[0066]样品处理:取转化液25yL，加入475 yL甲醇充分混匀，1000rpm离心5min，0.45 μ m滤头过滤，取滤液转入进样瓶待测。
[0067]色谱条件:色谱柱为Diamonsil_C18 (250_X4.6mm, 5 μ m);流动相:Β 甲醇:A0.1 %醋酸溶液为68:32 ;流速为0.6mL/min，柱温25°C ;检测波长为320nm ;进样量5 μ L。
【主权项】
1.一种阿魏酸生产工程菌株，其特征在于，所述阿魏酸生产工程菌株同时表达香兰醇氧化酶、松柏醇脱氢酶、松柏醛脱氢酶和木糖还原酶，其中，香兰醇氧化酶基因、松柏醇脱氢酶基因、松柏醛脱氢酶基因和木糖还原酶基因上游分别整合T7启动子，在工程菌株中通过T7RNA聚合酶启动转录。2.一种权利要求1所述的阿魏酸生产工程菌株的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括以下步骤: (1)、用NdeI和Bam HI分别双酶切合成的香兰醇氧化酶基因(vaoA，1683bp)、松柏醇脱氢酶基因(calA，768bp)、松柏醛脱氢酶基因(calB，1446bp)和木糖还原酶基因(xyl, 957bp)，克隆至用Nde I和Bam HI酶切过的pET24a载体上，得重组载体pET24a_vaoA，pET24a_calA、pET24a_calB 和 pET24a_xyl ； (2)、将重组载体pET24a_vaoA用BamHI和Eco RI酶切，回收作为载体，pET24a_calA用Bgl II和Eco RI酶切，回收大小为900bp片段，与上述载体连接、转化，得重组载体pET24a-vaoA-calA ； (3)、将重组载体pET24a-vaoA-calA用BamHI和Eco RI酶切，回收作为载体，pET24a-calB用Bgl II和Eco RI酶切，回收大小为1.6kb片段，与上述载体连接、转化，得重组载体 pET24a-vaoA-calA_calB ； (4)、将重组载体pET24a-xyl用BamHI和HindIII酶切，回收作为载体，PET24a-vaoA-calA-calB用Bgl II和HindIII酶切，回收大小为4.1kb片段，与上述载体连接、转化，得重组载体 pET24a-xyl-vaoA-calA_calB (pET24a_XVAB)； (5)、将重组载体pET24a-XVAB转入BL21(DE3)，得预期工程菌。3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，步骤(I)进一步包括以下步骤:用Nde I和Bam HI双酶切合成的香兰醇氧化酶基因(vaoA, 1683bp)DNA片段；用Nde I和Bam HI 双酶切载体 pET24a (+)，酶切体系:DNA 43 μ L，buffer R 5 μ L，Bam HI I μ L，Nde II μ L，37°C保温3小时；酶切的DNA片段胶回收，用T4连接酶连接vaoA和载体DNA片段，连接体系如下:vaoA 7.5yL，pET24a 载体 1.5yL，buffer I μ L，T4 连接酶 I μ L，保温 16°C过夜，连接产物采用热激法转化至大肠杆菌宿主菌DH5a中，涂布到含有I %蛋白胨，0.5%酵母膏，1%氯化钠及1.5%琼脂粉及卡那霉素的LB固体培养基上； LB平板在37°C培养至生长出转化子，挑取单菌落，用LB液体培养基37°C培养过夜，12000rpm离心I分钟，提取质粒，提取方法按照试剂盒说明书操作； 用Nde I和Bam HI双酶切重组载体，酶切体系:DNA 43 μ L，bufferR 5 μ L，Bam HII μ L，Nde I 1“1^，37°〇保温3小时，电泳确定含有目的^(^基因的0嫩片段。4.根据权利要求2或3所述的构建方法，其特征在于，步骤(2)进一步包括以下步骤:将重组载体 pET24a-vaoA 用 Bam HI 和 Eco RI 酶切，酶切体系:DNA 43 μ L，buffer R 5 μ L，Bam HI I μ L，Eco RI I μ L，37°C保温3小时，DNA片段回收作为载体；pET24a-calA 用 Bgl II 和 Eco RI 酶切，酶切体系:DNA 43 μ L，buffer R 5 μ L，Bgl III yL, Eco RI I yL，37°C保温3小时，回收大小为900bp片段。5.根据权利要求2-4任一项所述的构建方法，其特征在于，步骤(3)进一步包括如下步骤:将重组载体 pET24a-vaoA_calA 用 Bam HI 和 Eco RI 酶切，酶切体系:DNA 43 μ L, bufferR 5 μ L，Bam HI I μ L，Eco RI I μ L，37°C保温3小时，回收作为载体； pET24a-calB 用 Bgl II 和 Eco RI 酶切，酶切体系:DNA 43 μ L，buffer R 5 μ L，Bgl III μ L, Eco RI 14 1^，37°〇保温3小时，回收大小为1.6吐片段。6.根据权利要求2-5任一项所述的构建方法，其特征在于，步骤(4)进一步包括如下步骤:将重组载体pET24a-xyl用Bam HI和HindIII酶切，酶切体系:DNA 43 μ L,buffer R5 μ L, Bam HI I μ L, HindIII I μ L，37°C保温 3 小时，回收作为载体； pET24a-vaoA-calA-calB 用 Bgl II 和 HindIII 酶切，酶切体系:DNA43 μ L，buffer R5 μ L，Bgl II I μ L，HindIII I μ L，37°C保温 3 小时，回收大小为 4.1kb 片段。7.根据权利要求2-6任一项所述的构建方法，其特征在于，步骤(5)进一步包括如下步骤:采用热激法将重组载体转化至大肠杆菌宿主菌BL21(DE3)中，涂布到含有1%蛋白胨，0.5%酵母膏，I %氯化钠，1.5%琼脂粉及卡那霉素的LB固体培养基上，LB平板在37°C培养至生长出转化子，挑取单菌落，获得预期工程菌。8.—种权利要求1所述的阿魏酸生产工程菌株的生物转化方法，其特征在于，所述生物转化方法包括以下步骤: (1)、重组菌株的发酵； (2)、催化丁香酚生成阿魏酸。9.根据权利要求8所述的阿魏酸生产工程菌株的生物转化方法，其特征在于，步骤(I)进一步包括以下步骤:配种子液lOOmL，种子液含有蛋白胨1%，酵母提取物0.5%，氯化钠I %，余量为纯净水，装在250mL三角瓶中灭菌后，接种平板培养基上的单菌落，摇床转数为200rpm ;37°C培养16小时后，接种入含有200mL发酵液的500mL三角瓶中，发酵液含有蛋白胨1.2 %，酵母提取物2.4%，甘油0.4%，磷酸二氢钾0.23%，磷酸氢二钾1.25%，余量为纯净水；发酵培养条件:按发酵体积1%量接种，37°C培养，摇床转数为200rpm，接种后1.5小时后，降温至25?28°C，加入终浓度0.6mM IPTG，培养8小时。10.根据权利要求8或9所述的阿魏酸生产工程菌株的生物转化方法，其特征在于，步骤⑵进一步包括以下步骤:发酵培养结束后，4000rpm 4°C低温离心收集菌体，用10mL磷酸缓冲液悬浮菌体，转入250mL转化瓶中，加入0.06mL 丁香酸和ImL 0.lg/mL木糖，转化条件为25°C反应，摇床转数为200rpm，每小时分批添加0.06mL的丁香酸底物和ImL 0.lg/mL木糖；8-10小时后，通过高效液相色谱(HPLC)检测阿魏酸产量以及丁香酚是否转化完全。
【专利摘要】本发明公开了一种阿魏酸生产工程菌株、构建方法及生物转化方法，提供的工程菌株整合了新的酶耦联系统，利用强启动子使香兰醇氧化酶基因、松柏醇脱氢酶基因和松柏醛脱氢酶基因在大肠杆菌中共表达，再经过酶促反应催化丁香酚生成阿魏酸。该系统同时耦联木糖还原酶，在生产过程中还原木糖，同时再生氧化型辅酶烟酰胺腺嘌呤二核苷酸和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸，维持阿魏酸生物转化系统的辅酶平衡，从而提高产物阿魏酸的转化率和产量。与目前现有技术相比，本发明对医药中间产物阿魏酸的安全生物转化提供了有效、简单的实施方法，转化率达到95％以上，终产物阿魏酸浓度达到11g/L，具有较高的产业化价值。
【IPC分类】C12R1/19, C12N1/21, C12N15/70, C12P7/42
【公开号】CN104928224
【申请号】CN201510234157
【发明人】林凌, 金朝晖, 赵树楠, 陈琼, 曹正宇, 宋平, 朱国萍
【申请人】安徽师范大学
【公开日】2015年9月23日
【申请日】2015年5月8日