高于对照组，证明添加胎盘冻干粉可以显著的促进造血干细胞的集落 形成能力 5. 胎盘活性冻干粉对大鼠泌乳量的影响 实验采用体重250~270 g的健康SD雌性大鼠和雄性大鼠，常规实验饲粮。实验前 期，雌性大鼠与雄性大鼠按照5:1的比例合笼饲养，待雌性大鼠受孕成功，采用单笼喂养， 12 h光照，环境温度为20~25°C，相对湿度50%~60%，自由饮水与采食。40只孕鼠在分娩 后随机分为4组，每组10个：对照组(常规颗粒鼠粮)，胎盘冻干粉IOg组(每天在饲料中 添加 IOg胎盘冻干粉/Kg饲料)，胎盘冻干粉50g组(每天在饲料中添加50g胎盘冻干粉/Kg 饲料)，胎盘冻干粉100g组(每天在饲料中添加 100g胎盘冻干粉/Kg饲料)。
[0026] 研宄发现，由于母鼠乳汁是其仔鼠营养的唯一来源，因此，哺乳仔鼠的增重基本准 确反映了母鼠的泌乳量，是反映母鼠泌乳性能的一个客观指标，大鼠泌乳性能的测定：将每 只泌乳大鼠及其哺育的仔鼠作为一个观察单位记录，分娩当日为第1天，称取仔鼠初生窝 重，隔天定时称重，计算仔鼠窝增重作为母鼠的泌乳量。由表2可知，添加胎盘冻干粉提高 了母鼠总泌乳量，虽然无统计学差异，但其提高作用普遍。
[0027] 表2胎盘冻干粉添加饲喂对仔鼠增重(泌乳量）的影响（n=10, means 土 SD)
【主权项】
1. 一种水溶酶解法制备冻干活性胎盘粉的方法，其特征在于包括如下步骤： 1) 采集足月妊娠的人胎盘，将胎盘装入塑料样本采集袋中，封口并立即放入-20°C冷 冻保存； 2) 将胎盘从-20°C冷冻箱中取出进行初步解冻，并用水将表面清洗，切成约3cm3的小 块后，用绞肉机搅拌为糜状物，称为胎盘浆； 3 )将胎盘浆与NaCl溶液按照质量：体积为1:8-1:12的比例，与0. 05-0. 8%的NaCl溶液 混匀，在4-10°C的温度下，200-300转/分钟搅拌提取0. 5-3小时，对浸出液以3000-10000 转/min的速度进行管式离心机分离20-60min，对上清液进行-20°C冷冻保存备用，对不溶 性沉淀进行酶解操作； 4) 将胎盘不溶性沉淀加入恒温容器中，根据100~250U/g胎盘沉淀的浓度比例加入胃 凝乳蛋白酶，充分混匀后在25-39°C水浴环境中酶解2-5h，再根据15~100U/g胎盘的浓度 比例加入胰蛋白酶，在25-39°C水浴环境中酶解0. 2-lh，最后在95°C水浴中加热IOmin使 胰蛋白酶失活，得到胎盘酶解液； 5) 所得的胎盘酶解液与步骤3)所得的水溶性上清合并后放入样品盘中，厚度 0. 5-1. 5cm，在-40°C冻结，置于真空冷冻干燥机隔板上，隔板设置温度为_25°C至_45°C，抽 真空度为抽真空度达到0. 12-0. 18,冷阱温度-50°C，持续冷冻干燥9h，然后加热隔板温度 至15-30°C，再持续冷冻干燥0. 5-3h，真空度0. 005-0. 01，使终产品水分含量小于3. 5%，即 进行下一步粉碎处理； 6 )将冻干后的产品放入带冷却夹套的粉碎机，在通入4-10 °C冷却水的情况下，在 4000-5000转/分的条件下，粉碎10-15分钟，通过高速粉化制成胎盘酶解冻干粉，粉碎完成 后，使用50-100目的分样筛进行筛分，未过筛的颗粒再次进行粉碎； 7)将胎盘冻干粉置于臭氧灭菌机中，在0. 5-5PPM的臭氧浓度中，灭菌20-50min。
【专利摘要】本发明公开了一种水溶酶解法制备冻干活性胎盘粉方法，该方法包括有匀浆、水溶、酶解、冷冻干燥和臭氧消毒等五个工艺阶段，将胎盘匀浆后首先将水溶性营养物质提出，不溶性物质经胃凝乳蛋白酶和胰蛋白酶酶解后，酶解产物与水溶物共同实现真空干燥，最后通过低温高速粉化。保证了胎盘营养物质的损失少，提高了分离提取效率，所制备的胎盘活性粉易于消化吸收，活性物质能保持在98%以上，为利用胎盘生产保健食品提供了可靠的科学依据与技术手段。
【IPC分类】A61K9/19, A61K38/02, C12P21/06
【公开号】CN104894201
【申请号】CN201510361662
【发明人】刘勇
【申请人】济南唐恩生物技术有限公司
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年6月26日