一种l-色氨酸的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及L-色氨酸的制备方法，尤其是快速制备L-色氨酸的方法。
【背景技术】
[0002]L-色氨酸即β -吲哚基丙氨酸，为白色或微黄色结晶或结晶性粉末，是八种必须氨基酸之一，人和动物只能从食物中摄取。L-色氨酸作为一种必须氨基酸，除在营养代谢中起重要作用外，目前被广泛应用于医药、食品及饲料等领域。
[0003]色氨酸的生产方法主要包括如下几种:蛋白质水解法，以毛发、血粉等为材料通过水解的方式获得包括色氨酸在内的多种氨基酸，但蛋白质水解法对环境污染大。化学合成法，即以化学合成的手段合成色氨酸，但合成步骤多，收率低且产物为混旋的色氨酸，需要进一步的酶法拆分才能得到L-色氨酸。微生物前体转化法是以葡萄糖等作为碳源培养微生物，同时在培养过程中向培养基中添加各种前体物质，利用微生物体内的色氨酸合成酶系转化这些前体物合成L-色氨酸。由于色氨酸合成酶体系容易受到来自底物和产物的抑制作用，所以该方法需解除底物、产物对色氨酸合成途径中相关酶的反馈抑制才能得到高浓度的色氨酸。发酵法生产L-色氨酸，以廉价的葡萄糖、蜜饯等物质为原料，通过微生物菌种发酵生产L-色氨酸。目前报道的发酵生产L-色氨酸在发酵液中产物积累不高，一般色氨酸含量低于50g/L，后续的产物分离困难较大。酶促转化生产L-色氨酸，即利用基因工程菌中L-色氨酸生物合成酶系的催化功能将吲哚、L-丝氨酸等酶促转化为L-色氨酸。该方法最大优点为酶促反应体系中色氨酸积累浓度高，高达100-120g/L，因此为目前工业上生产色氨酸的主要方法。
[0004]酶促转化生产L-色氨酸后的产物分离与纯化一直是人们比较关注的问题。杨文革等在《酶法合成中色氨酸的分离》、武彩莲等在《发酵液中L-色氨酸分离纯化工艺研宄》、司晶星在《色氨酸工厂发酵与分离工艺过程控制》、韦平和等在《膜技术在酶法生产L-色氨酸中去除蛋白质和色素的应用研宄》等文献资料中报道了色氨酸的分离与纯化。综合目前有关酶促转化制备色氨酸报道，其工艺流程大致如下图1所示，其产物分离与纯化过程中有关菌体的分离发生在酶促转化之后与离子柱分离之前的工艺段。虽然有关研宄利用膜分离酶促反应液中菌体在实验室阶段取得了较好的效果，但是在氨基酸工业化生产中还有一定的距离，而且由于酶促转化生产L-色氨酸之后的混合液体积大、粘度高给后续的膜分离带来了很大的困难。
【发明内容】
[0005]本发明要解决的问题是提供一种L-色氨酸的制备方法。
[0006]本发明一种L-色氨酸的制备方法，其特征在于包含有以下步骤:a.细胞破碎工艺段:将发酵所得菌28-35kg重悬于去离子水中，总体积为400L，向其中加入CTAB破细胞，CTAB加入量为总体积浓度0.05-0.2% ；b.分离细胞碎片并对分离液浓缩工艺段:向破细胞后混合液体积中加入1000-1500L去离子水，并向其中加入分离辅助物后进行分离，真空抽滤，得到分离液1200-1700L ;将分离液在35-40°C真空浓缩至体积为400L ；c.酶促转化工艺段:将上述破细胞混合物泵入转化罐中，加入去离子水至总体积为600L，转化罐中含丝氨酸 0.5-lmol/L，吲哚 0.5-lmol/L，PLP 0.2-0.4mmol/L，pH 值为 6.0-9.0，搅拌100-150rpm，温度35-40°C，时间为35_50h，达到酶促反应平衡；d.柱分离工艺段:向酶促反应平衡液中加入去离子水1000-1200L并上活化后的001X7型阳离子柱，上样完毕后用2mol/L的氨水洗脱，得到含L-色氨酸分离液500-1200L ；e.结晶工艺段:将含L-色氨酸的洗脱液在50-60°C减压浓缩结晶得到L-色氨酸。
[0007]本发明公开了 L-色氨酸的制备方法，其特征在于所述的步骤b.分离细胞碎片并对分离液浓缩工艺段中，所述的分离辅助物为:聚丙烯酰胺、聚合氯化铝、废旧717阴离子树脂其中的一种物质或任意两种混合物或三种物质混合物。
[0008]本发明公开了一种L-色氨酸的制备方法，其特征在于所述的步骤b.分离细胞碎片并对分离液浓缩工艺段中，所述的分离辅助物为:聚丙烯酰胺和废旧717阴离子树脂的混合物。
[0009]本发明公开了一种L-色氨酸的制备方法，其特征在于所述的步骤b.分离细胞碎片并对分离液浓缩工艺段中，所述的分离辅助物为聚丙烯酰胺和废旧717阴离子树脂的混合物的用量为:按反应总体积加入0.01-2ppm的聚丙烯酰胺与2% -5%的废旧717阴离子树脂。
[0010]本发明公开了一种L-色氨酸的制备方法，其特征在于所述的步骤b.分离细胞碎片并对分离液浓缩工艺段中，所述的分离辅助物为:聚合氯化铝和废旧717阴离子树脂的混合物。
[0011]本发明公开了一种L-色氨酸的制备方法，其特征在于所述的步骤b.分离细胞碎片并对分离液浓缩工艺段中，所述的分离辅助物为聚合氯化铝和废旧717阴离子树脂的混合物的用量为:按反应总体积加入0.01-2ppm的聚合氯化铝与2% -5%的废旧717阴离子树脂。
[0012]本发明公开了一种L-色氨酸的制备方法，其特征在于所述的步骤b.分离细胞碎片并对分离液浓缩工艺段中，所述的分离辅助物为:废旧717阴离子树脂。
[0013]本发明公开了一种L-色氨酸的制备方法，其特征在于所述的步骤b.分离细胞碎片并对分离液浓缩工艺段中，所述的分离辅助物为废旧717阴离子树脂的用量为:按反应总体积加入2% -5%的废旧717阴离子树脂。
[0014]本发明公开了一种L-色氨酸的制备方法，其特征在于所述的步骤b.分离细胞碎片并对分离液浓缩工艺段中，所述的分离辅助物为废旧717阴离子树脂的用量为:按反应总体积加入5% -10%的废旧717阴离子树脂。
[0015]目前L-色氨酸的制备方法工艺为:
[0016]细胞破碎工艺段:将发酵所得菌28_35kg重悬于去离子水中，总体积为400L，向其中加入CTAB至终浓度为0.05-0.2%破细胞。
[0017]酶促转化工艺段:将上述破细胞混合物泵入转化罐中，600L的体系中含丝氨酸0.5-lmol/L,吲哚 0.5-lmol/L, PLP 0.2-0.4mmol/L，pH:6.0-9.0，搅拌 100_150rpm，温度35-40 °C，达到酶促反应平衡。
[0018]离心分离酶促反应混合液中细胞碎片工艺段:向酶促转化平衡后的混合液加2000-2500L去离子水并用离心机分离，转速8000rpm。
[0019]柱分离工艺段:离心液调上活化后的001 X 7阳离子柱，上样完毕后用2mol/L的氨水洗脱，得到含L-色氨酸洗脱液2500-3000L。
[0020]结晶工艺段:将含L-色氨酸的洗脱液在50_60°C减压浓缩结晶，得到色氨酸。
[0021]本发明一种L-色氨酸的制备方法为:
[0022]细胞破碎工艺段:与以前工艺一致。
[0023]分离细胞碎片并对分离液浓缩工艺段:此工艺段为新增工艺段。向破细胞后混合液中(体积为400L)加入1000-1500L去离子水，并向其中加入分离辅助物后进行真空抽滤，得到分离液1200-1700L。将分离液在35-40°C真空浓缩至体积为400L。
[0024]酶促转化工艺段:与前面一致。
[0025]离心分离酶促反应混合液中细胞碎片工艺段:由于在酶促反应前已经对细胞碎片进行了分离，在新工艺中该工艺段已经删除。
[0026]柱分离工艺段:向酶促反应平衡液中加入去离子水1000-1200L并上活化后的001X7阳离子柱，上样完毕后用2mol/L的氨水洗脱，得到含L-色氨酸分离液500-1200L。
[0027]结晶工艺段:将含色氨酸的洗脱液在50_60°C减压浓缩结晶得到L-色氨酸。
[0028]本发明一种L-色氨酸的制备方法中，对酶促转化制备L-色氨酸工艺做了适当的改进，具体包括两方面:一方面将附图1中酶促反应平衡液中的细胞碎片分离的工艺提前至破细胞之后，即在酶促转化前先进行细胞碎片的分离，具体见附图2 ;另一方面，利用废旧的717阴离子树脂作为助滤材料，改善分离体系，有利于破细胞后的细胞碎片与粗酶液的分离。示意附图1与附图2中虚线框所示为新旧工艺流程的主要区别之处，其他工艺流程一致。
[0029]改进后工艺改降低了后续L-色氨酸分离的难度和分离周期。利用新工艺生产L-色氨酸与传统通过调节酶促反应平衡液pH达到细胞碎片与反应混合液自然分离工艺整个反应时间从原来的70多小时变为45小时，可节约时间24h左右，而且减少了由于分离细胞碎片导致的氨基酸的损失，产量从每批次的50公斤变为57公斤，大约增加7kg，同时利用废旧的树脂节约了膜分离的膜成本，每年膜使用成本从30多万元降低至15万左右。
【附图说明】
[0030]附图1是酶促转化制备L-色氨酸传统工艺流程示意图；