专利名称：人细胞纤连蛋白冻干粉制剂及其制备方法
技术领域：
本发明涉及药物制剂领域，具体而言，本发明涉及一种人细胞纤连蛋白的冻干粉制剂。更具体地说，本发明涉及一种人细胞纤连蛋白和/或其片断为活性成分，与可药用辅料配制成的冻干粉制剂。本发明还涉及制备这种人细胞纤连蛋白冻干粉制剂的方法。
背景技术：
人细胞纤连蛋白(Human Cellular Fibronectin)是人体细胞外基质的主要成分之一，为高分子量糖蛋白，由二聚体或多聚体组成，主要为微纤维和无定型的结构，广泛分布于细胞表面、基膜、疏松结缔组织和血管平滑肌周围。人细胞纤连蛋白具有粘附能力，维持细胞的正常结构及生理，维护胞壁的完整性、通透性及组织修复有重要作用，并参与细胞运动，对细胞有趋化性，促进细胞分裂，因此，在胚胎生长发育、肿瘤的发生和转移以及创伤的修复等病理生理过程中具有重要作用。
通过细胞工程技术，进行人工细胞培养，经过提取、纯化可以制备人细胞纤连蛋白。在这一制备过程中通常获得人细胞纤连蛋白的浓缩液，进一步开展理论研究和应用研究。
人细胞纤连蛋白作为一种活性蛋白在常温下是不稳定的，特别是在含水的介质中更容易变性或降解，使其生物活性丧失。在目前的研究中，将人细胞纤连蛋白制成浓缩液，放在4℃低温环境中，其活性只能保持2周左右。因此，人细胞纤连蛋白水溶液不能长期保存，更无法制成水溶液剂供临床使用。然而，在许多场合人细胞纤连蛋白只有在溶液状态下才适合于研究和应用，特别是临床应用，更需要以水溶液的剂型给药。为此，我们将浓缩液进一步制成冻干粉剂，并以冻干粉剂型在低温下长期保存，临用之前再配制成水溶液。这样就能在维持其生物活性的同时，延长人细胞纤连蛋白的保存期。通过研究，我们达到了这一目标，制备出可以长期保存的冻干粉剂。
发明目的本发明的目的是提供了一种人细胞纤连蛋白冻干粉制剂；本发明的另一目的是提供了一种制备人细胞纤连蛋白冻干粉制剂的方法；本发明的另一目的是提供了一种人细胞纤连蛋白冻干粉制剂，不仅可以作为人细胞纤连蛋白的原料进行存贮、运输以及进一步制备成外用或口服制剂的应用；而且可以直接作为注射剂使用。
发明内容
本发明人进行了大量的研究，筛选出人细胞纤连蛋白冻干粉制剂的配方和制备工艺，不仅满足了稳定性好、能长期贮藏、使用方便，并显示出良好的生物活性。由此，完成了本发明。
本发明的人细胞纤连蛋白的冻干粉制剂，含有作为活性成分的人细胞纤连蛋白和/或片断与可药用辅料制成，其中，人细胞纤连蛋白和/或片断在冻干粉制剂中的重量百分比可以是0.1～50％，优选0.5～30％，更优选1～15％，其在制剂中的含量范围是0.1～10mg，优选0.2～2mg；可药用辅料可以是选自氯化钠、氯化钾、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、枸橼酸、枸橼酸钠、三羟甲基氨基甲烷、磷酸、盐酸或氢氧化钠中的一种或多种，可药用辅料在冻干粉制剂中的含量可以是制剂重量的50～99.9％，优选70～99.5％，更优选85～99％。
本发明的人细胞纤连蛋白冻干粉制剂可以通过下列步骤制备a.配制辅料溶液用注射用水溶解占制剂重量50～99.9％的可药用辅料配制成辅料溶液。
b.配制药物溶液取占制剂重量的0.1～50％的人细胞纤连蛋白和/或片断，用上述辅料溶液定容到一定的体积。
c.除菌将药物溶液用除菌滤器过滤除菌。
d.灌装将除菌的药物溶液无菌灌装到西林瓶中一定的体积。
e.冻干在低温真空下进行冷冻干燥，抽真空，加塞，扎盖，即得人细胞纤连蛋白冻干粉制剂。
本发明的人细胞纤连蛋白冻干粉制剂的制备方法，其配制辅料溶液所用的可药用辅料可以选自氯化钠、氯化钾、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、枸橼酸、枸橼酸钠、三羟甲基氨基甲烷、磷酸、盐酸或氢氧化钠中的一种或多种。
本发明的人细胞纤连蛋白冻干粉制剂的制备方法，其制成的冻干粉制剂再溶解后的水溶液具有的pH值范围是6～8，并且具有注射剂适宜的渗透压。
本发明的人细胞纤连蛋白冻干粉制剂为其理论和应用的研究提供了一种稳定性好、能长期保存、使用方便的新剂型。本发明的人细胞纤连蛋白冻干粉制剂不仅可以作为人细胞纤连蛋白的原料进行存贮、运输以及进一步制备成外用或口服制剂应用于临床；而且可以直接作为注射剂使用，用于治疗各种纤连蛋白缺失症，如弥漫性血管内凝(DIC)，大手术后，严重创伤，烧伤或伴重症感染，休克等疾病。
具体实施例方式
以制备每瓶含量为1mg的人细胞纤连蛋白冻干粉制剂为例，说明本发明的具体过程和步骤。制备人细胞纤连蛋白冻干粉制剂使用的物料在冻干粉制剂中的重量范围是人细胞纤连蛋白1.0mg氯化钠2.0～10.0mg磷酸二氢钾2.0～10.0mg氢氧化钠 适量配制辅料溶液取注射用水适量，溶解2～10g的磷酸二氢钾，再用0.1mol/L的氢氧化钠调pH值至6～8，加入并溶解2～10g的氯化钠，用注射用水稀释到一定体积，使磷酸盐的含量为0.05M，氯化钠的含量为0.1M。
配制药物溶液取含量为1000mg的人细胞纤连蛋白和/或片断的浓缩液，用上述辅料溶液稀释至1000ml，制成1mg/ml的药物溶液。
除菌将配制的药物溶液以无菌操作法进行微孔滤膜滤器除菌，使用0.22μm微孔滤膜，在压力0.1Mpa以下正压滤过。滤前应先进行起泡点试验，滤后取样进行半成品质量检查，应符合规定。
灌装在洁净度100级环境中，将合格的除菌药液罐装于清洗干净并灭菌的西林瓶中，每瓶装量1ml，灌装1000支，半加胶塞。
冻干将灌装的西林瓶放在冻干箱内，在-40℃以下预冻2小时，然后升温至瓶内制品变全白，同时保持一定的真空度，直至冻干结束，最后真空全加塞，轧盖，包装，即得到每瓶含量为1mg的人细胞纤连蛋白冻干粉制剂。
以下实施实例进一步说明本发明。但是，应当理解本发明不以任何方式限于这些实例。
实施例1人细胞纤连蛋白0.1～10.0mg氯化钠2.0～10.0mg磷酸二氢钾2.0～10.0mg氢氧化钠 适量实施例2人细胞纤连蛋白0.1～10.0mg氯化钠2.0～10.0mg氯化钾0.1～1.0mg磷酸氢二钠1.0～10.0mg磷酸二氢钾0.1～1.0mg实施例3人细胞纤连蛋白0.1～10.0mg氯化钠2.0～10.0mg磷酸氢二钠1.0～10.0mg磷酸 适量实施例4人细胞纤连蛋白0.1～10.0mg氯化钠2.0～10.0mg三羟甲基氨基甲烷 1.0～10.0mg盐酸 适量实施例5人细胞纤连蛋白0.1～10.0mg氯化钠2.0～10.0mg磷酸氢二钠1.0～10.0mg磷酸二氢钠1.0～10.0mg
试验7、不同药物联合的体外增效作用取2×105个结核杆菌培养24小时后用同浓度(5ug/ml)不同药物处理24小时，检测细胞生长抑制率(％)，结果见表5表5 不同药物联合的增效作用(抑制率％)
在实验7中，A氧氟沙星；B卷曲霉素；C牛黄去氧胆酸钠。结果表明，所用抗结核病药单独应用均有明显的抑菌作用，但联合应用的效果为好(P＜0.01)。就同样剂量而言，三种药物的联合较两种的更好。
总之，局部放置及局部注射单一抗结核药物缓释剂对结核菌生长均有明显的抑制作用，两种或两种以上药物的联合会明显增效，所表现出的治疗作用和增效作用均与其局部获得的有效药物浓度有关。因此，本发明所述的缓释剂的有效成分为两种或两种以上药物的组合。
含有以上有效成分的药物可制成缓释微球，进而制成缓释注射剂和植入剂，其中以与含助悬剂的特殊溶媒组合形成的混悬注射剂为优选。
缓释注射剂或缓释植入剂还可通过以下实施方式得以进一步说明。上述实施例及以下实施例只是对本发明作进一步说明，并非对其内容和使用作任何限制。
具体实施方式
实施例1.
将90、90和80mg聚苯丙生(对羧苯基丙烷(p-CPP)∶葵二酸(SA)为20∶80)共聚物分别放入(甲)、(乙)及(丙)三个容器中，然后每个中加100毫升二氯甲烷，溶解混匀后，分别加入10mg氧氟沙星、10mg卷曲霉素、10mg氧氟沙星和10mg卷曲霉素，重新摇匀后用喷雾干燥法制备含10％氧氟沙星、10％卷曲霉素及10％氧氟沙星和10％卷曲霉素的注射用微球。然后将微球悬浮于含15％甘露醇的生理盐水中，制得相应的混悬型缓释注射剂。注射剂的黏度为300cp-600cp(20℃-30℃时)。该缓释注射剂在体外生理盐水中的释药时间为20-30天，在小鼠皮下的释药时间为40-50天左右。
实施例2.
加工成缓释注射剂的方法步骤与实施例1相同，但所不同的是所含抗结核有效成分及其重量百分比为(a)2-50％的氧氟沙星、环丙沙星或司帕沙星与2-50％的卷曲霉素的组合；(b)2-50％的氧氟沙星、环丙沙星或司帕沙星与2-50％的牛黄胆酸钠或牛黄去氧胆酸钠<p>实施例17化合物g 10-(3，5-二甲氧基苄基)-10-(3-甲氧基苄基)蒽酮的合成在氮气保护下，将1mmol 10-(3，5-二甲氧基苄基蒽酮(式(5)化合物)和1.0mmol 3-甲氧基苄基氯(通式(2)化合物)加入一个25ml的三口烧瓶中，并加入微量的18冠6(25mg，0.09mmol)，碘化钾(50mg，0.30mmol)，氢氧化钾(137mg，2mmol，82％)，丙酮(干燥)(8ml，0.11mol)，65℃搅拌1.5小时，冷却至室温(20℃)，常压过滤，并用二氯甲烷洗掉吸附在生成盐(如氯化钾)上的有机物，将滤液旋干，柱色谱分析，得到10-(3，5-二甲氧基苄基)-10-(3-甲氧基苄基)蒽酮。
实施例18化合物g 10-(3，5-二甲氧基苄基)-10-(3-甲氧基苄基)蒽酮的合成在氮气保护下，将1mmol 10-(3，5-二甲氧基苄基蒽酮(式(5)化合物)和1.2mmol 3-甲氧基苄基氯(通式(2)化合物)加入一个25ml的三口烧瓶中，并加入微量的18冠6(25mg，0.09mmol)，碘化钾(50mg，0.30mmol)，氢氧化钾(137mg，2mmol，82％)，丙酮(干燥)(8ml，0.11mol)，70℃搅拌1小时，冷却至室温(20℃)，常压过滤，并用二氯甲烷洗掉吸附在生成盐(如氯化钾)上的有机物，将滤液旋干，柱色谱分析，得到10-(3，5-二甲氧基苄基)-10-(3-甲氧基苄基)蒽酮(式(6)化合物)。
表4
实验结果，试验组和对照组动物注射部位的肌肉均未出现红肿、充血、渗出、变性或坏死等局部反应，表明人细胞纤连蛋白冻干粉制剂作为注射剂使用时无刺激性。
实验4热源检查依照中国药典2005年版的热源检查法进行检查，结果表明人细胞纤连蛋白冻干粉制剂所含热源的限度符合规定。
实验5异常毒性检查依照中国药典2005年版的异常毒性检查法进行检查，结果表明人细胞纤连蛋白冻干粉制剂的异常毒性检查符合规定。
实验6人细胞纤连蛋白冻干粉制剂的外用剂制备配制外用剂的基质溶液取注射用水配制pH 6～8、磷酸盐含量为0.05mol/L、氯化钠含量为0.1mol/L的溶液，灭菌，分装血清瓶中备用。
使用时将外用剂的基质溶液2ml注入含量为1mg的人细胞纤连蛋白冻干粉制剂小瓶中，轻轻振摇使溶解，即得到浓度为0.5mg/ml的溶液剂。依据临床需要将上述溶液的一定量喷雾或滴涂到使用部位。该溶液可一次性用完，也可在低温下冷藏一个月内使用。
权利要求
1.一种人细胞纤连蛋白的冻干粉制剂，其含有作为活性成分的人细胞纤连蛋白和/或片断与可药用辅料制成，其中，人细胞纤连蛋白和/或片断在冻干粉制剂中的重量百分比可以是0.1～50％，其在制剂中的含量范围是0.1～10mg；可药用辅料可以是选自氯化钠、氯化钾、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、枸橼酸、枸橼酸钠、三羟甲基氨基甲烷、磷酸、盐酸或氢氧化钠中的一种或多种，可药用辅料在冻干粉制剂中的含量可以是制剂重量的50～99.9％。
2.根据权利要求1的人细胞纤连蛋白冻干粉制剂，其中，人细胞纤连蛋白和/或片断在冻干粉制剂中的重量百分比可以是0.5～30％，可药用辅料在冻干粉制剂中的含量可以是制剂重量的70～99.5％。
3.根据权利要求2的人细胞纤连蛋白冻干粉制剂，其中，人细胞纤连蛋白和/或片断在冻干粉制剂中的重量百分比可以是1～15％，可药用辅料在冻干粉制剂中的含量可以是制剂重量的85～99％。
4.根据权利要求1～3之一的人细胞纤连蛋白冻干粉制剂，其中，人细胞纤连蛋白和/或片断在冻干粉制剂中的含量范围是0.2～2mg。
5.一种制备权力要求1～4之一的人细胞纤连蛋白冻干粉制剂的方法，包括下列步骤a.配制辅料溶液用注射用水溶解占制剂重量50～99.9％的可药用辅料配制成辅料溶液。b.配制药物溶液取占制剂重量的0.1～50％的人细胞纤连蛋白和/或片断，用上述辅料溶液定容到一定的体积。c.除菌将药物溶液用除菌滤器过滤除菌。d.灌装将除菌的药物溶液无菌灌装到西林瓶中一定的体积。e.冻干在低温真空下进行冷冻干燥，抽真空，加塞，扎盖，即得人细胞纤连蛋白冻干粉制剂。
6.根据权利要求5的方法，其中，配制辅料溶液所用的可药用辅料可以选自氯化钠、氯化钾、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、枸橼酸、枸橼酸钠、三羟甲基氨基甲烷、磷酸、盐酸或氢氧化钠中的一种或多种。
7.根据权利要求5和6的方法，其中，人细胞纤连蛋白冻干粉制剂再溶解后的水溶液具有的pH值范围是6～8。
8.根据权利要求5～7的方法，其中，人细胞纤连蛋白冻干粉制剂再溶解后的水溶液具有注射剂适宜的渗透压。
全文摘要
本发明涉及一种人细胞纤连蛋白冻干粉制剂，其含有作为活性成分的人细胞纤连蛋白和/或片断与可药用的辅料制成。本发明还涉及制备这种人细胞纤连蛋白冻干粉制剂的方法。本发明的人细胞纤连蛋白冻干粉制剂为其理论和应用的研究提供了一种稳定性好、能长期保存、使用方便的新剂型。本发明的人细胞纤连蛋白冻干粉制剂不仅可以作为人细胞纤连蛋白的原料进行存贮、运输以及进一步制备成外用或口服制剂应用于临床；而且可以直接作为注射剂使用，用于治疗各种纤连蛋白缺失症等疾病。
文档编号A61P17/00GK1857720SQ20061001752
公开日2006年11月8日 申请日期2006年3月16日 优先权日2006年3月16日
发明者张怡, 于 玲, 陈小兰, 金城, 张若飞 申请人:张怡