用于扩增多个靶标的扩增子拯救多重聚合酶链式反应的制作方法
【专利说明】用于扩增多个靶标的扩增子拯救多重聚合酶链式反应
[0001] 本申请是国际申请号PCT/US2009/039552,国际申请日2009年4月3日，中国申 请号200980118968. 1，发明名称为"用于扩增多个靶标的扩增子拯救多重聚合酶链式反应" 的分案申请。
[0002] 相关申请的夺叉引用
[0003] 本申请要求于2008年4月3日申请的美国临时专利申请号61/042, 259的优先权 权益。 发明领域
[0004] 本发明总体上涉及用于扩增核酸的方法。更具体地，本发明涉及用于使用聚合酶 链式反应来扩增多种核酸序列的方法。
[0005] 发明背景
[0006] 聚合酶链式反应（PCR)的开发使得能够使用DNA扩增用于多种应用，包括分子诊 断测试。然而存在许多与PCR用于分子鉴别诊断（MDD)测定的应用相关的挑战。PCR利用 特异性的引物或引物组、温度条件和酶。PCR反应可能容易被污染，引物结合对于不同的引 物可能需要不同的条件，引物应该对于靶序列特异以便仅扩增该靶序列，等等。这使得其更 难以从单个样品中扩增多种序列。
[0007] 过去，诊断测试临床样品以发现一种或多种疾病病原体需要分离和培养微生物。 然而，这可能需要几天，并且在许多情况下，如果要挽救患者的生命，诊断必须在几小时内 作出。分析单个临床样品以鉴定多种生物体从而确定哪一种或哪几种可能是疾病的（多 种）病原体是期望用于MMD的方法，并且已经开发了许多方法来较好地实现该目标。例如， 已经开发了多重PCR法以扩增样品内的多种核酸以便产生足够的DNA/RNA从而能够检测和 鉴定多种生物体。然而，多重PCR具有一些缺点。例如，多重PCR反应中的每种靶标需要其 自己的最佳反应条件，因此增加靶标的数目需要每种单个靶标的反应条件不是最佳条件。 此外，体系中的多组高浓度引物经常产生引物二聚体或获得非特异性的本底扩增。这种特 异性的缺乏也需要PCR后提纯和多次杂交后洗涤的额外步骤。密集的引物由于需要利用酶 和消耗底物而降低扩增效率。扩增效率的差异可能导致扩增子产量的显著差异。例如，一 些基因座可能非常有效地扩增，而另一些则扩增的效率很低或根本不能扩增。这种不均一 扩增的可能性也使得难以至不可能准确地进行终点定量分析。
[0008] -种方法利用以非常低的浓度使用的嵌套式基因特异性引物以在初始PCR循环 期间富集靶标。之后，使用共用引物来扩增所有靶标。整个反应在一个试管中进行，不需要 额外轮次的PCR，并且不需要专门的仪器，但代替地，可以使用常规的热循环仪来进行。然 而，此方法有缺点。例如，因为使用低浓度的引物在初始循环期间富集靶标，因此测定的灵 敏度最终降低，初始的富集循环的每次循环需要较长的退火时间，并且在经过扩增靶标所 需的循环次数后酶很有可能变得不太有效。
[0009] 对于更灵敏的、更快速的和更有效的用于扩增来自多种靶标的DNA和/或RNA以 促进那些靶标的快速鉴定的方法仍然存在着需求。
[0010] 发明概沐
[0011] 本发明涉及用于扩增核酸从而能够检测那些核酸的方法，该方法包括以下步骤： 在第一次扩增反应中使用高浓度、靶标特异性引物扩增一种或多种靶核酸，从而产生至少 一种含有至少一个共用引物结合位点的核酸扩增子；拯救所述至少一种核酸扩增子；以及 在第二次扩增反应中使用与所述至少一个共用引物结合位点结合的共用引物扩增所述至 少一种核酸扩增子。本发明的一个方面利用嵌套式靶标特异性引物。靶核酸可以包括DNA 和/或RNA，并且可以包括病毒、细菌和/或真菌来源的DNA和/或RNA，以及人或其他动物 来源的基因组DNA和/或RNA。扩增可以通过聚合酶链式反应（PCR)和/或RT-PCR进行。 靶核酸的来源可以是来自一份或多份临床、环境、或食品样品，并且该方法可以以广泛多样 的方式使用，包括，例如，临床诊断、环境采样、植物检测、食品安全性分析、检测遗传病症、 和/或检测疾病状况。该方法可以用于人和/或兽的医学诊断。
[0012] 附图简要说明
[0013] 图1是本发明的方法的图示，其中F。代表正向-外侧引物；Fi代表带有正向共用 引物标签（结合序列）的正向-内侧引物；Cf代表正向共用引物；R i代表带有反向共用引 物标签（结合序列）的反向-内侧引物；R。代表反向-外侧引物；Q代表反向共用引物；Fa代表附加正向引物；和Ra代表附加反向引物，这些引物通常如所指示的那样定位。
[0014] 连述
[0015] 本发明人已经开发了一种用于扩增核酸的新方法，该方法可以用来检测来自病 毒、细菌、真菌、植物和/或动物细胞的核酸的存在，和存在的相对量，从而用于医学、环境、 食品、和其他样品的评价以鉴定那些样品内的微生物和其他因子（agent)。该方法在本文中 称为扩增子拯救多重聚合酶链式反应（"arm-PCR")。在此方法中，靶核酸的PCR扩增相 继地在两个不同的反应体系中进行。这些体系可以包括独立的柱、反应容器或芯片的部分， 例如，含有一种或多种靶核酸、引物、酶、核苷酸（例如，dNTP)和缓冲液，它们是扩增所述一 种或多种靶核酸以产生扩增子所必需的。通过在第一次扩增反应中使用高浓度的引物并且 拯救在该反应期间形成的扩增子以用于在不同的反应体系中的第二次扩增反应中，本发明 人已经开发了一种增加灵敏度和特异性，减少产生可检测结果所必需的时间，并且容易使 其适于自动化操作的方法。
[0016] 要理解的是，如本文所使用的术语"包括"可以用术语"基本上由......组成"和 "由......组成"代替。当使用术语"反应体系"时，其意在描述向其中置入了必需的引物、 酶、核苷酸、缓冲液和/或其他试剂以便进行至少一种聚合酶链式反应的一个或多个循环 的Eppendorf管、反应室或其他容纳装置。因此不同的"反应体系"可以指相同的反应容纳 容器，但不同的用于进行所需的扩增步骤的试剂组分（尤其是引物）。"反应容纳容器"意 在指具有充足的内部容积以容纳提供反应体系所必需的引物、酶、核苷酸、缓冲液和/或其 他试剂的试管、板孔或其他容器。术语"拯救"意在指将扩增子与第一次扩增的至少一部分 引物分离。"PCR"意在指聚合酶链式反应，并且可以包括PCR和/或RT-PCR步骤。
[0017] 在该方法的第一个步骤中，使用高浓度的靶标特异性的嵌套引物来进行靶标特异 性的第一次扩增步骤。引物选自病毒、细菌、真菌和/或期望使用核酸检测进行鉴定的其他 靶标的已知序列，并且对于那些靶核酸和/或密切相关的靶核酸是特异的。靶标特异性引 物可以用来扩增，例如，细菌、病毒、真菌和/或其他来源的一种或多种（和优选多种）靶核 酸。嵌套引物浓度通常可以为5-50pmol。如图1中所示，选择的引物用附加的核苷酸进行 "标记"以提供对一种或多种靶核酸不特异的附加序列，使得用此引物对靶核酸的扩增也会 在所生成的扩增子中加入共用引物的结合位点，该共用引物与靶标特异性引物不同，其可 以用来进一步扩增不相关的靶核酸扩增子（见图1中的A和B)。扩增进行大致10-15个循 环，反应终止，并且从反应混合物中拯救生成的扩增子用于第二个不依赖靶标的扩增步骤 中，包括由共用引物引发的聚合酶链式反应，该反应将以相对无差别的方式提供不相关核 苷酸序列的扩增，所述不相关核苷酸序列由从靶标特异性反应中拯救的多种扩增子代表。
[0018] 然后进行扩增子拯救以尽量减少或清除第一次反应的引物，同时提供用于使用共 用引物的第二次扩增中的扩增子。扩增子拯救可以以多种方式进行。例如，可以取来自完成 的第一次扩增反应的小样品以提供用于第二次扩增的扩增子。当取得小样品时，其提供足 够数目的用于第二次扩增的扩增子，同时显著地减少（例如，稀释）剩余数目的第一次扩增 的引物。扩增子拯救也可以通过如下步骤来进行：去除第一次扩增的反应体系的大部分内 容物并且向剩余的内容物中加入一种或多种共用引物和必需的一种或多种酶、核苷酸、一 种或多种缓冲液和/或其他试剂以进行第二次扩增，所述第二次扩增利用所述一种或多种 共用引物在第二反应体系中扩增拯救的扩增子。分离技术也可以用来拯救扩增子。这些技 术可以依靠引物和扩增子之间的尺寸差异，依靠已经连接在扩增子、引物或两者上的标签， 或本领域技术人员已知的其他方法。一旦被分离，所有拯救的扩增子或一部分拯救的扩增 子可以用于第二次扩增中。
[0019] 第二次扩增在不同的反应体系中进行，其可以利用或可以不利用相同的反应容纳 容器。第二次扩增使用新鲜的缓冲液、核苷酸和一种或多种共用引物扩增拯救的扩增子。选 择共用引物以提供对拯救的扩增子的有效扩增从而在第二次扩增结束时提供大量拷贝数 的那些扩增子。
[0020] 通过将反应分成第一次靶标特异性的引物驱动的扩增和第二次不依赖靶标的共 用引物驱动的扩增，本发明人已经开发了一种方法，该方法通过使用靶标特异性引物仅扩 增存在于特定靶标中的核酸种类和数目来提供特异性，和通过使用嵌套引物、高浓度靶标 特异性引物实现灵敏度，并且使用一种或多种共用引物以提供较高拷贝数的非特异性（不 依赖靶标的）扩增。此外，在第一次扩增中使用高浓度引物，紧接着进行扩增子拯救，尤其 是当通过分离一部分第一次扩增产物进行扩增拯救时，所述分离通过去除该部分并将其置 于新的反应体系中或通过去除大部分的第一次扩增产物并向其加入必需的试剂以形成用 于第二次不依赖靶标的扩增的第二反应体系而进行，这使其适于自动化操作。不仅这些步 骤可以在相对密闭的反应体系（该体系限制了污染的可能性）内进行，而且由该方法提供 的第一次扩增、扩增子拯救和第二次扩增的组合产生了在少于2小时的时间内的特异性 的、灵敏的用于来自多个样品的多种靶标的检测方法。
[0021] 靶核酸可以通过本领域技术人员已知的多种方式分离自其各自来源。由该方法产 生的扩增子的检测也可以通过本领域技术人员公知的多种方式来进行，诸如将来自第二扩 增步骤的扩增子应用至用于杂交和检测的印刷阵列。共用引物序列可以包括将有效地提供 扩增反应的有效启动的任何序列。这些序列和