一种从珍珠蛋白中酶解分离珍珠活性多肽的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及珍珠深加工方法，尤其涉及一种从珍珠蛋白中酶解分离珍珠活性多肽 的方法。
【发明内容】
[0002] 目前，珍珠粉的应用过程中，曾相继遇到颗粒大小安全隐患、流动性差、不溶水以 及功效成分难以释放等诸多问题，这些直接影响珍珠粉的应用领域。为能解决以上问题，业 内已经向水溶性珍珠粉以及珍珠水解液发展。
[0003] 中国发明专利（【申请号】01139157.X申请日：2001-12-19)公开了一种珍珠粉的 生物酶解制备方法，其关键是以乳酸水溶液为溶剂，将珍珠溶解，并调整溶液的pH值至 近中性再用酸回调至偏酸性，再放入适量生物活性酶催化分解其蛋白质，得到酶解珍珠胶 液，再采用喷雾干燥将酶解珍珠胶液快速干燥，固化造粒，制得超细酶解珍珠粉。所制备 的珍珠粉保留了珍珠中的多种氨基酸、微量元素等有效成份，并使珍珠中的碳酸钙转化为 人体易吸收的活性钙，胃酸不溶解的角质蛋白酶解成易吸收的游离氨基酸。
[0004] 中国发明专利（【申请号】200710141569. X申请日：2007-08-07)公开了一种制备 珍珠活性肽的方法，它从新活的珍珠贝里取出珍珠粒，水洗干净，将珍珠粒与去离子水混 合后，用磷酸盐缓冲溶液将混合液的PH值调至中性偏酸，然后用沙雷肽酶与珍珠粒进行 酶水解反应；用滤网过滤分离得珍珠粒和澄清液，然后将反应液水煮灭酶；再将所得的溶 液经喷雾干燥即得珍珠活性肽。
[0005] 中国发明专利（【申请号】200910114409. 5申请日：2009-09-18)公开了珍珠水解 液的制备方法，其步骤如下：1)取珍珠粉置于盐酸水溶液中，搅拌，直至反应完全，用氨水 调节该混合液的PH值至中性，离心，得沉淀A ;2)沉淀A用纯净水溶解，再以氨水调节其pH 值为7. 5~8. 5,离心，得沉淀B ;3)沉淀B用纯净水溶解，加入酶进行酶解，酶解液离心，得 上清液和沉淀C ;所述的酶为蜗牛蛋白酶和木瓜蛋白酶的混合物，加入量为沉淀B重量的 0. 3~1. 05% ;4)将沉淀C用纯净水溶解加酶进行二次酶解，离心，收集上清液；酶为胰蛋 白酶、木瓜蛋白酶和中性蛋白酶的混合物，加入量为沉淀B重量的0. 2~0. 45% ;5)合并两 次上清液，煮沸，用孔径为1~3nm的纳滤膜过滤，即得。
【发明内容】
[0006] 为了解决上述的技术问题，本发明的目的是提供一种从珍珠蛋白中酶解分离珍珠 活性多肽的方法，本该方法利用机械化学原理，快速无破损地分离珍珠功效成分，获得珍珠 活性多肽，为珍珠护肤品和保健品提供原料。
[0007] 为了实现上述的目的，本发明采用了以下的技术方案： 一种从珍珠蛋白中酶解分离珍珠活性多肽的方法，该方法包括以下的步骤： 1) 在将珍珠蛋白溶液中加入5~20倍pH值6. 5~7. 5的磷酸盐缓冲液，匀质； 2) 将匀质后混合液的进入100~120°C，0. 15~0. 2MPa环境下预处理20~60分钟处 理； 3)将混合液置于反应锅中，加入体系质量0. 5%~2%的中性蛋白酶，在40~70°C温度 中进行酶催化反应4~8小时,反应结束后在沸水浴灭酶5~15min,离心,去上清液,即为 珍珠活性多肽。
[0008] 作为优选，所述的珍珠活性多肽灭菌处理，无菌灌装，压盖制成珍珠活性多肽。
[0009] 本发明由于采用了上述的技术方案，将珍珠粉中功效成分进行分离，并将机械化 学原理应用于制备方法中。机械方法能在不破坏珍珠粉成分活性的基础下，进行珍珠粉重 要成分的分离提取，珍珠粉中蛋白的获得，并纯化后酶解，能够更为有效发挥珍珠粉美白的 作用。此方法的应用，极大的扩大珍珠粉的应用领域，并精细化珍珠粉的深加工应用。
【附图说明】
[0010] 图1为实施例1的经压力温度处理过后的珍珠蛋白相比未处理过的珍珠蛋白酶解 效果存在明显的提升作用。
[0011] 图2为实施例1制得的珍珠活性多肽成分分析图。
[0012] 图3实施例1制得的珍珠复合美白因子对酪氨酸酶活性的影响图。
[0013] 图4为实施例1制得的珍珠活性多肽对细胞生长的影响图。
[0014] 图5为实施例1制得的珍珠复合美白因子对细胞内黑色素含量的影响图。
[0015] 图6为显微镜观察珍珠复合美白因子对细胞的影响，a c分别表示添加珍珠复合 美白因子24h和48h的细胞生长情况，b d分别表示未添加珍珠复合美白因子24h和48h的 细胞生长情况。
【具体实施方式】
[0016] 下面结合实施例，对本发明做进一步详细说明，但本发明不仅限于以下实施例。
[0017] 实施例1 一种从珍珠中分离得到可溶食用钙的方法，包括以下原料和步骤：将珍珠粉碎至纳米 级10~lOOnm，然后加入6份的去离子水，通过压力IMPa和温度50°C的协同，将珍珠粉进 行微乳化，然后将珍珠粉乳液进行电渗析，选择压力为30~40V，流速60~80L/h，浓水池 装去离子水5L，淡水池装珍珠粉乳液15L，进行循环脱钙Ca 2+ 1~3 h，每隔15min取样测定 珍珠粉乳液中的电导率和钙盐含量。将获得含钙盐溶液过滤得到透明清夜，灭菌处理，无菌 灌装，即为珍珠可溶性液体钙。
[0018] 将获得的珍珠蛋白溶液中加入10倍pH值7.0的磷酸盐缓冲液，匀质；首先进入 120°C、0. 15MPa环境下预处理40分钟处理，然后将混合液置于反应锅中，加入体系质量 1. 0%的中性蛋白酶,在40°C温度中进行酶催化反应6小时，反应结束后在沸水浴灭酶5~ 15min，离心，去上清液，即为珍珠活性多肽。
[0019] 实施例2 一种从珍珠中分离得到可溶食用钙的方法，包括以下原料和步骤：将珍珠粉碎至纳米 级10~lOOnm，然后加入10份的去离子水，通过压力IOMPa和温度40°C的协同，将珍珠粉 进行微乳化，然后将珍珠粉乳液进行电渗析，选择压力为30~40V，流速60~80L/h，浓水 池装去离子水5L，淡水池装珍珠粉乳液10L，进行循环脱钙Ca 2+ 2h。获得含钙盐溶液真空 干燥研磨制成粉状珍珠蛋白保健品和化妆品原料。
[0020] 将获得的珍珠蛋白溶液中加入15倍pH值6. 5的磷酸盐缓冲液，匀质；首先进 入KKTC、0. 2MPa环境下预处理40分钟处理，然后将混合液置于反应锅中，加入体系质量 1. 0%的中性蛋白酶,在40°C温度中进行酶催化反应6小时，反应结束后在沸水浴灭酶5~ 15min，离心，去上清液，即为珍珠活性多肽。
[0021] 实施例3 一种从珍珠中分离得到可溶食用钙的方法，包括以下原料和步骤：将珍珠粉碎至纳米 级10~lOOnm，然后加入10份的去离子水，通过压力15MPa和温度30°C的协同，将珍珠粉 进行微乳化，然后将珍珠粉乳液进行电渗析，选择压力为30~40V，流速60~80L/h，浓水 池装去离子水2L，淡水池装珍珠粉乳液10L，进行循环脱钙Ca 2+ 2h。获得含钙盐溶液真空 干燥研磨制成粉状珍珠蛋白保健品和化妆品原料。
[0022] 将获得的珍珠蛋白溶液中加入8倍pH值7. 5的磷酸盐缓冲液，匀质；首先进入 120°C、0. 15MPa环境下预处理60分钟处理，然后将混合液置于反应锅中，加入体系质量 1. 0%的中性蛋白酶，在50°C温度中进行酶催化反应5小时，反应结束后在沸水浴灭酶5~ 15min，离心，去上清液，即为珍珠活性多肽。
[0023] 试验例1 1、 实施例1制备的珍珠活性多肽（以下称珍珠复合美白因子溶液）成分分析 经过氨基酸分析仪、凯式定氮仪和原子吸收分光光度计等仪器的精密检测，获得如下 数据。这些数据说明，较之以往的水解珍珠液蛋白含量>0. 15%，珍珠复合美白因子溶液中含 有较高的蛋白质含量为1.58%，蛋白质含量明显升高。并且未检测到钙离子，说明溶液中不 再存在钙元素。
[0024] 表1珍珠复合美白因子溶液成分分析表
2、 分子量分析 进行液相串联质谱分析，看到珍珠复合美白因子中有效成分分子量均在1000 Da以内， 说明蛋白质酶解完全，多肽为寡肽、三肽、二肽以及各种氨基酸。有益于皮肤吸收，以及充分 发挥多肽和氨基酸的活性功能。
[0025] 、抑制黑色素 ①珍珠复合美白因子溶液对酪氨酸酶的影响 珍珠复合美白因子能明显抑制细胞内酪氨酸酶活性。8%浓度时，珍珠复合美白因子对 细胞内酪氨酸酶活性达到半抑制剂量。
[0026] ②珍珠复合美白因子溶液对B16黑色素瘤细胞的影响 A、对细胞生长的影响 根据B16细胞生长的结果，样品浓度达到10%时对细胞的存活率仍几乎没有影响，并且 相对于对照，珍珠复合美白因子还能促进细胞生长。
[0027] B、对细胞中黑色素的影响 结果表明，4%浓度时，珍珠复合美白因子溶液能明显减少黑色素的相对含量。
【主权项】
1. 一种从珍珠蛋白中酶解分离珍珠活性多肽的方法，其特征在于该方法包括以下的步 骤： 1) 在将珍珠蛋白溶液中加入5~20倍pH值6. 5~7. 5的磷酸盐缓冲液，匀质； 2) 将匀质后混合液的进入100~120°C，0. 15~0. 2MPa环境下预处理20~60分钟处 理； 3) 将混合液置于反应锅中，加入体系质量0. 5%~2%的中性蛋白酶，在40~70°C温度 中进行酶催化反应4~8小时,反应结束后在沸水浴灭酶5~15min,离心,去上清液,即为 珍珠活性多肽。2. 根据权利要求1所述的一种从珍珠蛋白中酶解分离珍珠活性多肽的方法，其特征在 于珍珠活性多肽灭菌处理，无菌灌装，压盖制成珍珠活性多肽。
【专利摘要】本发明涉及一种从珍珠蛋白中酶解分离珍珠活性多肽的方法，该方法包括以下的步骤：1）在将珍珠蛋白溶液中加入5～20倍pH值6.5～7.5的磷酸盐缓冲液，匀质；2）将匀质后混合液的进入100～120℃，0.15～0.2MPa环境下预处理20～60分钟处理；3）将混合液置于反应锅中，加入体系质量0.5%～2%的中性蛋白酶，在40～70℃温度中进行酶催化反应4～8小时，反应结束后在沸水浴灭酶5～15min，离心，去上清液，即为珍珠活性多肽。本发明将珍珠粉中功效成分进行分离，且在不破坏珍珠粉成分活性的基础下，进行珍珠粉重要成分的分离提取，珍珠粉中蛋白的获得，并纯化后酶解，更为有效发挥珍珠粉美白的作用。
【IPC分类】C12P21/06, A61K8/98, A61Q19/02
【公开号】CN104911239
【申请号】CN201410097031
【发明人】杨安全, 王菁, 张丽华, 骆建芬, 谢敏
【申请人】浙江欧诗漫生物股份有限公司
【公开日】2015年9月16日
【申请日】2014年3月14日