一种生物发酵生产α熊果苷的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物发酵领域，具体涉及一种生物发酵生产α熊果苷的方法。
【背景技术】
[0002]熊果苷，又名熊果甙、熊果素、熊果叶甙、熊果酚甙或杨梅甙，是一种源于杜鹃花科熊果属的多年生常绿小灌木植物-熊果的叶子细胞里的皮肤脱色成份。
[0003]熊果苷是源于绿色植物的天然活性物质，集“绿色植物、安全可靠”和“高效脱色”三者合谐统一于一体的皮肤脱色组份，它能迅速渗入肌肤，在不影响细胞增殖浓度的同时，能有效地抑制皮肤中的酪氨酸酶的活性，阻断黑色素的形成，通过自身与酪氨酶直接结合，加速黑色素的分解与排泄，从而减少皮肤色素沉积，祛除色斑和雀斑，而且对黑色素细胞不产生毒害性、刺激性、致敏性等副作用，同时还有杀菌、消炎的作用。它是当今流行的最为安全有效美白原料，也是二十一世纪的理想皮肤美白祛斑活性剂。
[0004]熊果苷能有效地抑制皮肤中的生物酪氨酸酶活性，阻断黑色素的形成，通过自身与酪氨酶直接结合，加速黑色素的分解与排泄，从而减少皮肤色素沉积，祛除色斑和雀斑，是目前国内外常用于美白化妆品中的主要原料。近年来，国内熊果苷的生产和相关化妆品的开发有了迅速的发展，国外对熊果苷的研宄和开发更为深入，并取得了许多进展。熊果素有α和β两型，研宄发现，α型对酪氨酸酶活性的抑制力比β型强约10倍。α型熊果苷的美白机理是直接抑制酪氨酸酶活性，从而达到减少黑色素的生成，同时还发现，浓度为I mM的α型熊果苷未见抑制细胞生长，而β型熊果苷在同样浓度则出现有效的抑制，进一步说明α型熊果苷不是通过杀死黑素细胞来实现人体皮肤的美白效果的。此外，α型熊果苷与人体黑素瘤细胞培养过程中未发现对苯二酚的存在。这不仅说明了 α型熊果苷在使用过程中是稳定的，而且进一步说明了 α型熊果苷的美白作用是其本身的作用而不是其通过分解对苯二酚来实现。而β型熊果苷会使人体降低人体自身对紫外线的防御。因此使用α型熊果苷作为化妆品添加剂比β型熊果苷更安全，且对人体没有任何副作用。
[0005]目前国内外对于α型熊果苷的研宄较多，其中国外对于熊果苷的研宄比较充分，同时已经有了在化妆品领域的应用，而国内研宄熊果苷并没有十分深入，对于制备熊果苷的方法主要是通过化学方法合成，但是通过化学方法合成的方式并不能生产α熊果苷，而对于发酵方法生产国内也只是在前期研宄的过程中，并没有报道可以成功进行大规模发酵生产。申请号为201110431955.9的中国专利公开了一种利用脂肪酶催化合成α -熊果苷的方法，其能够通过假丝酵母脂肪酶催化合成α -熊果苷，但是其合成过程比较复杂，对于大规模生产不易控制，且生产成本较高。
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于为了克服以上现有技术的不足而提供一种生物发酵生产α熊果苷的方法，能够实现α熊果苷的大规模生产，同时工艺过程简单易控，α熊果苷合成转化率高。
[0007]本发明的技术方案如下:
一种生物发酵生产α熊果苷的方法，利用液化面粉、麸皮、碳酸钙、磷酸二氢钾、乙二胺四乙酸二钠和尿素作为发酵基质，在其中加入对苯二酚，利用米曲霉{Aspergillusoryzae)进行发酵制备而成。
[0008]所述的生物发酵生产α熊果苷的方法，步骤如下:
步骤一，将小麦面粉加入水中进行液化，得到液化面粉；
步骤二，将麸皮、碳酸钙、磷酸二氢钾、乙二胺四乙酸二钠和尿素加入到液化面粉中，搅拌混合均匀，得到混合基体；
步骤三，将米曲霉{Aspergillus oryzae)接入牛肉膏蛋白胨培养基中，于40_42°C的条件下培养活化5-10小时；
步骤四，将步骤三中的米曲霉接入步骤二的混合基体中，在38-40°C的条件下培养3-6小时，然后在混合基体中加入对苯二酚，混合均匀，保持发酵温度42-45°C，发酵时间24-48小时，得到发酵混合物；
步骤五，将发酵混合物加入到乙醇中浸泡3-5小时，并加入0.1M的盐酸，混合均匀，超声提取20-30分钟，过滤得到滤液一；
步骤六，将滤液一采用纳滤的方式过滤，得到滤液二 ；
步骤七，将滤液二进行旋转蒸发，得到α熊果苷。
[0009]所述的生物发酵生产α熊果苷的方法，步骤一中小麦面粉液化的方法为在小麦面粉中加入10-15倍重量份的水，搅拌混合均匀，然后加热至80-85°C，搅拌30-40分钟，得到液化面粉。
[0010]所述的生物发酵生产α熊果苷的方法，步骤二中加入麸皮与小麦面粉的质量比为0.1-0.3:1，加入碳酸钙与小麦面粉的质量比为0.04-0.06:1，加入磷酸二氢钾与小麦面粉的质量比为0.02-0.05:1，加入乙二胺四乙酸二钠与小麦面粉的质量比为0.01-0.03:1，加入尿素与小麦面粉的质量比为0.01-0.03:1。
[0011]所述的生物发酵生产α熊果苷的方法，步骤三中米曲霉的接种量为0.6_1%。
[0012]所述的生物发酵生产α熊果苷的方法，步骤四中米曲霉的接种量为0.3-0.5%。
[0013]所述的生物发酵生产α熊果苷的方法，步骤四中对苯二酚加入的量为混合基体中固体物质质量的0.04-0.08%，对苯二酚的加入方式为以喷雾的形式喷到混合基体表面。
[0014]所述的生物发酵生产α熊果苷的方法，步骤五中的乙醇为无水乙醇，加入无水乙醇与混合基体的质量比为1-2:1。
[0015]所述的生物发酵生产α熊果苷的方法，步骤五中加入盐酸的量为加入乙醇量的1-4% ο
[0016]所述的生物发酵生产α熊果苷的方法，步骤六中纳滤采用的纳滤膜的截留分子量是 200-400Da。
[0017]本发明提供了一种利用微生物发酵合成α熊果苷的方法，发明人在大量实验的基础上创造性的发现，通过米曲霉可以进行发酵生产α熊果苷，而通过利用液化面粉、麸皮、碳酸钙、磷酸二氢钾和尿素作为发酵基质，通过在发酵过程中加入对苯二酚，能够发酵制备得到α熊果苷，而在分离α熊果苷的过程中，采用了纳滤的手段，可以有效的截留滤液中的离子，从而达到有效的分离α熊果苷的作用。相对于常用的大孔树脂分离α熊果苷的方式，使用纳滤的手段提高了效率，简化了工艺，同时达到了非常好的分离效果。发明人在研宄的过程中，按照常规的方式在发酵过程中加入了对苯二酚和葡萄糖，结果显示加入葡萄糖后，最终得到α熊果苷的转化率反而降低，另外，在培养基中加入乙二胺四乙酸二钠可以有助于提高α熊果苷提取纯度和转化率。由此可见，采用本发明提供的发酵基质进行发酵可以更好的制备得到α熊果苷。
[0018]【具体实施方式】:
下面通过【具体实施方式】对本发明作进一步详细说明。但本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
[0019]本发明在对滤液一进行精滤的过程中，为了能够除去滤液一中的杂质离子，采用了纳滤的手段，通过纳滤可以进一步对滤液中的α熊果苷进行了纯化，提高了收率，同时方便利后期可以更好的对α熊果苷进行提纯处理。本发明采用的纳滤膜为能够有效去除钙镁离子以及其他重金属离子的膜，可以使用乙酸纤维素系聚合物、聚酰胺、磺化聚砜、聚丙烯腈、聚酯、聚酰亚胺和乙烯基聚合物等高分子材料。这些膜都可以从市场上直接购买获得。
[0020]实施例1
一种生物