用于设计它们的方法对于本领域技术人员是 已知的。本发明人已经发现选自 SEQ ID N0:l(5' -TTCTTAGCGTATTGGAGTCC-3' )、SEQ ID N0:2C -AATGTACAGTATTGCGTTTTG-3^ )或二者组合的引物在第二次扩增反应中提供非 常好的结果。
[0022] 本发明还提供了用于PCR扩增靶核苷酸的引物试剂盒，所述试剂盒包括选自下列 各项组成的组的引物：SEQ ID NO :1、SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO : 5,SEQ ID NO ：6,SEQ ID NO ：7,SEQ ID NO ：8,SEQ ID NO ：9,SEQ ID NO ： 10,SEQ ID NO ：1U SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO : 18、SEQ ID NO : 19、SEQ ID NO :20、SEQ ID NO :21、SEQ ID NO :22、SEQ ID NO ：23, SEQ ID NO ：24, SEQ ID NO ：25, SEQ ID NO ：26, SEQ ID NO ：27, SEQ ID NO ：28, SEQ ID NO ：29, SEQ ID NO ：30, SEQ ID NO ：3U SEQ ID NO ：32, SEQ ID NO ：33, SEQ ID NO ：34, SEQ ID NO ：35, SEQ ID N0：36,SEQ ID N0：37,SEQ ID N0：38,SEQ ID N0：39,SEQ ID NO： 40,SEQ ID NO：4U SEQ ID NO：42,SEQ ID NO ：43,SEQ ID NO：44,SEQ ID NO：45,SEQ ID NO ：46, SEQ ID NO -Al, SEQ ID NO ：48, SEQ ID NO ：49, SEQ ID NO ：50, SEQ ID NO ：5U SEQ ID NO ：52, SEQ ID NO ：53, SEQ ID NO ：54, SEQ ID NO ：55, SEQ ID NO ：56, SEQ ID NO ：57, SEQ ID NO ：58, SEQ ID N0：59,SEQ ID N0：60,SEQ ID N0：6USEQ ID N0：62,SEQ ID NO： 63、SEQ ID NO :64、SEQ ID NO :65、SEQ ID NO :66、SEQ ID NO :67、SEQ ID NO :68、SEQ ID NO：69,SEQ ID NO：70,SEQ ID NO ：7U SEQ ID NO：72,SEQ ID NO ：73,SEQ ID NO ：74,SEQ ID NO ：75, SEQ ID NO ：76, SEQ ID NO ：77, SEQ ID NO ：78, SEQ ID NO ：79, SEQ ID NO ：80, SEQ ID N0：8USEQ ID N0：82,SEQ ID N0：83,SEQ ID NO ： 84, SEQ ID N0：85,SEQ ID NO： 86, SEQ ID NO ：87, SEQ ID NO ：88, SEQ ID NO ：89, SEQ ID NO ：90, SEQ ID NO ：9U SEQ ID NO :92和它们的组合。
[0023] 用于该方法的自动化操作的方法的一个实例可以这样提供，其中使用在密闭系统 中的"芯片实验室（lab-on-chip)"装置来进行扩增、分离和检测。例如，第一次靶标特异性 的扩增可以在第一反应体系（PCRl)中进行，其中嵌套的、未标记的高浓度靶标特异性引物 可以与dNTP、缓冲液和酶一起预先加入，以进行所需的PCR或RT-PCR扩增。在允许第一次 扩增进行所需的循环次数后，未使用的引物可以利用毛细管电泳而与核苷酸扩增子分离， 其借助于PCRl (负极）和废液室（正极）之间的活化电极使引物与扩增子分离。在引物移 动至废液室时，废液室中的电极可以关闭并且第二反应体系（PCR2)带正电。因此较大分子 量的扩增子可以移动至PCR2室，在此它们与预先加入的共用引物和新鲜的酶、dNTP和缓冲 液混合。在PCR2中进行第二次扩增后，PCR产物（扩增子）可以经电泳移动至检测室，与 共价固定在珠子上的探针杂交，所述珠子在阵列中的位置代表特定的分子靶标。因此靶标 检测可以通过成像分析来进行，例如，其中阳性结果可以由发光的珠子来指示，因为扩增子 产物可以用荧光染料或其他化学/生物化学标记物来标记。然后未使用的PCR产物和引物 可以被去除和沉积在废液室中。
[0024] 在一些实施方案中，PCR芯片可以包括与废液槽和第二反应体系两者流体连接的 第一反应体系，所述废液槽和第二反应体系各另外地包括至少一个电极，所述电极包括用 于分离由所述第一反应体系产生的扩增子的装置。所述第二反应体系可以与杂交和检测室 流体连接，所述杂交和检测室包括微球体，或珠子，所述珠子被配置成使得珠子的物理位置 是借助于芯片分析的样品中特定靶多核苷酸的存在的指示。
[0025] 芯片可以预先加入试剂，或试剂可以由用户加入。在一个实施方案中，预先加入的 试剂可以包括用于第一反应体系的嵌套的、高浓度的靶标特异性引物、dNTP、聚合酶和一种 或多种缓冲液。第二反应体系可以与共用引物、dNTP、缓冲液和聚合酶一起预先加入。使 用该芯片，例如，患者样品可以通过将该样品通过覆盖芯片的全部或一部分的软橡胶样聚 二甲基硅氧烷（PDMS)材料注射而加入至至少一个第一反应体系中。在第一反应体系中，对 于第一次扩增可以进行第一系列的PCR循环以扩增靶序列并且将共用引物结合序列引入 至所生成的扩增子的至少一部分中。然后来自第一反应体系的扩增子产物可以通过在微流 体通道中进行的芯片上电泳来分离，所述第一反应体系与至少一个第二反应体系和至少一 个废液槽流体连接，每个第二反应体系和废液槽另外包括至少一个电极，所述电极促进来 自第一扩增反应的扩增子和未使用的引物分别移动至第二反应体系和废液槽。移动至第二 PCR反应体系的扩增子然后可以使用共用引物进行第二次扩增以扩增在第一反应体系中的 第一次扩增期间已经向其中引入了至少一个共用引物结合位点的扩增子。在第二反应体系 中完成所需的扩增循环后，PCR产物（扩增子）可以通过微流体电泳从第二反应体系移动 至至少一个杂交和检测室，第二反应体系与至少一个杂交和检测室流体连接。在所述杂交 和检测室内，可以存在微球体或珠子，其形成阵列，所述珠子的物理位置指示用于检测的特 定靶标。珠子阵列可以包含约1-约200个靶标，每个靶标由约1-约100个珠子代表。如 果特定的靶标不由第一次扩增反应中适当的引物代表，则可以使用软件掩膜（mask)来覆 盖相关的珠子使得它们将不会干扰分析。杂交和检测室可以与至少一个洗涤室和至少一 个检测室流体连接，所述洗涤室包含辅助去除未使用的标记的引物和探针以减少本底的试 剂，且所述检测室包含用于标记扩增的DNA以进行成像分析的试剂诸如链霉亲和素-量子 点（streptavidine-Quantum dots)，或链霉亲和素-PE0
[0026] 本发明的方法还可以使用标准的或改良的PCR热循环仪来进行。例如，核苷酸、缓 冲液和引物可以加入至用于第一次扩增的第一台热循环仪的标准PCR试管中。所述管的 内容物可以通过手工或自动装置去除从而拯救扩增子，并且刚分离的扩增子可以放置在第 二个扩增管中，其中引入了缓冲液、核苷酸和一种或多种酶，从而在第一台或第二台热循环 仪中进行第二次扩增，所述热循环仪被编程从而通过适当的温度使反应循环所需的时间长 度。应该理解循环时间和循环次数可以发生变化，并且可以由本领域技术人员来确定。
[0027] 嵌套引物的使用似乎改善聚合酶的结合亲和力，在第一次扩增反应期间产生显著 较多的扩增子。这些扩增子可以使用高浓度靶标特异性引物，由样品内多种靶多核苷酸产 生。通过在第一次扩增期间将用于至少一个共用引物的至少一个结合位点引入至所述扩增 子的至少一部分中，则有可能在第二次扩增期间甚至更显著地增加由该扩增过程所产生的 扩增子的数目。针对其在第二次扩增期间的结合亲和力和引发扩增的能力来选择共用引 物。通过使用此三步法（第一扩增步骤，扩增子拯救，第二扩增步骤），因此可能增加用于从 含有多种生物体的样品中鉴定一种或多种靶生物体的PCR方法的特异性和灵敏度。本发明 人已经发现此方法与先前所述的PCR方法相比，的确显著地增加特异性和灵敏度两者。
[0028] 使扩增-分离-扩增过程自动化能够在1-3小时的时间内鉴定大量的靶标，并且 已经显示有效地在1. 5小时的时间内扩增来自多种微生物的靶核酸，使得能够快速地鉴定 疾病的可能病原体，从而能够立即针对用于限制与传染性病原体、生物恐怖剂（bioterror agent)等接触的处理、分离、公众卫生计划的实施采取措施。
[0029] 为进行PCR反应，样品可以通过本领域技术人员已知的多种方式进行制备。例如， 这些方法可以作为由包含缓冲液和酶的PCR试剂盒提供的使用说明来提供，或使用说明可 以获自各种期刊或专利出版物。在用于PCR扩增步骤的制备前处理样品的方法对于本领域 技术人员来说也是已知的，并且可以根据样品的来源而发生变化。
[0030] 用于扩增的酶是商购的，并且可以包括，例如，Qiagen Multiplex mix或Qiagen Hot Start mix。缓冲液也是商购的，核苷酸（dNTPs)和其他试剂也如此。热循环仪由多个 公司制造并分销，这些公司包括，例如，Applied Biosystems (应用生物系统）和Bio-Rad。 PCR试剂盒也可以获自多种来源，包括，例如，Qiagen(盖瑟斯堡（Gaithersburg)，马里兰）。
[0031] 本发明提供了一种方法，该方法适合于例如，从可能含有多种微生物的样品中鉴 定一种微生物或多种微生物。这样的样品可以获自临床标本（例