斑籽素的制备方法及其在抗白血病药物中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明公开了一种植物提取物的制备方法及应用，特别涉及斑籽素的制备方法及 其在抗白血病药物中的应用。
[0002]
【背景技术】
[0003] 斑籽素（Baliospermin)，分子式为C32H5tlO8，分子量为562. 74,结构式为
斑好素来源于大戟科（Euphorbiaceae)山斑轩Baliospermummontanum(Wilid.)Muell. -Arg.的根。斑籽素具有抗癌作用。对P388淋巴细胞白血病体内0. 2mg/kg时, T/C为131。体外试验对P388的ED50为0. 6yg/mL。
[0004] 白血病是一类造血干细胞恶性克隆性疾病。克隆性白血病细胞因为增殖失控、分 化障碍、凋亡受阻等机制在骨髓和其他造血组织中大量增殖累积，并浸润其他组织和器官， 同时正常造血受抑制。临床可见不同程度的贫血、出血、感染发热以及肝、脾、淋巴结肿大和 骨骼疼痛。据报道，我国各地区白血病的发病率在各种肿瘤中占第六位。
【发明内容】
[0005] 为满足临床需要，扩大用药品种，更好地治疗癌症，提供一种斑籽素的制备方法及 其在抗白血病药物中的应用。
[0006] 为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案： 斑籽素的制备方法，其特征在于包括以下步骤： 1) 取山斑籽根粉碎，采用4~10倍量20~40%乙醇回流提取1~4次，每次0. 5~1. 5h，过 滤，合并提取液，浓缩至无醇，得浓缩液； 2) 将上述浓缩液加入至聚酰胺树脂柱中吸附，用4~8BV的酸醇洗脱，收集洗脱液，回收 溶剂至干，得斑籽素粗提物； 3 )将上述斑籽素粗提物采用高速逆流色谱仪分离，收集洗脱液，浓缩，低温干燥得斑籽 素。
[0007] 所述步骤2)中的聚酰胺树脂粒度为80~120目，用量与药材量的体积重量比为1 : 1_3 〇
[0008] 所述步骤2)中的酸醇是含1%乙酸的30~50%乙醇溶液。
[0009] 所述步骤3)中的高速逆流色谱仪的参数设定为：转速750~1050r/min，流动相的 流速 2~10ml/min〇
[0010] 所述制备的斑籽素，在制备抗白血病药物中的应用，尤其在制备防治淋巴性白血 病和髓细胞白血病的应用。
[0011] 所述制备的斑籽素，在其口服配方中添加肠吸收促进剂，包含中链脂肪酸盐、胆酸 盐、鹅去氧胆酸盐、壳聚糖及其衍生物中的一种或几种。
[0012] 采用本法制备斑籽素，工艺简便易操作，制备量大，产品得率高，而且低污染；添加 肠吸收促进剂，有利于提高生物利用度。
[0013] 下面将结合【具体实施方式】进一步说明本发明，但本发明要求保护的范围并不局限 于下列实施方式。
【具体实施方式】
[0014] 实施例1: 斑籽素的制备 取山斑籽根lkg，粉碎，加入4L40%乙醇回流提取4次，每次I. 5h，固液分离得提取液， 浓缩至无醇味，取350g80目的聚酰胺树脂，装柱，浓缩液上柱，用8BV的含1%乙酸的30%乙 醇洗脱，洗脱液回收溶剂，得斑籽素粗提物；取正丁醇、乙酸、水按3:1:4体积比置于分液漏 斗中混匀，静置分层，分离上下相，取上相为固定相，下相为流动相，将斑籽素粗提物用下相 溶解，开启制备型高速逆流色谱仪，以2ml/min流速泵入流动相，并通过进样阀连续进样， 控制转速为750r/min，收集流出液，浓缩，低温干燥得斑籽素，检测含量99. 3%。
[0015] 实施例2: 斑籽素的制备 取山斑籽根5kg，粉碎，加入10L20%乙醇回流提取0. 5h，固液分离得提取液，浓缩至无 醇味，取5kgl20目的聚酰胺树脂，装柱，浓缩液上柱，用4BV的含1%乙酸的50%乙醇洗脱， 洗脱液回收溶剂，得斑籽素粗提物；取正丁醇、乙酸、水按7:3:10体积比置于分液漏斗中混 匀，静置分层，分离上下相，取上相为固定相，下相为流动相，将斑籽素粗提物用下相溶解， 开启制备型高速逆流色谱仪，以3. 5ml/min流速泵入流动相，并通过进样阀连续进样，控制 转速为1050r/min，收集流出液，浓缩，低温干燥得斑籽素，检测含量99. 1%。
[0016] 实施例3: 斑籽素的制备 取山斑籽根l〇kg，粉碎，加入80L30%乙醇回流提取2次，每次lh，固液分离得提取液， 浓缩至无醇味，取6kg80目的聚酰胺树脂，装柱，浓缩液上柱，用6BV的含1%乙酸的45%乙 醇洗脱，洗脱液回收溶剂，得斑籽素粗提物；取正丁醇、乙酸、水按6:2:7体积比置于分液漏 斗中混匀，静置分层，分离上下相，取上相为固定相，下相为流动相，将斑籽素粗提物用下相 溶解，开启制备型高速逆流色谱仪，以lOml/min流速泵入流动相，并通过进样阀连续进样， 控制转速为900r/min，收集流出液，浓缩，低温干燥得斑籽素，检测含量98. 5%。
[0017] 实施例4: 斑籽素的其在抗白血病药物中的应用 1、材料 动物：昆明种小鼠，雌雄各半性，体重20±2g，由南京中医药大学提供。
[0018] 细胞株：P388 (白血病）细胞株，由中国科学院上海药物研宄所提供。
[0019] 2、方法 在含有10%胎牛血清的RPMI1640培养基中，将被试细胞调成密度为2XIO4细胞/ml。 将上述细胞株悬液接种于96孔培养板，每孔50耵，置于饱和湿度、37 °C和5%C02培养箱中培 养24小时。分别加入溶剂对照0. 1%二甲基亚砜、阳性对照顺铂（DDP)以及不同浓度单体 化合物的二甲亚砜溶液各50沿，每组设3个复孔。培养72小时，于培养结束前4小时，各培 养孔加入5mg/ml四唑翁盐（MTT) 10耵，置于饱和湿度、37°C和5%C02培养箱中培养4小时， 每孔中加入150耵二甲亚砜，振荡溶解生成MTT晶体甲臜，用酶标仪测570nm0.D值，细胞存 活率由样品0.D值对于对照品0.D值的比值计算。其中，斑籽素对P388细胞的半数抑制浓 度（IC5tl)有剂量效应曲线得到。
[0020] 3、结果 实现结果(见表1)本发明斑籽素对P388细胞的生长有明显的抑制作用，其对P388细 胞的生长抑制活性强于阳性对照顺铂（DDP)，说明斑籽素具有极佳的抗白血病的活性，在制 备抗白血病药物中有良好的应用前景。
【主权项】
1. 斑籽素的制备方法，其特征在于包括以下步骤： 1) 取山斑籽根粉碎，采用4~10倍量20~40%乙醇回流提取1~4次，每次0. 5~1. 5h，过 滤，合并提取液，浓缩至无醇，得浓缩液； 2) 将上述浓缩液加入至聚酰胺树脂柱中吸附，用4~8BV的酸醇洗脱，收集洗脱液，回收 溶剂至干，得斑籽素粗提物； 3 )将上述斑籽素粗提物采用高速逆流色谱仪分离，收集洗脱液，浓缩，低温干燥得斑籽 素。2. 根据权利要求1所述的斑籽素的制备方法，其特征在于所述步骤2)中的聚酰胺树脂 粒度为80~120目，用量与药材量的体积重量比为1 :1-3。3. 根据权利要求1所述的斑籽素的制备方法，其特征在于所述步骤2)中的酸醇是含 1%乙酸的30~50%乙醇溶液。4. 根据权利要求1所述的斑籽素的制备方法，其特征在于所述步骤3)中的高速逆流色 谱仪的参数设定为：转速750~1050r/min，流动相的流速2~10ml/min。5. 根据权利要求1~4所述方法制备的斑籽素，在制备抗白血病药物中的应用。6. 根据权利要求5所述在制备抗白血病药物中的应用，其特征在于在制备防治淋巴性 白血病和髓细胞白血病的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种植物提取物的制备方法及应用，尤其涉及斑籽素的制备方法及其在抗白血病药物中的应用。制备方法包括以下步骤：取山斑籽根粉碎，采用低浓度醇回流提取，提取液浓缩至无醇，上聚酰胺树脂柱吸附，酸醇洗脱，洗脱液回收溶剂，再采用高速逆流色谱法纯化，收集流出液，浓缩，低温干燥得高纯度的斑籽素。采用本发明制备方法，工艺操作简便、得率高，污染小，适合高纯度斑籽素的生产。斑籽素具有抗肿瘤作用，药理实验表明斑籽素在抗肿瘤方面有很好的效果，尤其是对人淋巴细胞白血病<u/>(P388)效果更佳，可用于制备抗白血病药物。
【IPC分类】C07D303/17, C07D301/32, A61K31/336, A61P35/02
【公开号】CN104926758
【申请号】CN201510262704
【发明人】刘东锋, 杨成东
【申请人】南京泽朗医药科技有限公司
【公开日】2015年9月23日
【申请日】2015年5月22日